1、第九章第九章 临床病原体检测临床病原体检测 提提 纲纲第一节：标本的采集运送、实验室评价和检查方法第一节：标本的采集运送、实验室评价和检查方法第二节：病原体耐药性检测第二节：病原体耐药性检测第三节：临床感染常见病原体检测第三节：临床感染常见病原体检测第四节：病毒性肝炎检测第四节：病毒性肝炎检测第五节：性传播疾病病原体检测第五节：性传播疾病病原体检测第六节：医院感染常见病原体检测第六节：医院感染常见病原体检测教学目的与要求：教学目的与要求：了解掌握临床病原体检查的主要内容（标本采集、标本验收、药敏检查、耐药性检测、临床常见病原体、病毒性肝炎、性传播疾病、医院感染）、检测原理以及临床实际应用的重要
2、意义。重点与难点重点与难点标本采集的原则及各种检查方法的适用范围及其优缺点药物敏感的常用试验方法及其特点耐药菌检测试验各种类型临床常见病原体的检查甲、乙、丙型肝炎的检测方法各种性传播疾病病原体的检测方法、筛选试验、确诊试验及金标准院内感染定义提提 纲纲第一节：标本的采集运送、实验室评价和检查方法第一节：标本的采集运送、实验室评价和检查方法第二节：病原体耐药性检测第二节：病原体耐药性检测第三节：临床感染常见病原体检测第三节：临床感染常见病原体检测第四节：病毒性肝炎检测第四节：病毒性肝炎检测第五节：性传播疾病病原体检测第五节：性传播疾病病原体检测第六节：医院感染常见病原体检测第六节：医院感染常见病
3、原体检测临床细菌学检验的特殊性临床细菌学检验的特殊性依赖于细菌生长依赖于细菌生长l采集时间采集时间 （发烧？）（发烧？）l运送方式运送方式 （密闭与否，保温与否？）（密闭与否，保温与否？）l感染的细菌种类及生长特征感染的细菌种类及生长特征 （苛养菌）（苛养菌）l病人是否使用抗生素病人是否使用抗生素 （抗生素的影响）（抗生素的影响）l其他：消毒剂，白细胞吞噬等其他：消毒剂，白细胞吞噬等容易受环境中的细菌污染容易受环境中的细菌污染l采集方法采集方法 （无菌操作，避免污染）（无菌操作，避免污染）l放置时间放置时间 （及时运送，避免细菌死亡）（及时运送，避免细菌死亡）基本原则基本原则1：正确的标本类型
4、和采集部位以反映有效病程：正确的标本类型和采集部位以反映有效病程2：采集和运送应无菌操作，避免污染：采集和运送应无菌操作，避免污染3：尽快送检：尽快送检4：视所有标本为传染品，高度污染标本要有明显标识：视所有标本为传染品，高度污染标本要有明显标识5：注意生物安全，标本用后要做消毒处理：注意生物安全，标本用后要做消毒处理一、标本采集和运送一、标本采集和运送（一）血液标本的采集（一）血液标本的采集适应症：疑似菌血症、败血症或适应症：疑似菌血症、败血症或脓毒血症的病人脓毒血症的病人酒精棉球消毒，防止污染。静脉酒精棉球消毒，防止污染。静脉采血后，将血液注入培养瓶内采血后，将血液注入培养瓶内。采集时间：
5、一般在抗生素使用前，采集时间：一般在抗生素使用前，于发热初期或高峰期采血。于发热初期或高峰期采血。采集频率：采集频率：24小时内采血小时内采血23次可提高阳性率，且在不同部位。次可提高阳性率，且在不同部位。采血量：血液与培养基的比例为采血量：血液与培养基的比例为1：5-10，一般成人血量，一般成人血量510ml，婴儿，婴儿1-5ml。（二）尿液标本的采集（二）尿液标本的采集首次晨尿，无菌采集中段尿首次晨尿，无菌采集中段尿10-20ml。排尿困难者考虑导尿采集标本。排尿困难者考虑导尿采集标本。如考虑厌氧菌感染，采取膀胱如考虑厌氧菌感染，采取膀胱穿刺法采集标本穿刺法采集标本。（三）粪便标本采集（三
6、）粪便标本采集自然排便者：挑取脓、血或粘液部分于清自然排便者：挑取脓、血或粘液部分于清洁容器中送检。洁容器中送检。排便困难者：采用直肠拭子采集。排便困难者：采用直肠拭子采集。怀疑霍乱弧菌感染引起的腹泻，立即接种怀疑霍乱弧菌感染引起的腹泻，立即接种或将标本置于碱性蛋白胨水或卡或将标本置于碱性蛋白胨水或卡-布运送布运送培养液送检。培养液送检。传染性腹泻应连续送检传染性腹泻应连续送检3次。次。（四）呼吸道标本采集（四）呼吸道标本采集类型：鼻咽拭、痰和经气类型：鼻咽拭、痰和经气管采集的标本。管采集的标本。采集时间：晨痰，且在取采集时间：晨痰，且在取痰前用清水反复漱口。痰前用清水反复漱口。方法：（方法：
