1、第一节第一节 菌种选育菌种选育第三章第三章 微生物制药技术工艺基础微生物制药技术工艺基础l遗传遗传保持物种的相对稳定性保持物种的相对稳定性 l变异变异促使新性状的产生、获得新的优良品种促使新性状的产生、获得新的优良品种 遗传型变异：遗传型变异：在遗传物质水平上发生了改变，从而引在遗传物质水平上发生了改变，从而引 起某些相应性状发生改变的特性起某些相应性状发生改变的特性 变异性变异性 表型变异：表型变异：微生物在生活条件发生改变时，发生暂时微生物在生活条件发生改变时，发生暂时 的形态、生理等特性的改变，但随着环境的形态、生理等特性的改变，但随着环境 条件的复原，它们又恢复了原有的特性条件的复原，
2、它们又恢复了原有的特性 l（一）（一）基因突变基因突变 基因突变是指遗传物质（基因突变是指遗传物质（DNA或或RNA）中的核苷酸顺序）中的核苷酸顺序发生了稳定的可遗传的变化，主要包括点突变和染色体发生了稳定的可遗传的变化，主要包括点突变和染色体畸变两大类。畸变两大类。1、点突变是由于、点突变是由于DNA链上的一对或少数几对碱基发生改链上的一对或少数几对碱基发生改变引起的。变引起的。2、染色体畸变是指、染色体畸变是指DNA大段变化（损伤）的现象，主要大段变化（损伤）的现象，主要包括染色体结构上的变化和染色体数目的变化。包括染色体结构上的变化和染色体数目的变化。l（二）（二）基因重组基因重组指两个
3、或多个不同性状个体的遗传基因转移到一个体细指两个或多个不同性状个体的遗传基因转移到一个体细胞内，经重新组合后，造成菌种变异，形成新的遗传型胞内，经重新组合后，造成菌种变异，形成新的遗传型个体。个体。l1、自然选育、自然选育l是一种纯种选育的方法。它利用微生物在一定条件是一种纯种选育的方法。它利用微生物在一定条件下产生自发突变的原理，通过分离，筛选排除衰变下产生自发突变的原理，通过分离，筛选排除衰变型菌落，从中选择维持原有生产水平的菌株。型菌落，从中选择维持原有生产水平的菌株。l特点：特点：l（1）能纯化、复壮菌种，稳定生产）能纯化、复壮菌种，稳定生产，提高平均生，提高平均生产水平。产水平。l（
4、2）难以选育高产突变菌株，不能使生产水平大）难以选育高产突变菌株，不能使生产水平大幅度提高。幅度提高。l2、诱变育种、诱变育种l诱变育种是指人工有意识地将生物体暴露于物诱变育种是指人工有意识地将生物体暴露于物理的、化学的或生物的一种或多种诱变因子中，理的、化学的或生物的一种或多种诱变因子中，促使生物体发生突变，进而从突变体中筛选具促使生物体发生突变，进而从突变体中筛选具有优良性状的突变株的过程。有优良性状的突变株的过程。l特点：与自然选育比较，由于引进了诱变剂处特点：与自然选育比较，由于引进了诱变剂处理，因而加速了菌种突变的频率，扩大了变异理，因而加速了菌种突变的频率，扩大了变异的幅度，从而提
5、高了获得优良特性的突变株的的幅度，从而提高了获得优良特性的突变株的几率。几率。物理诱变剂：紫外线、物理诱变剂：紫外线、x射线、射线、Y射线、快中射线、快中 子、子、射线、超声波、激光射线、超声波、激光 l诱变剂诱变剂 化学诱变剂：氮芥、乙烯亚胺、硫酸二乙酯、化学诱变剂：氮芥、乙烯亚胺、硫酸二乙酯、甲基磺酸乙酯、亚硝基胍、甲基磺酸乙酯、亚硝基胍、亚硝基甲基脲、亚硝酸亚硝基甲基脲、亚硝酸 生物诱变剂：噬菌体生物诱变剂：噬菌体l1、杂交育种：杂交育种：指两个基因型不同的菌株通指两个基因型不同的菌株通过接合使遗传物质重新组合，过接合使遗传物质重新组合，再从中分离，筛选出具有新再从中分离，筛选出具有新性
