1、疟原虫检验技术疟原虫检验技术血涂片检查疟原虫是诊断和鉴定疟原虫种别血涂片检查疟原虫是诊断和鉴定疟原虫种别的主要方法，也是疟疾流行病学调查的重的主要方法，也是疟疾流行病学调查的重要部分，血涂片制作和染色的好坏足以影要部分，血涂片制作和染色的好坏足以影响检查的结果，必须把握好响检查的结果，必须把握好“三关三关”。玻片清洁。清洁的玻片无油脂，无划痕，玻片清洁。清洁的玻片无油脂，无划痕，无灰尘，玻片上有油迹，使厚血膜容易脱落，无灰尘，玻片上有油迹，使厚血膜容易脱落，薄血膜涂布不均匀。在用手指持玻片时，只薄血膜涂布不均匀。在用手指持玻片时，只能夹持玻片的两侧边缘，不要接触玻片的表能夹持玻片的两侧边缘，不
2、要接触玻片的表面，以避免手指上的油污染玻片。面，以避免手指上的油污染玻片。一、玻片清洁一、玻片清洁 新的载玻片先用热肥皂水洗涤，再用清新的载玻片先用热肥皂水洗涤，再用清水冲洗，然后用软而洁净的毛巾擦干待用。水冲洗，然后用软而洁净的毛巾擦干待用。5%5%的肥皂水煮沸法：的肥皂水煮沸法：将洗衣肥皂削成小片，加水配成约将洗衣肥皂削成小片，加水配成约5%5%的的肥皂水，煮沸后将玻片一张一张地平放进肥肥皂水，煮沸后将玻片一张一张地平放进肥皂水内，微火煮约一刻钟，然后灭火待肥皂皂水内，微火煮约一刻钟，然后灭火待肥皂水稍冷后，将洁干毛巾擦净后待用。水稍冷后，将洁干毛巾擦净后待用。(二二)使用过的载玻片的清洁
3、方法有两种：使用过的载玻片的清洁方法有两种：清洁液浸泡法：清洁液浸泡法：清洁液配制如下：清洁液配制如下：重铬酸钾重铬酸钾 8080g 浓硫酸浓硫酸 100ml100ml 水水(清净水清净水)1000ml)1000ml二、制片二、制片1.1.薄血膜涂制薄血膜涂制2.2.厚血膜涂制厚血膜涂制 薄血膜薄血膜 厚血膜厚血膜 标记处标记处1.1.薄血膜涂制：薄血膜涂制：1.1.薄血膜涂制薄血膜涂制(1)(1)先用先用75%75%酒精棉球将耳垂消毒，待酒精干后用采酒精棉球将耳垂消毒，待酒精干后用采血针迅速刺入耳垂近下端边缘处。血针迅速刺入耳垂近下端边缘处。(2)(2)用左手的拇指与食指以及右手的中指向相对
4、的方用左手的拇指与食指以及右手的中指向相对的方向将耳垂轻轻挤压出血。向将耳垂轻轻挤压出血。(3)(3)取一张洁净的载玻片，将它的左取一张洁净的载玻片，将它的左1/31/3的表面接触的表面接触耳垂上的血滴（不要将玻片接触耳垂上的皮肤），耳垂上的血滴（不要将玻片接触耳垂上的皮肤），使一小滴血在玻片上。血量使一小滴血在玻片上。血量1-1.51-1.5mmmm3 3.1/4.1/4火柴头火柴头大小。大小。薄血膜涂好后，再轻挤耳垂挤出约火柴头大一血薄血膜涂好后，再轻挤耳垂挤出约火柴头大一血滴，将这一滴血滴在玻片的中心滴，将这一滴血滴在玻片的中心1/31/3处然后用推片的处然后用推片的一角由血滴中央向周围
5、旋转涂成直径约一厘米的圆形一角由血滴中央向周围旋转涂成直径约一厘米的圆形血膜，旋转涂制时间不宜过短，以免形成纤维蛋白束，血膜，旋转涂制时间不宜过短，以免形成纤维蛋白束，遮盖了疟原虫。遮盖了疟原虫。厚血薄涂好后，应平放待干，防苍蝇舔食血膜厚血薄涂好后，应平放待干，防苍蝇舔食血膜或灰尘落在上面。受检者的编号可用铅笔或钢笔写在或灰尘落在上面。受检者的编号可用铅笔或钢笔写在薄血膜的边缘上，也可用蜡笔写在厚血膜一端。薄血膜的边缘上，也可用蜡笔写在厚血膜一端。血片制作和染色质量规范 项目血 膜好中差血片制作 厚血量位置直径外观4.05.0mm3玻片右1/381.0cm圆形厚膜均匀，边缘整齐略多或略少稍偏右