7、（1）自然咳痰法：）自然咳痰法：（2）气管镜下采集法；）气管镜下采集法；（3）气管穿刺法。）气管穿刺法。WBC 25/lp,上皮上皮10/lp。上呼吸道存在正常菌群，上呼吸道存在正常菌群，在采集标本与结果分析时在采集标本与结果分析时应予考虑。应予考虑。（五）脑脊液与其它无菌体液采集（五）脑脊液与其它无菌体液采集临床医生采用腰椎穿刺，抽取临床医生采用腰椎穿刺，抽取2-3ml，置，置于无菌容器中立即送检，不得保存于冰箱于无菌容器中立即送检，不得保存于冰箱中。中。脑膜炎的主要病原体：脑膜炎奈瑟菌、肺脑膜炎的主要病原体：脑膜炎奈瑟菌、肺炎链球菌、流感嗜血杆菌。炎链球菌、流感嗜血杆菌。（六）眼、耳标本采
8、集（六）眼、耳标本采集（七）泌尿生殖道标本采集（七）泌尿生殖道标本采集性传播性疾病取尿道口分泌物、外阴糜烂性传播性疾病取尿道口分泌物、外阴糜烂面病灶边缘分泌物、阴道宫颈口分泌物和面病灶边缘分泌物、阴道宫颈口分泌物和前列腺液等。前列腺液等。生殖道疱疹常穿刺抽取疱疹液。生殖道疱疹常穿刺抽取疱疹液。盆腔脓肿患者则于直肠子宫凹陷处穿刺取盆腔脓肿患者则于直肠子宫凹陷处穿刺取脓液。脓液。所有标本收集后于所有标本收集后于4保存直至培养保存直至培养 （八）创伤、组织和脓肿标本（八）创伤、组织和脓肿标本损伤范畴较大的创伤，从不同部位采集多损伤范畴较大的创伤，从不同部位采集多份标本份标本.清除污物，以碘酒、酒精消
9、毒皮清除污物，以碘酒、酒精消毒皮肤肤.开放性脓肿：无菌棉拭子采集脓液及病灶开放性脓肿：无菌棉拭子采集脓液及病灶深部分泌物。深部分泌物。封闭性脓肿：无菌干燥注射器抽取。封闭性脓肿：无菌干燥注射器抽取。疑为厌氧菌感染，取脓液后立即排净注射疑为厌氧菌感染，取脓液后立即排净注射器内空气，针头插入无菌橡皮塞送检。器内空气，针头插入无菌橡皮塞送检。标本送检标本送检标本要求尽快送检，否则影响阳性率。标本要求尽快送检，否则影响阳性率。烈性传染病标本需专人护送。烈性传染病标本需专人护送。二、标本的实验室质量评估标准二、标本的实验室质量评估标准 1标本必须注明姓名、年龄、性别、采集日期、临床诊断、检验项目等基本信
10、自。2仔细核对标本采集日期和送检日期。延误的标本，一般情况下不接收。通常用于细菌学检验的标本的存放不要超过24h。而病毒检测的标本可于4存放23天。3检查送检容器是否完整，有无破损或渗漏等情况，若有则不予接收。4标本储存、运送方式不当，不予接收。5明显被污染的标本不予接收。6标本量明显不足的标本，不予接收。7同一天申请做同一实验的重复送检标本(血培养除外)，不予接收。8对于烈性传染病标本的采集和运送应严格执行相关规定，要有完善的防护措施，按规定包裹及冷藏，附有详细的采样及送检纪录，由专人护送。标本是否合格，以保证检测结果的准确性！标本是否合格，以保证检测结果的准确性！三、检查方法三、检查方法（
11、一）直接显微镜检查（一）直接显微镜检查（二）病原体特异性抗原检查（二）病原体特异性抗原检查（三）病原体核酸检查（三）病原体核酸检查（四）病原体的分离培养和鉴定（四）病原体的分离培养和鉴定（五）血清学试验（五）血清学试验（一）直接显微镜检查（一）直接显微镜检查不染色标本不染色标本不染色标本：不染色标本：适用于检查适用于检查生活状态下病原体的动力生活状态下病原体的动力及运动状况及运动状况。方法：方法：压滴法、悬滴法压滴法、悬滴法。意义：在不染色状态下借意义：在不染色状态下借助暗视野显微镜或相差显助暗视野显微镜或相差显微镜观察病原菌的动力、微镜观察病原菌的动力、活动方式。部分病原体可活动方式。部分病
12、原体可借此初步诊断，如梅毒螺借此初步诊断，如梅毒螺旋体。旋体。（一）直接显微镜检查（一）直接显微镜检查染色标本染色标本染色标本目的：了解细菌的形态、染色性或观察宿主细胞内包涵体。方法：革兰染色、墨汁染色、抗酸染色、荧光染色革兰染色革兰染色阳性球菌（阳性球菌（GS）真菌孢子真菌孢子革兰染色革兰染色墨汁染色墨汁染色荚膜抗吞噬30%-50%的患者伴有免疫功能低下等疾病，8%左右的AIDS患者伴有隐球菌性脑膜炎，预后极差。中枢神经系统存活与脑脊液中缺乏抗体和补体激活系统有关抗真菌治疗:两性霉素B,氟康唑宽厚荚膜宽厚荚膜荧光染色荧光染色SARS（severe acute respiratory synd
13、rome）病原体的确定。病原体的确定。直接显微镜检查直接显微镜检查电镜检查电镜检查电子显微镜发现为电子显微镜发现为某种冠状病毒某种冠状病毒1.无菌体液的直接镜检对病原体诊断具有一定意义。2.对正常菌群寄居腔道的分泌物图片镜检可提示进一步检查的步骤、采取的方法和确定分离鉴定病原体所需的培养基。3.由于临床标本中常含有一定的抗菌物质，以致分离培养可为阴性，此时的镜检往往可能在诊断是起作用。4.荧光显微镜用于标本经荧光染色后直接检出某些病原微生物5.电镜检查不常规用于临床，对某些病毒感染却有确诊的价值。(二)病原体特异性抗原检查 利用抗原抗体之间的特异性反应，用已知抗体检测患者血清及其他体液中的待测