6、状的菌株。性状的菌株。l优点：能集中位于不同品种优点：能集中位于不同品种中的优良性状。中的优良性状。l缺点：只能利用已有的基因缺点：只能利用已有的基因组，并不能产生新的基因。组，并不能产生新的基因。杂交进程缓慢，过程繁琐。杂交进程缓慢，过程繁琐。l2、原生质体融合原生质体融合用脱壁酶处理将微生物细胞壁除去，制成原生质体，用脱壁酶处理将微生物细胞壁除去，制成原生质体，再用融合剂（如聚乙二醇）促进原生质体发生融合，再用融合剂（如聚乙二醇）促进原生质体发生融合，从而获得融合子，这一技术叫原生质体融合。从而获得融合子，这一技术叫原生质体融合。l3、基因工程（基因拼接技术或基因工程（基因拼接技术或DNA
7、重组技术）重组技术）l是指按照人的意志，将某一生物体是指按照人的意志，将某一生物体(供体供体)的遗传信息的遗传信息在体外经人工与载体相接在体外经人工与载体相接(重组重组)，构成重组，构成重组DNA分子，分子，然后转入另一生物体然后转入另一生物体(受体受体)细胞中，使被引进的外源细胞中，使被引进的外源DNA片段在后者内部得以表达和遗传。片段在后者内部得以表达和遗传。l研究和开发的趋势有：研究和开发的趋势有：1.基因克隆产生杂合抗生素。基因克隆产生杂合抗生素。（一旦取得了抗生素的结构基因，将基因片段送入特定性质的另一种抗生素一旦取得了抗生素的结构基因，将基因片段送入特定性质的另一种抗生素产生菌中，
8、即可能产生完全符合人们设计的新抗生素。）产生菌中，即可能产生完全符合人们设计的新抗生素。）2.基因重组获得新抗生素基因重组获得新抗生素。（通过两种基因型不同的菌株结合，使遗传物质重新组合，从中筛选具有新（通过两种基因型不同的菌株结合，使遗传物质重新组合，从中筛选具有新性状的菌株，其中可能有原抗生素高产株，也可能有产生新抗生素的子株。）性状的菌株，其中可能有原抗生素高产株，也可能有产生新抗生素的子株。）l定义：定义：将有用的微生物以特定培养形态在特定的环境条件下将有用的微生物以特定培养形态在特定的环境条件下存放，以保持种的存活、纯粹和遗传性状的稳定。存放，以保持种的存活、纯粹和遗传性状的稳定。l
9、条件及原理条件及原理：1.低营养低营养 2.干干 燥燥 3.隔隔 氧氧 4.低低 温温降低代谢速率或使细胞处于休眠状态降低代谢速率或使细胞处于休眠状态l1原理原理 l制造低温环境，降低菌种的新陈代谢活动能力。制造低温环境，降低菌种的新陈代谢活动能力。l2、方法、方法 l将菌种接种于所要求的培养基上、置最适温度将菌种接种于所要求的培养基上、置最适温度下培养，待得到健壮的菌体后，放在下培养，待得到健壮的菌体后，放在4左右，左右，湿度小于湿度小于70的条件下保藏每间隔一定时间的条件下保藏每间隔一定时间重新移植培养重新移植培养1次。次。l3、特点、特点l（1 1）此法广泛适用于各大类微生物菌种的短期）
10、此法广泛适用于各大类微生物菌种的短期 保藏，一般可保存保藏，一般可保存1 16 6个月左右。个月左右。l（2 2）优点：简便易行，容易推广，存活率高；）优点：简便易行，容易推广，存活率高；缺点：菌株仍有一定程度的代谢活动能缺点：菌株仍有一定程度的代谢活动能 力，保藏期短，传代次数多，菌种力，保藏期短，传代次数多，菌种 较容易发生变异和被污染。较容易发生变异和被污染。l1、原理、原理 l用液体石蜡防止或减少培养基内水分蒸发，隔绝用液体石蜡防止或减少培养基内水分蒸发，隔绝培养物与氧的接触，降低微生物的代谢活动，推培养物与氧的接触，降低微生物的代谢活动，推迟细胞老化，延长保存时间。迟细胞老化，延长保