6、0.70.8或1.01.2cm圆形稍不均不整齐过多或过少偏右过多0.7或1.2cm厚薄不匀影响着色薄血量位置长宽外观1.52.0 mm3玻片1/21/3处1.52.0cm舌状厚薄均匀略多或略少稍偏右或偏左稍大或稍小舌状稍不匀过多或过少偏右或偏左过多过大或过小厚薄不匀呈波浪型染色外观镜下兰紫色白细胞疟原虫浆呈兰色，核深红深兰色胞浆淡兰或深兰，核红色红色或灰白色胞浆不易见，核淡红或兰色清洁度外观镜下光洁无油灰无沉渣稍有油污稍有沉渣油灰粘连沉渣多或有杂菌 血片制作和染色质量判定标准 1.血片制作质量判定标准：好：厚薄血膜均好，或薄血膜好，厚血膜中。中：薄血膜中，厚血膜好或中。差：薄血膜差，或厚薄血膜
7、均差。2.血片制作和染色合格率要求：分别以血片制作、染色和清洁度的好、中、差合并计算合格率。(1)血片制作合格率应在85%以上。(2)染色合格率应在85%以上。(3)清洁度合格率应在80%以上。三、染色三、染色 常用的染色方法有姬姆萨氏和瑞氏两种常用的染色方法有姬姆萨氏和瑞氏两种(一一)吉氏染色法：吉氏染色法：吉氏染剂是最可靠的血膜染剂，其优点是吉氏染剂是最可靠的血膜染剂，其优点是易于掌握很少染色过度，染好后的血膜褪色较易于掌握很少染色过度，染好后的血膜褪色较慢慢.为了保证染色良好，使疟原虫的红核和兰胞浆分明，为了保证染色良好，使疟原虫的红核和兰胞浆分明，感染的红血球上的薛氏小点清楚，在稀释染
8、剂原液时，感染的红血球上的薛氏小点清楚，在稀释染剂原液时，所用的蒸馏水必须加缓冲液（缓冲蒸馏水）。新鲜蒸馏所用的蒸馏水必须加缓冲液（缓冲蒸馏水）。新鲜蒸馏水可能接近中性，但贮存在一个时期后，由于吸收了空水可能接近中性，但贮存在一个时期后，由于吸收了空气中的二氧化碳而变为酸性，因此蒸馏水中必须加缓冲气中的二氧化碳而变为酸性，因此蒸馏水中必须加缓冲液，使其达到我们需要的酸碱度。液，使其达到我们需要的酸碱度。稀释染剂所用的蒸馏水的稀释染剂所用的蒸馏水的phph以以7.0-7.27.0-7.2为最适宜，现用为最适宜，现用现配，可按下表配制：现配，可按下表配制：缓冲蒸馏水的配制（缓冲蒸馏水的配制（mlm
9、l）ph ph 磷酸二氢钠液磷酸二氢钾液蒸馏水磷酸二氢钠液磷酸二氢钾液蒸馏水 6.66.637376363900900 6.86.849495151900900 7.07.063633737900900 7.27.273732727900900 7.47.481811919900900 在无条件的地方，此时也可用当地的饮用水煮沸过在无条件的地方，此时也可用当地的饮用水煮沸过滤后试染，试染结果如淋巴细胞的胞浆呈兰色红血滤后试染，试染结果如淋巴细胞的胞浆呈兰色红血球染色不很兰就可使用。球染色不很兰就可使用。3.3.染色步骤染色步骤：固定：用吉氏染液染色须先将薄血膜用甲醇或无水酒精固固定：用吉氏染液
10、染色须先将薄血膜用甲醇或无水酒精固定。滴于薄血膜上，也可用玻棒沾取甲醇涂在薄血膜上，定。滴于薄血膜上，也可用玻棒沾取甲醇涂在薄血膜上，避免甲醇流至厚血膜，误将其固定，可用蜡笔划一条线，避免甲醇流至厚血膜，误将其固定，可用蜡笔划一条线，或者是斜放玻片，玻片上的甲醇蒸发干后即可染色。或者是斜放玻片，玻片上的甲醇蒸发干后即可染色。溶解血红蛋白，在厚血膜上加溶解血红蛋白，在厚血膜上加2-32-3滴蒸馏水，待血红蛋白滴蒸馏水，待血红蛋白充分溶解后倾去玻片上的水，待血膜干后即可染色。充分溶解后倾去玻片上的水，待血膜干后即可染色。染色：染色：快染：快染：5 5：1(20%)1(20%)，5 5滴水，滴水，1