14、抗原，借助免疫荧光技术、酶联免疫技术、化学发光技术、胶乳凝集试验、对流免疫电泳等技术检测标本中未知的病原体抗原，其诊断价值常以标本不同而各异。标本中如果存在多种正常寄居微生物，可因交叉抗原存在而不能肯定诊断。检测细菌不同的抗原构造，还可分析细菌的菌群和血清型，如沙门菌属、志贺菌属和霍乱菌属等O1群霍乱弧菌的血清分型型别别名O抗原成份原型稻叶型A、C异型小川型A、B中间型彦岛型A、B、C细菌的血清分型：细菌的血清分型：O1群霍乱弧菌的菌体抗原由群霍乱弧菌的菌体抗原由A、B、C三个抗原三个抗原成份组成成份组成利用抗原抗体之间的特异性反应，用已知抗体检测患者血清及其他体液中的待测抗原检测细菌不同的抗
15、原构造，检测细菌不同的抗原构造，还可分析细菌的菌群和血清型，还可分析细菌的菌群和血清型，如沙门菌属、志贺菌属和霍乱菌属如沙门菌属、志贺菌属和霍乱菌属（三）病原体核酸的检测（三）病原体核酸的检测常用试验方法有：常用试验方法有：1.PCR。polymerase chain reaction聚合酶聚合酶链式反应，简称链式反应，简称PCR技术。技术。2.核酸探针杂交技术核酸探针杂交技术3.Realtime PCR4.基因芯片等基因芯片等PCR技术简史DNA的复制核酸体外扩增的设想聚合酶链反应的发明1985年，美国PE-Cetus公司的Mullis等人发明了聚合酶链反应（PCR）基本原理是在试管中模拟细
16、胞内的DNA复制最初采用E-coli DNA聚合酶进行PCR，由于该酶不耐热，使这一过程耗时，费力，且易出错耐热DNA聚合酶的应用使得PCR能高效率的进行，随后PE-Cetus公司推出了第一台PCR自动化热循环仪1993年，Mullis等因此项技术获诺贝尔化学奖PCR的基本原理PCR反应条件PCR过程PCR的特点标准的标准的PCRPCR反应体系反应体系4种dNTP混合物 各200umol/L引物 各10100pmol模板DNA 0.12ugTaq DNA聚合酶 2.5uMg2+1.5mmol/L1234522557294时间（min）温度（）PCR的基本原理PCR反应条件PCR过程PCR的特点
17、适温延伸3高温变性1低温退火2重复13步2530轮目的DNA片段扩增100万倍以上DNA双螺旋DNA单链与引物复性DNA变性形成2条单链子链延伸DNA加倍PCR的基本原理PCR反应条件PCR过程PCR的特点1234522557294时间（min）温度（）适温延伸3高温变性1低温退火2重复13步2530轮目的DNA片段扩增100万倍以上DNA双螺旋DNA单链与引物复性子链延伸DNA加倍DNA变性形成2条单链模板DNA95PCR的基本原理PCR反应条件PCR过程PCR的特点9550引物1引物2DNA引物PCR的基本原理PCR反应条件PCR过程PCR的特点50引物1引物2DNA引物72Taq酶Taq
18、酶PCR的基本原理PCR反应条件PCR过程PCR的特点72第1轮结束95第2轮开始PCR的基本原理PCR反应条件PCR过程PCR的特点955072TaqTaqTaqTaqPCR的基本原理PCR反应条件PCR过程PCR的特点72第2轮结束PCR的基本原理PCR反应条件PCR过程PCR的特点模板DNA第1轮扩增第2轮扩增第3轮扩增第4轮扩增第5轮扩增第6轮扩增PCR扩增产物电泳扩增产物电泳PCR的基本原理PCR反应条件PCR过程PCR的特点灵敏度高1.皮克(pg=10-12)量级扩增到微克(ug=10-6)水平2.能从100万个细胞中检出一个靶细胞3.病毒检测的灵敏度可达3个RFU4.细菌检测的最
19、小检出率为3个细菌简便、快速1.一次性加好反应液，24 小时完成扩增2.扩增产物一般用电泳分析对标本的纯度要求低u血液、体腔液、洗嗽液、毛发、细胞、活组织等组织的粗提DNA皮克(pg=10-12)量级扩增到微克(ug=10-6)水平能从100万个细胞中检出一个靶细胞病毒检测的灵敏度可达3个RFU细菌检测的最小检出率为3个细菌PCR的类型和应用 研究基因克隆，DNA测序，分析突变 诊断细菌、病毒、寄生虫检测，诊断 人类基因组工程遗传图谱的构建，DNA测序，表达图谱 法医犯罪现场标本分析 肿瘤各种肿瘤检测 其他（三）病原体核酸的检测（三）病原体核酸的检测PCRPCR：一种体外基因扩：一种体外基因扩