11、存时间。l2、方法、方法 l在无菌条件下，将灭过菌并已蒸发掉水分的液体在无菌条件下，将灭过菌并已蒸发掉水分的液体石蜡倒入培养成熟的菌种斜面上，石蜡油层高出石蜡倒入培养成熟的菌种斜面上，石蜡油层高出斜面顶端斜面顶端1cm1cm，使培养物与空气隔绝，加胶塞并，使培养物与空气隔绝，加胶塞并用固体石蜡封口后，垂直放在室温或用固体石蜡封口后，垂直放在室温或44冰箱内冰箱内保藏。保藏。l3、特点、特点l（1 1）此法广泛适用于各大类微生物菌种的中）此法广泛适用于各大类微生物菌种的中期保藏，一般可保存期保藏，一般可保存1 12 2年左右。石蜡油管的年左右。石蜡油管的转接和搬运不方便。转接和搬运不方便。l（2
12、 2）不适用于保藏某些能分解烃类的菌种。）不适用于保藏某些能分解烃类的菌种。l1、原理、原理 l低温、干燥、隔氧和无营养物低温、干燥、隔氧和无营养物 l2、方法、方法 l将砂与土分别洗净、烘干、过筛，按一定比例分装将砂与土分别洗净、烘干、过筛，按一定比例分装于小试管中，砂土的高度约于小试管中，砂土的高度约1cm，121蒸汽灭菌蒸汽灭菌11.5h，间歇灭菌，间歇灭菌3次。次。50烘干后经检查无误烘干后经检查无误后备用。将待保藏的菌株制成菌悬液或孢子悬液滴后备用。将待保藏的菌株制成菌悬液或孢子悬液滴入砂土管中，放线菌和霉菌也可直接刮下孢子与载入砂土管中，放线菌和霉菌也可直接刮下孢子与载体混匀，而后
13、置于干燥器中抽真空约体混匀，而后置于干燥器中抽真空约24h，用火，用火焰熔封管口（或用石蜡封口），置于干燥器中，在焰熔封管口（或用石蜡封口），置于干燥器中，在室温或室温或4冰箱内保藏。冰箱内保藏。l3 3、特点、特点l（1 1）适用于产孢子的微生物及形成芽孢的细）适用于产孢子的微生物及形成芽孢的细菌，对于一些对干燥敏感的细菌及酵母则不适菌，对于一些对干燥敏感的细菌及酵母则不适用。用。l（2 2）保藏期较长，约）保藏期较长，约1 11010年。效果较好，且年。效果较好，且微生物移接方便，经济简便。微生物移接方便，经济简便。l1 1、原理、原理 l以麸皮作载体，吸附接入的孢子，然后在低温干燥以麸皮
14、作载体，吸附接入的孢子，然后在低温干燥条件下保存。条件下保存。l2 2、方法、方法 将麸皮与水以一定的比例拌匀，装量为试管体积将麸皮与水以一定的比例拌匀，装量为试管体积2/52/5，湿热灭菌后经冷却，接入新鲜培养的菌种，适温培湿热灭菌后经冷却，接入新鲜培养的菌种，适温培养至孢子长成。将试管置于盛有氯化钙等干燥剂的养至孢子长成。将试管置于盛有氯化钙等干燥剂的干燥器中，于室温下干燥数日后移入低温下保藏；干燥器中，于室温下干燥数日后移入低温下保藏；干燥后也可将试管用火焰熔封，再保藏，则效果更干燥后也可将试管用火焰熔封，再保藏，则效果更好。好。l3、特点、特点l（1 1）此法适用于产孢子的霉菌和某些放
15、线菌，）此法适用于产孢子的霉菌和某些放线菌，保藏期在保藏期在1 1年以上。年以上。l（2 2）操作简单、经济实惠，工厂较多采用。）操作简单、经济实惠，工厂较多采用。l1 1、原理、原理 l在较低的温度下（一在较低的温度下（一15以下），快速地将细胞冻结，以下），快速地将细胞冻结，并且保持细胞完整，然后在真空中使水分升华。经过并且保持细胞完整，然后在真空中使水分升华。经过冷冻干燥的微生物的生长和代谢活动处于极低水平，冷冻干燥的微生物的生长和代谢活动处于极低水平，不易发生变异或死亡，因此菌种可以保存很长时间。不易发生变异或死亡，因此菌种可以保存很长时间。l2 2、方法、方法 将准备保存的新鲜斜面菌