11、 1滴染液滴染液(原液原液)，染，染5 5分钟清水分钟清水冲洗即成。冲洗即成。慢染：慢染：2020：1(5%)1(5%)，2020滴水，滴水，1 1滴染液滴染液(原液原液)，染，染3030分钟用分钟用清水冲洗。清水冲洗。待片水干后镜检。待片水干后镜检。(二二)瑞氏染色法：瑞氏染色法：瑞氏染剂粉瑞氏染剂粉 0.2g0.2g 甘油甘油(中性中性)3)3ml(无中性的也可无中性的也可)甲醇甲醇(中性中性)97 ml 将瑞氏染粉放入乳钵中，加入甘油充分研磨，然后将瑞氏染粉放入乳钵中，加入甘油充分研磨，然后加入甲醇加入甲醇10 ml，混合后倒入干燥、清洁的棕色玻璃瓶，混合后倒入干燥、清洁的棕色玻璃瓶内，
12、分次将甲醇倒入乳钵内，至乳钵内染剂洗净为止，内，分次将甲醇倒入乳钵内，至乳钵内染剂洗净为止，配制好的染液充分摇匀即可使用配制好的染液充分摇匀即可使用。（1 1）先用蜡笔在厚薄血膜间划一界限，然后用）先用蜡笔在厚薄血膜间划一界限，然后用缓冲蒸留水滴缓冲蒸留水滴2-32-3滴在已干的厚血膜上，溶血后滴在已干的厚血膜上，溶血后倾去水滴。倾去水滴。（2 2）加瑞氏染液）加瑞氏染液5-85-8滴于薄血膜上，染色滴于薄血膜上，染色1-21-2分分钟。钟。（3 3）加）加5-85-8滴缓冲蒸留水于薄血膜上，用吸管混滴缓冲蒸留水于薄血膜上，用吸管混合均匀后把染液引到厚血膜上，使厚薄血膜同时合均匀后把染液引到厚
13、血膜上，使厚薄血膜同时染色约染色约1010分钟。分钟。（4 4）用清水轻轻冲去染液，将玻片直立待干后）用清水轻轻冲去染液，将玻片直立待干后镜检镜检四、镜检四、镜检(1)(1)间日疟原虫薄血片形态间日疟原虫薄血片形态被寄生红细胞的形态变化被寄生红细胞的形态变化 大小：显著胀大大小：显著胀大 色泽：褪色色泽：褪色 斑点：红色的薛氏小点，细小数目多，斑点：红色的薛氏小点，细小数目多，重复感染：不多见重复感染：不多见小滋养体小滋养体 胞浆：淡蓝色，较大，稍粗厚，有一个空泡。胞浆：淡蓝色，较大，稍粗厚，有一个空泡。核：红色，通常一个，圆形。核：红色，通常一个，圆形。体积：较大，约占红细胞直径的三分之一。
14、体积：较大，约占红细胞直径的三分之一。大滋养体大滋养体 胞浆：阿米巴样，含数胞浆：阿米巴样，含数个空泡，体积较大，浅个空泡，体积较大，浅蓝色蓝色 核：一个，呈点状或杆状，核：一个，呈点状或杆状，疟色素：短杆状，细小，棕黄色疟色素：短杆状，细小，棕黄色 形状：圆形，较小形状：圆形，较小 胞浆：淡兰色，胞浆：淡兰色，核：疏松，较大，核：疏松，较大，常位于中央常位于中央 疟色素：棕色，杆状，均匀散在，疟色素：棕色，杆状，均匀散在，大配子体大配子体 形状：圆形，较大形状：圆形，较大 胞浆：深兰色胞浆：深兰色 核：致密，位于一侧核：致密，位于一侧 疟色素：棕黄色，均匀散在，数很多。疟色素：棕黄色，均匀散
15、在，数很多。(2)(2)间日疟厚血片形态间日疟厚血片形态小滋养体小滋养体 胞浆：大多呈胞浆：大多呈“感叹号感叹号”，“问号问号”，飞鸟等形状。，飞鸟等形状。核：较大，多数是一个，核：较大，多数是一个，胞浆多，形态变化很大，有分布断裂成块现胞浆多，形态变化很大，有分布断裂成块现象，核分裂成数个，较大，呈圆形或不规则的圆象，核分裂成数个，较大，呈圆形或不规则的圆形，零乱地分布在胞浆中，棕黄色短杆状的疟色形，零乱地分布在胞浆中，棕黄色短杆状的疟色素较多。素较多。胞浆多，形态变化很大，有分布断裂成块现胞浆多，形态变化很大，有分布断裂成块现象，核分裂成数个，较大，呈圆形或不规则的圆象，核分裂成数个，较大