20、增技术，对目的基因组增技术，对目的基因组DNA的信号进行放大。的信号进行放大。（三）病原体核酸的检测（三）病原体核酸的检测Realtime PCR实时荧光定量实时荧光定量PCR：通过：通过起始点定量和荧光检测系起始点定量和荧光检测系统实时监测统实时监测累积荧光强度累积荧光强度而而实现核酸定量实现核酸定量的一种技的一种技术。术。广泛应用于结核和麻风分广泛应用于结核和麻风分枝杆菌、乙型肝炎病毒、枝杆菌、乙型肝炎病毒、丙型和戊型肝炎病毒、丙型和戊型肝炎病毒、HIV、巨细胞病毒的检查、巨细胞病毒的检查（三）病原体核酸的检测（三）病原体核酸的检测Realtime PCR将大量核酸片段将大量核酸片段(寡核
21、苷酸、寡核苷酸、PNA、cDNA、基因、基因组组DNA)以预先设计的方式固定在载玻片、尼龙膜以预先设计的方式固定在载玻片、尼龙膜和纤维素膜等载体上组成密集分子阵列，与荧光素和纤维素膜等载体上组成密集分子阵列，与荧光素或其他方式标记的样品进行杂交，通过检测杂交信或其他方式标记的样品进行杂交，通过检测杂交信号的强弱进而判断样品中靶分子的有无和数量。该号的强弱进而判断样品中靶分子的有无和数量。该技术具有高通量、自动化程度高、快速、样品用量技术具有高通量、自动化程度高、快速、样品用量少、灵敏度高、特异性强、污染少等特点。病原微少、灵敏度高、特异性强、污染少等特点。病原微生物的生物的16S rDNA及及
22、23S rDNA序列近几年被作序列近几年被作为一个较理想的基因分类靶序列，其在进化压力下为一个较理想的基因分类靶序列，其在进化压力下保持了高度的保守性，同时又具有一定的变异性，保持了高度的保守性，同时又具有一定的变异性，基因芯片技术通常利用病原微生物的这一分子生物基因芯片技术通常利用病原微生物的这一分子生物学特性，实现多样本多病原微生物的同时检测。学特性，实现多样本多病原微生物的同时检测。（三）病原体核酸的检测（三）病原体核酸的检测基因芯片基因芯片意义意义灵敏度高，是检测病原体微生物最灵敏的灵敏度高，是检测病原体微生物最灵敏的方法，但具有一定的假阳性与假阴性。方法，但具有一定的假阳性与假阴性。
23、特异性强，阳性只表明存在某种病原体的特异性强，阳性只表明存在某种病原体的核酸，是否正被感染应结合临床具体分析。核酸，是否正被感染应结合临床具体分析。特别适用于目前尚不能分离培养或很难分特别适用于目前尚不能分离培养或很难分离培养的微生物。离培养的微生物。适用于核酸变异的病原微生物，如病毒适用于核酸变异的病原微生物，如病毒（四）病原体的分离培养和鉴定（四）病原体的分离培养和鉴定明确感染病原体明确感染病原体提供体外抗微生物药提供体外抗微生物药物敏感试验结果物敏感试验结果1.细菌感染性疾病病原体的分离培养分离培养是微生物学检验中确诊的关键步骤分离培养是微生物学检验中确诊的关键步骤 根据临床症状、体征和
24、镜下检查特征做出病原学初根据临床症状、体征和镜下检查特征做出病原学初步诊断，选择最合适的培养方法，主要是选择适当步诊断，选择最合适的培养方法，主要是选择适当的培养基、接种前的标本处理和确定孵育条件，然的培养基、接种前的标本处理和确定孵育条件，然后根据菌落性状后根据菌落性状(大小、色泽、气味、边缘、光滑大小、色泽、气味、边缘、光滑度、色素、溶血情况等度、色素、溶血情况等)和细菌的形态、染色性，和细菌的形态、染色性，检测细菌生化反应结果和血清学实验、动物接种实检测细菌生化反应结果和血清学实验、动物接种实验验(白喉杆菌白喉杆菌)，对分离菌作出鉴定，也可借助于微，对分离菌作出鉴定，也可借助于微量鉴定系
25、统快速简便鉴定分离菌量鉴定系统快速简便鉴定分离菌（四）病原体的分离培养和鉴定（四）病原体的分离培养和鉴定细菌分离培养与鉴定的结果评价：细菌分离培养与鉴定的结果评价：正常人群的无菌体液中检测到细菌，应考虑细菌为感染的病原体。正常人群的无菌体液中检测到细菌，应考虑细菌为感染的病原体。存在正常菌群的标本检测到细菌，应结合细菌的量考虑是否为致病菌。存在正常菌群的标本检测到细菌，应结合细菌的量考虑是否为致病菌。如临床表现支持感染，但培养阴性，应考虑为标本不合格、培养不恰当等因如临床表现支持感染，但培养阴性，应考虑为标本不合格、培养不恰当等因素。素。直接镜检找到病原体，而培养阴性，应考虑有直接镜检找到病原