16、种，在无菌条件下，装入灭将准备保存的新鲜斜面菌种，在无菌条件下，装入灭菌的保护剂（常用脱脂牛奶和血清），制成菌悬液，菌的保护剂（常用脱脂牛奶和血清），制成菌悬液，再用无菌带橡皮头的滴管将菌悬液分装到准备好的安再用无菌带橡皮头的滴管将菌悬液分装到准备好的安瓿管中，瓿管中，-35下预冻下预冻15min一一2h，然后进行真空于燥，然后进行真空于燥，最后将安瓿管真空熔封，低温避光保存。最后将安瓿管真空熔封，低温避光保存。l3、特点、特点l（1）此法适用于各大类微生物。）此法适用于各大类微生物。l（2）此法的主要保藏措施是低温、干燥、缺氧、）此法的主要保藏措施是低温、干燥、缺氧、有保护剂，保藏期一般长达
17、有保护剂，保藏期一般长达515年，存活率高，年，存活率高，变异率低，是目前被广泛采用的一种较理想的保变异率低，是目前被广泛采用的一种较理想的保藏方法。藏方法。l（3）该法操作比较烦琐，技术要求较高，且需）该法操作比较烦琐，技术要求较高，且需要冻干机等设备。要冻干机等设备。l1 1、原理、原理 l微生物在微生物在130130的低温下，所有的代谢活动暂时的低温下，所有的代谢活动暂时停止而生命延续，微生物菌种得以长期保存。可通停止而生命延续，微生物菌种得以长期保存。可通过加入保护剂来降低细胞内溶液的冰点，减少冰晶过加入保护剂来降低细胞内溶液的冰点，减少冰晶对细胞的伤害。对细胞的伤害。l2 2、方法、
18、方法 取合适的培养物，以取合适的培养物，以5 51010的甘油或二甲亚砜制的甘油或二甲亚砜制成孢子悬液或菌悬液。将此悬液注入无菌的安瓿管成孢子悬液或菌悬液。将此悬液注入无菌的安瓿管或聚丙烯小管内，密封，在液氮超低温（或聚丙烯小管内，密封，在液氮超低温（196196）下保藏。下保藏。l3、特点、特点l（1 1）适用于各种微生物菌种的保藏。）适用于各种微生物菌种的保藏。l（2 2）保藏期一般可达到）保藏期一般可达到1515年以上，是目前公认的年以上，是目前公认的最有效的菌种长期保藏技术之一。最有效的菌种长期保藏技术之一。l（3 3）优点：操作简便、高效，且可使用各种培养）优点：操作简便、高效，且可
19、使用各种培养形式的微生物进行保藏。形式的微生物进行保藏。缺点：需购置超低温液氮设备，且液氮消耗缺点：需购置超低温液氮设备，且液氮消耗较多，操作费用较高。较多，操作费用较高。l一、培养基组成与成分一、培养基组成与成分l人工配制的适合于不同微生物生长、繁殖和积人工配制的适合于不同微生物生长、繁殖和积累代谢产物的营养基质。累代谢产物的营养基质。l碳源、氮源、无机盐、微量元素、水、生长因碳源、氮源、无机盐、微量元素、水、生长因素、前体、诱导剂或刺激剂、抑制剂素、前体、诱导剂或刺激剂、抑制剂 l例：高氏培养基（培养放线菌）：例：高氏培养基（培养放线菌）：可溶性淀粉可溶性淀粉 2克，硝酸钾克，硝酸钾 0.
20、1克，磷酸氢二钾克，磷酸氢二钾 0.05克，氯化钠克，氯化钠 0.05克，硫酸镁克，硫酸镁 0.05克，硫酸克，硫酸亚铁亚铁 0.001克，琼脂克，琼脂 2克克，水，水 100毫升。毫升。l提供微生物生长繁殖所需的能源，构成细胞和抗提供微生物生长繁殖所需的能源，构成细胞和抗生素的碳骨架。生素的碳骨架。l1碳水化合物：单糖，多糖，多聚糖（蔗糖、乳碳水化合物：单糖，多糖，多聚糖（蔗糖、乳糖、淀粉、糊精等）糖、淀粉、糊精等）l 2脂肪脂肪：油（脂肪）：油（脂肪）水解水解脂肪酶脂肪酶 甘油（脂肪酸）甘油（脂肪酸）溶解氧溶解氧 C02+H20 l3有机酸有机酸 l有机酸或它们的盐也能作为微生物的碳源。有
21、机酸或它们的盐也能作为微生物的碳源。l注意！注意！有机酸的利用常会使有机酸的利用常会使pH上升。上升。CH3COONa+O22CO2+H2O+NaOHl主要用于构成菌体细胞物质，如氨基酸、蛋白质、核主要用于构成菌体细胞物质，如氨基酸、蛋白质、核酸等和含氮的目的产物如青霉素、链霉素等抗生素。酸等和含氮的目的产物如青霉素、链霉素等抗生素。l1、无机氮源（快速利用、无机氮源（快速利用N源）：铵盐（如氯化铵、源）：铵盐（如氯化铵、硫酸铵、硝酸铵、磷酸铵），硝酸盐（如硝酸钠、硝硫酸铵、硝酸铵、磷酸铵），硝酸盐（如硝酸钠、硝酸钾）和氨水等。酸钾）和氨水等。l特点：（特点：（1）分解快，能被微生物迅速利用；