16、，呈圆形或不规则的圆形，零乱地分布在胞浆中，棕黄色短杆状的疟色形，零乱地分布在胞浆中，棕黄色短杆状的疟色素较多。素较多。间日疟原虫的配子体很大，几乎同中性间日疟原虫的配子体很大，几乎同中性白细胞同样大小，胞浆完整致密呈圆形或椭白细胞同样大小，胞浆完整致密呈圆形或椭圆形，圆形，雌雄配子体的形态与薄片上的形态完雌雄配子体的形态与薄片上的形态完全相同，配子体有时易与晚期滋养体相混淆，全相同，配子体有时易与晚期滋养体相混淆，但配子体的胞浆比较固实，色素颗粒多而分但配子体的胞浆比较固实，色素颗粒多而分散并有沿边缘分布现象。散并有沿边缘分布现象。间日疟雄配子体 间日疟配体子体 1恶性疟原虫薄血膜-环状体
17、环纤细,约为RBC直径的1/5 核1个，但2个常见 红细胞常含2个以上原虫 虫体常位于红细胞的边缘，呈“鸟飞状”2 恶性疟原虫大滋养体 一般不出现在外周血 体小结实，圆形，不活动 疟色素集中一团，黑褐色 原虫此时开始集中在内脏毛细血管3恶性疟早期裂殖体4恶性疟原虫成熟裂殖体 裂殖子836个，通常1824个，排列不规则 疟色素集中成一团 虫体占红细胞体积的23至34 5 恶性疟原虫雌配子体 新月形，两端较尖 核致密，深红色，常位于中央 疟色素黑褐色，分布于核周围5 恶性疟原虫雄配子体 腊肠形，两端钝圆 胞质色蓝而略带红 核疏松，淡红色，位于中央 疟色素黄棕色，小杆状，在核周围较多 恶性疟厚血片形
18、态 环状体 核1-2个，常呈“!”、飞鸟等形状。大滋养体常呈圆形、疟色素集成1-2个团。裂殖体较小，裂殖子8-26个。配子体新月形，雄配子体腊肠形。五、是非区别五、是非区别 1.1.生物的物质生物的物质 血液内的有性成分，白血球残块、血小板碎血液内的有性成分，白血球残块、血小板碎块、红血球内何杰块、红血球内何杰-乔氏点、卡玻氏环，水生阿乔氏点、卡玻氏环，水生阿米巴、细菌、滴虫等。米巴、细菌、滴虫等。特点：特点：无疟色素无疟色素 凑合常不完善凑合常不完善 大小与疟色素不符大小与疟色素不符。染料杂质、灰尘。染料杂质、灰尘。特点：特点：无生物体死亡的自如感觉无生物体死亡的自如感觉 常折光常折光 有凑
19、合的痕迹。有凑合的痕迹。3.3.厚薄血膜之差厚薄血膜之差 薄血膜：用血少，疟原虫形态完整，便于观察，薄血膜：用血少，疟原虫形态完整，便于观察，利于鉴别虫种，但费时间，阳性率低。利于鉴别虫种，但费时间，阳性率低。厚血膜：血量多而集中，省时间、准确性高、厚血膜：血量多而集中，省时间、准确性高、但较难掌握。但较难掌握。六、疟原虫计数六、疟原虫计数1.1.视野平均法视野平均法：看的视野数除以原虫数：看的视野数除以原虫数(1-(1-5+,6-10+,1005+,6-10+,100以上以上+)+)。2.2.白细胞疟原虫比例计算法白细胞疟原虫比例计算法：按常规计算白细：按常规计算白细胞总数，查多少个白细胞找到几个疟原虫，公胞总数，查多少个白细胞找到几个疟原虫，公式式 wbc/mmwbc/mm3 3疟原虫数疟原虫数/白细胞数。如白细胞数。如wbc6000/mmwbc6000/mm3 3，数，数500500个个wbcwbc，发现，发现100100个疟原个疟原虫，虫，600600100/500=1200100/500=1200个个/mm/mm3 3疟原虫。疟原虫。谢谢