26、体，而培养阴性，应考虑有L细菌、厌氧菌或苛氧菌感染。细菌、厌氧菌或苛氧菌感染。2.不能人工培养的病原体感染性疾病将标本接种易感动物、鸡胚或行细胞培养将标本接种易感动物、鸡胚或行细胞培养（四）病原体的分离培养和鉴定（四）病原体的分离培养和鉴定病毒分离培养与鉴定的结果评价：从组织、血液以及脑脊液中分离到病毒可明确诊断。从呼吸道、肠道等分离到病毒，如该病毒人体不能长期携带，有诊断价值，如麻疹病毒、流感病毒等。反之需相应的临床表现，才有病原学意义，如巨细胞病毒，肠道病毒等。阴性不能排除病毒感染。必须结合流行病学资料、临床表现、标本来源及病毒种类加以分析。（五）血清学试验（五）血清学试验 用已知病原体的
27、抗原检测患者血清中相应抗体以诊断感染性疾病。人体感染病原体后经过一定时间产生特异性抗体，在体内可维持数月或更长时间。双份血清检查：病程早期和晚期分别采血清2-3份检查，双份血清的滴度呈4倍或4倍以上升高，考虑病原体感染单份血清检查：特异性 IgM可作为感染性疾病的早期诊断指标，且可区分原发与复发感染。方法有：凝集试验、沉淀试验、补体结合试验、间接免疫荧光、放射免疫、酶联免疫吸附试验。适用范围血清学诊断可用于现症诊断，还可以用于疾病追溯调查。血清学诊断对于某些病原体不能培养或难以培养的疾病，可以提供诊断的依据，抗原结构O抗原抗原：化学成分为脂多糖；耐：化学成分为脂多糖；耐热；是沙门菌分群依据；相
28、应热；是沙门菌分群依据；相应抗体为抗体为IgM抗体；与相应抗体结抗体；与相应抗体结合出现颗粒状凝集；。合出现颗粒状凝集；。H抗原抗原：化学成分为蛋白质；不耐：化学成分为蛋白质；不耐热；有双相鞭毛；沙门菌分型依据；热；有双相鞭毛；沙门菌分型依据；与相应抗体结合出现絮状凝集；相与相应抗体结合出现絮状凝集；相应抗体为应抗体为IgG抗体。抗体。Vi抗原：不耐热；抗原：不耐热；能阻止能阻止O抗原与相抗原与相应抗体结合应抗体结合血清学诊断肥达反应原理原理：用已知伤寒沙门菌：用已知伤寒沙门菌O、H抗原和甲、抗原和甲、乙、丙型副伤寒沙门菌乙、丙型副伤寒沙门菌H抗原与病人血清抗原与病人血清作半定量凝集试验，以测
29、定受检血清中有作半定量凝集试验，以测定受检血清中有无相应抗体及其效价。无相应抗体及其效价。意义意义：协助诊断肠热症（伤寒与副伤寒）：协助诊断肠热症（伤寒与副伤寒）几种沙门菌抗原构造组型O抗原H抗原第1相第2相A组甲型副伤寒沙门菌1，2，12a-B组乙型副伤寒沙门菌1，4，5，12b1，2鼠伤寒沙门菌1，4，5，12i1，2C组 丙型副伤寒沙门菌Vi6，7，c1，5猪霍乱沙门菌6，7，c1，5D组伤寒沙门菌Vi9，12，d-肠炎沙门菌1，9，12g.m-肠热症病人血清抗体出现情况100908070605040302010阳性检出率阳性检出率1 2 3 4 5 6 7 8发病周数发病周数肥达反应正
30、常值O凝集效价凝集效价1：80H凝集效价凝集效价1：160副伤寒副伤寒H凝集效价凝集效价1：80 大于正常值具有诊断意义大于正常值具有诊断意义O与H抗体的诊断意义：O、H效价均升高效价均升高：已感染伤寒：已感染伤寒O、H效价均低于正常值效价均低于正常值：未感染沙门菌或免：未感染沙门菌或免疫力低下疫力低下生理盐水生理盐水 待检血清待检血清 诊断抗原诊断抗原伤寒伤寒O伤寒伤寒H甲型副伤寒甲型副伤寒H肖沙门菌肖沙门菌H反应反应6小时小时4545观察结果观察结果1:20 1:40 1:80 1:160 1:320 1:640伤寒伤寒O效价效价 1:320伤寒伤寒H效价效价 1:640甲型副伤寒甲型副伤
31、寒H效价效价 1:20肖沙门菌肖沙门菌H效价效价 1:20诊断意义：感染伤寒沙门菌诊断意义：感染伤寒沙门菌1:40 1:80 1:160 1:320 1:640 1:1280最终稀释最终稀释 倍数倍数伤寒带菌者的检测从标本中分离出病原菌从标本中分离出病原菌血清中检出血清中检出Vi抗体，效价抗体，效价1：10第二节：病原体耐药性检测第二节：病原体耐药性检测1922年他发现了一种叫“溶菌酶”的物质，发表了皮肤组织和分泌物中所发现的奇特细菌的报告。但他自己无法发明一种提纯青霉素的技术，致使此药十几年一直未得以使用。1939年，瓦尔特弗洛和鲍利斯钱恩，重复了弗莱明的工作，证实了他的结果，然后提纯了青霉