22、）分解快，能被微生物迅速利用；（2）引起）引起pH变化。变化。(NH4)2S04 2NH3+H2S04 生理酸性物质生理酸性物质 NaNO3+4H2NH3+2H20+NaOH 生理碱性物质生理碱性物质l2、有机氮源（慢速利用氮源）、有机氮源（慢速利用氮源）：花生饼粉，：花生饼粉，黄豆饼粉，玉米浆，玉米蛋白粉，蛋白胨，酵黄豆饼粉，玉米浆，玉米蛋白粉，蛋白胨，酵母膏。母膏。l在微生物分泌的蛋白酶作用下，水解成氨基酸，在微生物分泌的蛋白酶作用下，水解成氨基酸，被菌体吸收后再进一步分解代谢最终用于合被菌体吸收后再进一步分解代谢最终用于合成菌体细胞物质和含氮的目的产物。成菌体细胞物质和含氮的目的产物。l
23、微生物在生长繁殖和合成目的产物的过程中，微生物在生长繁殖和合成目的产物的过程中，需要某些无机盐和微量元素作为其生理活性物需要某些无机盐和微量元素作为其生理活性物质的组成或代谢的调节物。质的组成或代谢的调节物。lP、S（可构成细胞物质）（可构成细胞物质）lMg、Fe（可作为酶的组成成分或维持酶活性）（可作为酶的组成成分或维持酶活性）lK、Na（调节细胞渗透压）（调节细胞渗透压）lCu、Zn、Mn（作为酶的辅基和激活剂）（作为酶的辅基和激活剂）l（1）构成生物体的成分；）构成生物体的成分；l（2）培养基的组成部分；）培养基的组成部分；l（3）参与代谢反应；）参与代谢反应；l（4）作为代谢反应介质；
24、）作为代谢反应介质；l（5）作为物质传递介质；）作为物质传递介质；l（6）良好的热导体。）良好的热导体。l生长因素：有些微生物即使在具有合适的水分、碳生长因素：有些微生物即使在具有合适的水分、碳源、氮源、无机盐等的条件下，还不能生长或生长源、氮源、无机盐等的条件下，还不能生长或生长不好，但如果加入少量微生物生长所必需的有机物不好，但如果加入少量微生物生长所必需的有机物质，则生长良好。通常把这些特殊的营养物质称为质，则生长良好。通常把这些特殊的营养物质称为生长因素。生长因素。l1 维生素：是辅酶的组成成分；维生素：是辅酶的组成成分；l2 氨基酸：有些生物不能合成某种氨基酸；氨基酸：有些生物不能合
25、成某种氨基酸；l3 嘌呤和嘧啶：构成核酸和辅酶。嘌呤和嘧啶：构成核酸和辅酶。l在微生物合成抗生素过程中，有些化合物能被微在微生物合成抗生素过程中，有些化合物能被微生物直接利用来构成抗生素分子结构的一部分，生物直接利用来构成抗生素分子结构的一部分，而化合物本身的结构设没有大的变化，这些物质而化合物本身的结构设没有大的变化，这些物质称为抗生素的前体。称为抗生素的前体。l所谓诱导物是指一些具有调节抗生素生物合成所谓诱导物是指一些具有调节抗生素生物合成能力的小分子物质。能力的小分子物质。l如：如：吲哚乙酸是金霉素生物合成的刺激物；吲哚乙酸是金霉素生物合成的刺激物；甲硫氨酸和亮氨酸是头孢菌素的刺激剂。甲
26、硫氨酸和亮氨酸是头孢菌素的刺激剂。l在次级代谢产物发酵生产过程中，往往抑制某在次级代谢产物发酵生产过程中，往往抑制某一代谢途径，就会使另一代谢途径活跃。一代谢途径，就会使另一代谢途径活跃。l如加入二乙基巴比妥盐可抑制利福霉素如加入二乙基巴比妥盐可抑制利福霉素B以外以外其他利福霉素的生成，从而增加利福霉素其他利福霉素的生成，从而增加利福霉素B的的含量和产量。含量和产量。l（一）（一）按来源分类：按来源分类：l1、合成培养基、合成培养基 l（1）所用原料的化学成分明确、稳定；）所用原料的化学成分明确、稳定；l（2）实验重现性好、低泡；）实验重现性好、低泡；l（3）适用于研究菌种基本代谢和过程的物质