32、素 1945年，弗莱明、弗洛里和钱恩共获诺贝尔生理学及医学奖。第二节：病原体耐药性检测第二节：病原体耐药性检测抗菌药物是目前临床使用最为广泛的药物，抗菌药物是目前临床使用最为广泛的药物，它的发现、研制和临床应用是现代医学史它的发现、研制和临床应用是现代医学史上的重要里程碑，使绝大多数微生物感染，上的重要里程碑，使绝大多数微生物感染，尤其是细菌感染成为可治性疾病尤其是细菌感染成为可治性疾病 抗生素压力抗生素压力耐药菌株极少xx耐药菌株为耐药菌株为主主抗生素暴露抗生素暴露xxxxxxxxxx体外抗菌药物敏感试验的目的体外抗菌药物敏感试验的目的临床分离菌株，如不能对抗生素敏感性进临床分离菌株，如不能
33、对抗生素敏感性进行预测，必须常规进行药敏试验。行预测，必须常规进行药敏试验。临床治疗效果差而考虑调整抗菌药物时。临床治疗效果差而考虑调整抗菌药物时。了解细菌耐药的流行病学情况。了解细菌耐药的流行病学情况。评价新抗菌药物的抗菌谱和抗菌活性等。评价新抗菌药物的抗菌谱和抗菌活性等。抗微生物药物敏感试验抗微生物药物敏感试验(antimicrobial susceptibility test,AST)对敏感性不对敏感性不能预测的临床分离株进行药敏试验，以指能预测的临床分离株进行药敏试验，以指导临床选择治疗药物。导临床选择治疗药物。体外抗菌药物敏感试验的方法体外抗菌药物敏感试验的方法 常用的检查细菌是否对
34、药物耐药的方法有定性测常用的检查细菌是否对药物耐药的方法有定性测定的纸片扩散法、定量测定的稀释法和定的纸片扩散法、定量测定的稀释法和E试验法。对试验法。对某些特定耐药菌株的检测除药物敏感试验外还要附某些特定耐药菌株的检测除药物敏感试验外还要附加特殊的酶检测试验、基因检测等方法。加特殊的酶检测试验、基因检测等方法。常用方法有常用方法有:纸片扩散法纸片扩散法（Kirby-Bauer test）稀释法稀释法（dilution test）E试验法（试验法（E test）耐药筛选试验耐药筛选试验折点敏感试验折点敏感试验含有定量抗菌药物的纸片贴在已接种测试菌的琼脂平板上，纸片中所含的药物吸取琼脂中的水分溶
35、解后便不断地向纸片周围区域扩散，形成递减的浓度梯度。在纸片周围抑菌浓度范围内的细菌的生长被抑制，形成透明的抑菌圈。抑菌圈的大小反映测试菌对测定药物的敏感程度。KB纸片琼脂扩散法纸片琼脂扩散法 试验程序按敏感(susceptible，S)、中度敏感(intermediate，I)、耐药(resistant，R)报告。S：测试菌能被测定药物常规剂量给药后在体内达到的血药浓度所抑制或杀灭。I：测试菌能被测定药物大剂量给药后在体内达到的血药浓度所抑制，或在测定药物浓集部位的体液(如尿)中被抑制。R：测试菌不能被在体内感染部位可能达到的抗菌药物浓度所抑制。细菌药敏试验-液体稀释法Minimal inhi
36、bitory concentration(MIC)，最低抑菌浓度：能够抑制检测菌肉眼可见生长的：能够抑制检测菌肉眼可见生长的最低药物浓度称为最低抑菌浓度。最低药物浓度称为最低抑菌浓度。移液管2抗抗药物药物倍稀释倍稀释抗生素移液管1先以水解酪蛋白液体培养基将抗生素作不同浓度稀释，再种入待检菌，置35温箱，培养24h。结果判读：肉眼观察，以不出现肉眼可见生长（混浊现象）的最低药物浓度为该药对测试菌的MIC。抗生素移液管1浑浊浑浊浑浊浑浊浑浊浑浊M I C细菌药敏试验-E-test法1.结合稀释法和扩散法原理和特点而设计的一种操作简便(如同扩散法)、精确测定MIC(如同稀释法)的一种方法。2.在涂布
37、有待测试菌的平板上放置1条内含干化、稳定、浓度由高到低呈指数梯度分布的商品化抗菌药物塑料试条。35孵育1618h。3.抑菌圈和试条横向相交处的读数刻度即是待测菌的MIC，参照CLSI标准判断细菌药敏试验-E-test法青霉素的青霉素的MIC 解释标准S 2R8结论：结论：1.MIC:1.02.该肺炎链球菌对青霉素敏感该肺炎链球菌对青霉素敏感缺点Etest试条价格昂贵，目前尚未广泛使用药敏试验结果的解释（药敏试验结果的解释（1）敏感（敏感（susceptible）：表示测试菌能被）：表示测试菌能被测定药物常规剂量给药后在体内达到的血测定药物常规剂量给药后在体内达到的血药浓度所抑制或杀灭。药浓度所
38、抑制或杀灭。耐药（耐药（resistant）：表示测试菌不能被）：表示测试菌不能被测定药物常规剂量给药后在体内达到的血测定药物常规剂量给药后在体内达到的血药浓度所抑制或杀灭，治疗无效。药浓度所抑制或杀灭，治疗无效。药敏试验结果的解释（药敏试验结果的解释（2）中介中介(intermediate):测试菌能被测定药物大剂测试菌能被测定药物大剂量给药后在体内达到的血量给药后在体内达到的血药浓度所抑制，或在测定药浓度所抑制，或在测定药物浓集部位的体液药物浓集部位的体液(如尿如尿)中被抑制中被抑制该范围作为敏感与耐药之该范围作为敏感与耐药之间的缓冲区，避免由于微间的缓冲区，避免由于微小技术误差影响实验结
39、果。小技术误差影响实验结果。（二）特殊的耐药菌监测的特殊试验（二）特殊的耐药菌监测的特殊试验 由于细菌存在一种或几种耐药机制，造由于细菌存在一种或几种耐药机制，造成了细菌的多重耐药性。单一的药敏试验已成了细菌的多重耐药性。单一的药敏试验已不能完全表示细菌的耐药性，必须进行一些不能完全表示细菌的耐药性，必须进行一些特殊的耐药性监测试验。特殊的耐药性监测试验。1.耐甲氧西林葡萄球菌的筛选测定耐甲氧西林葡萄球菌的筛选测定2.氨基糖苷类抗生素高耐药肠球菌的筛选测定氨基糖苷类抗生素高耐药肠球菌的筛选测定3.耐青霉素肺炎链球菌的筛选测定耐青霉素肺炎链球菌的筛选测定4.-内酰胺酶的检测内酰胺酶的检测5.超广
40、谱超广谱-内酰胺酶的检测内酰胺酶的检测1.耐甲氧西林葡萄球菌的筛选测定（耐甲氧西林葡萄球菌的筛选测定（methecillin resistance staphylococcus，MRS）包括耐甲氧西林金黄色葡萄球菌和耐甲氧西林凝固酶阴性葡萄球菌是目前导致医院感染的重要病原菌。此类葡萄球菌具有多重耐药性，即对全部一内酰胺类抗菌药物，包括青霉素族和头孢菌素族以及临床常用的其他多种抗菌药物均耐药。因此，此类葡萄球菌的早期检出和确定具有重要临床意义 1.耐甲氧西林葡萄球菌的筛选测定（耐甲氧西林葡萄球菌的筛选测定（methecillin resistance staphylococcus，MRS）1g苯
41、唑西林纸片的抑苯唑西林纸片的抑菌圈直径菌圈直径10mm，或或MIC4g/ml的金的金黄色葡萄球菌黄色葡萄球菌,1g苯苯唑西林纸片的抑菌圈直唑西林纸片的抑菌圈直径径17mm，或，或MIC0.5g/ml的的凝固酶阴性葡萄球菌称凝固酶阴性葡萄球菌称耐甲氧西林葡萄球菌耐甲氧西林葡萄球菌。临床意义临床意义对所有对所有-内酰胺类药物均无效，并对氨基内酰胺类药物均无效，并对氨基糖甙类、大环内脂类、克林霉素和四环素糖甙类、大环内脂类、克林霉素和四环素等抗生素多重耐药。等抗生素多重耐药。治疗首选药物为万古霉素。治疗首选药物为万古霉素。2.氨基糖苷类抗生素高耐药肠球菌的筛氨基糖苷类抗生素高耐药肠球菌的筛选测定选测
42、定对多种抗菌药物包括氨基糖苷类呈固有耐药是肠球菌的特点，故单用氨基糖苷类治疗肠球菌感染无效。但如与一种作用于细胞壁的抗菌药物如青霉素类合用，则可发生协同作用而增强杀菌效力。如果肠球菌对氨基糖苷类产生了高耐药性，这种联合应用就会无效。所以及时筛选出肠球菌中氨基糖苷类高耐药株，有助于临床调整和重新确定治疗方案。2.氨基糖苷类抗生素高耐药肠球菌的筛氨基糖苷类抗生素高耐药肠球菌的筛选测定选测定定义定义:对对30g万古霉万古霉素纸片抑菌圈直径素纸片抑菌圈直径19mm，或或MIC32g/ml应应视为耐万古霉素肠球视为耐万古霉素肠球菌（菌（vancomycin resistant enteroccoccus
43、，VRE）。）。临床意义临床意义耐万古霉素肠球菌目前尚无有效的治疗方耐万古霉素肠球菌目前尚无有效的治疗方法，但是对青霉素敏感的法，但是对青霉素敏感的VRE可用青霉素可用青霉素和庆大霉素联合治疗，若对青霉素耐药而和庆大霉素联合治疗，若对青霉素耐药而不是高水平耐氨基糖苷类可用壁霉素和庆不是高水平耐氨基糖苷类可用壁霉素和庆大霉素。另外氯霉素、红霉素、四环素大霉素。另外氯霉素、红霉素、四环素（或多西环素、或米诺环素）及利福平可（或多西环素、或米诺环素）及利福平可用于用于VRE株。株。3.耐青霉素肺炎链球菌的筛选测定耐青霉素肺炎链球菌的筛选测定定义：定义：1g苯唑西林苯唑西林纸片的抑菌圈直径纸片的抑菌圈
44、直径2g/ml应视应视为耐青霉素肺炎链球为耐青霉素肺炎链球菌。菌。临床意义临床意义耐青霉素的肺炎链球菌对氨苄西林、耐青霉素的肺炎链球菌对氨苄西林、氨氨苄西林苄西林/舒巴坦、舒巴坦、头孢克肟、头孢克肟、头孢唑啉头孢唑啉的临床治疗疗效很差，治疗时参考药敏结的临床治疗疗效很差，治疗时参考药敏结果选择药物，经验治疗重症感染时，可用果选择药物，经验治疗重症感染时，可用头孢曲松或头孢噻肟联合万古霉素用药。头孢曲松或头孢噻肟联合万古霉素用药。4.-内酰胺酶的检测内酰胺酶的检测青霉素族和头孢菌素族抗生素的基本结构青霉素族和头孢菌素族抗生素的基本结构一内酰胺环一内酰胺环一内酰胺酶能裂解青霉素族和头孢菌素族抗生素
45、的基本结构一内酰胺环，从而使其丧失抗菌活性。快速检测快速检测-内酰胺酶内酰胺酶 阳性阳性-内酰胺酶检测的意义内酰胺酶检测的意义-内酰胺酶：可水解内酰胺酶：可水解-内酰胺类抗生素。内酰胺类抗生素。临床意义：（临床意义：（1）流感嗜血杆菌、淋病奈瑟菌以）流感嗜血杆菌、淋病奈瑟菌以及卡拉莫拉汉菌等阳性，表示对青霉素、氨卞西及卡拉莫拉汉菌等阳性，表示对青霉素、氨卞西林以及阿莫西林耐药。（林以及阿莫西林耐药。（2）葡萄球菌属以及肠）葡萄球菌属以及肠球菌属等，阳性表示对青霉素、氨基组青霉素、球菌属等，阳性表示对青霉素、氨基组青霉素、羧基组青霉素以及脲基组青霉素耐药羧基组青霉素以及脲基组青霉素耐药5.超广谱
46、超广谱-内酰胺酶内酰胺酶(extend spectum-lactamase,ESBL)的检测的检测超广谱超广谱-内酰胺酶是由质粒介导的基因所编码，可水内酰胺酶是由质粒介导的基因所编码，可水解青霉素类、头孢菌素和氨曲南，主要见于解青霉素类、头孢菌素和氨曲南，主要见于大肠埃希大肠埃希菌、肺炎克雷伯克、产酸雷伯菌及奇异变形杆菌菌、肺炎克雷伯克、产酸雷伯菌及奇异变形杆菌。筛选方法：双纸片扩散法、三相试验和筛选方法：双纸片扩散法、三相试验和E试验试验双纸片协同试验操作简便、结果可靠、成本不高，双纸片协同试验操作简便、结果可靠、成本不高，是临床上较常开展的项目。是临床上较常开展的项目。双纸片扩散法双纸片扩
47、散法药物：头孢他啶30 ug头孢他啶/克拉维酸 30/10 ug以及头孢噻肟30 ug头孢噻肟/克拉维酸30/10 ug结果判读：对两组中任何一个药物，在加克拉维酸后，抑菌圈与不加克拉维酸的相比，增加值 5mm 时，判定为产ESBL（如，头孢他啶的抑菌圈直径16；头孢他啶/克拉维酸的抑菌圈22）。临床意义临床意义产产ESBL细菌细菌,不论体外药物敏感试验结果不论体外药物敏感试验结果如何如何,对青霉素类、对青霉素类、1-3代头孢菌素类和代头孢菌素类和氨曲南治疗均无效，药敏也全部修改成耐氨曲南治疗均无效，药敏也全部修改成耐药。药。提提 纲纲第一节：标本的采集运送、实验室评价和检查方法第一节：标本的
48、采集运送、实验室评价和检查方法第二节：病原体耐药性检测第二节：病原体耐药性检测第三节：临床感染常见病原体检测第三节：临床感染常见病原体检测第四节：病毒性肝炎检测第四节：病毒性肝炎检测第五节：性传播疾病病原体检测第五节：性传播疾病病原体检测第六节：医院感染常见病原体检测第六节：医院感染常见病原体检测临床常见病原体为：细菌、病毒、真菌、临床常见病原体为：细菌、病毒、真菌、寄生虫、支原体、衣原体以及立克次体等。寄生虫、支原体、衣原体以及立克次体等。（一）细菌感染检查项目的选择（一）细菌感染检查项目的选择细菌感染性疾病一般均细菌感染性疾病一般均需进行细菌学诊断以明确病因。需进行细菌学诊断以明确病因。三
49、个方面着手：三个方面着手：检测细菌或其抗原检测细菌或其抗原-主要包括直接涂片显主要包括直接涂片显微镜检查、培养、抗原检测与分析。微镜检查、培养、抗原检测与分析。检测抗体。检测抗体。检测检测细菌遗传物质细菌遗传物质-主要包括基因探针技术和主要包括基因探针技术和PCR技术。技术。难培养或培养要求高的细菌：综合运用免疫学或分子生物难培养或培养要求高的细菌：综合运用免疫学或分子生物学检测，如结核分枝杆菌感染以及幽门螺杆菌感染等。学检测，如结核分枝杆菌感染以及幽门螺杆菌感染等。细菌培养是最重要的确诊方法。细菌培养是最重要的确诊方法。（二）病毒感染检查项目的选择（二）病毒感染检查项目的选择在易感细胞内以复
50、制方式进行增殖的非细在易感细胞内以复制方式进行增殖的非细胞型微生物胞型微生物病毒感染的实验室检查包括病毒感染的实验室检查包括病毒分离与鉴病毒分离与鉴定定、病毒核酸与抗原的直接检出病毒核酸与抗原的直接检出，以及，以及特特异性抗体的检测异性抗体的检测。病毒分离与鉴定：细胞培养。病毒分离与鉴定：细胞培养。早期诊断手段：多检测病毒抗原、特异性早期诊断手段：多检测病毒抗原、特异性抗体或核酸。抗体或核酸。（三）真菌感染检查项目的选择与应用评价（三）真菌感染检查项目的选择与应用评价真菌是以腐生或寄生方式摄取养料的真核细胞型微生物。真菌的微生物学诊断手段主要包括直接检查、培养检查、免疫学试验和动物试验 直接显