27、）适用于研究菌种基本代谢和过程的物质变化；变化；l（4）营养单一，价格昂贵，不适用于大规模）营养单一，价格昂贵，不适用于大规模工业生产。工业生产。l2、天然培养基（天然的动植物产品、天然培养基（天然的动植物产品）l（1）营养丰富，适合于微生物的生长繁殖和）营养丰富，适合于微生物的生长繁殖和目的产物的合成。目的产物的合成。l（2）组成培养基的原料来源丰富，价格低廉，）组成培养基的原料来源丰富，价格低廉，适用于工业生产。适用于工业生产。l（3）组分复杂，不易重复，若对原料质量等）组分复杂，不易重复，若对原料质量等方面不加控制会严重影响生产的稳定性。方面不加控制会严重影响生产的稳定性。固体培养基固体
28、培养基：适用于菌种的分离和保存；：适用于菌种的分离和保存；半固体培养基半固体培养基：（琼脂用量为：（琼脂用量为0.50.8）主要用于鉴定菌种、观察细菌运动特征主要用于鉴定菌种、观察细菌运动特征及及 噬菌体的效价测定等噬菌体的效价测定等；液体培养基液体培养基：（水：（水8090），是发酵工），是发酵工 业大规模使用的培养基，它有利于氧和业大规模使用的培养基，它有利于氧和物物 质的传递。质的传递。l1孢子培养基孢子培养基 l供菌种繁殖孢子的固体培养基。供菌种繁殖孢子的固体培养基。l能使菌体迅速生长，产生较多优质孢子并不易引能使菌体迅速生长，产生较多优质孢子并不易引起菌种发生变异。起菌种发生变异。l
29、例如：高氏培养基例如：高氏培养基l2种子培养基种子培养基 l指一、二级种子罐的培养基和摇瓶培养基。指一、二级种子罐的培养基和摇瓶培养基。l主要含有容易被利用的碳源、氮源、无机盐等，使主要含有容易被利用的碳源、氮源、无机盐等，使孢子很快发芽、生长以及大量繁殖菌丝体，并使菌孢子很快发芽、生长以及大量繁殖菌丝体，并使菌体长得粗壮和使各种有关的初级代谢酶的活力提高。体长得粗壮和使各种有关的初级代谢酶的活力提高。l赤霉素产生菌种子培养基：葡萄糖赤霉素产生菌种子培养基：葡萄糖1.5%,1.5%,糊精糊精1.0%,1.0%,花生粉花生粉1.5%,MgSO1.5%,MgSO4 47H7H2 2O 0.1%,K
30、HO 0.1%,KH2 2POPO4 4 0.1%,0.1%,消泡消泡剂剂0.2%0.2%l3发酵培养基发酵培养基 l 发酵培养基可供菌种生长、繁殖和合成产物。发酵培养基可供菌种生长、繁殖和合成产物。l发酵培养基的组成除有菌体生长所必需的元素和化发酵培养基的组成除有菌体生长所必需的元素和化合物外，还要有产物所需的特定元素、前体和促进合物外，还要有产物所需的特定元素、前体和促进剂等。剂等。l玉米淀粉玉米淀粉7.0，饴糖，饴糖2.5，豆饼粉，豆饼粉0.3，花生，花生粉粉1.0，MgSO47H2O 0.07，KH2PO4 0.14，消沫剂消沫剂0.05，-淀粉酶淀粉酶0.05 l（一）原材料质量的影
31、响：（一）原材料质量的影响：l玉米浆、黄豆粉、花生饼粉、蛋白胨、淀粉、玉米浆、黄豆粉、花生饼粉、蛋白胨、淀粉、糊精糊精l品种、产地、加工方法、储藏条件品种、产地、加工方法、储藏条件 l（二）（二）水质的影响水质的影响l地质（地区）（地貌）、季节、处理方法（漂白地质（地区）（地貌）、季节、处理方法（漂白粉、沉淀剂、消毒剂）和环境粉、沉淀剂、消毒剂）和环境l水源质量的主要考虑参数包括水源质量的主要考虑参数包括pH、溶解氧、可、溶解氧、可溶性固体、污染程度以及矿物质组成和含量。溶性固体、污染程度以及矿物质组成和含量。l灭菌操作不当不仅会减少培养基中有效的营养成灭菌操作不当不仅会减少培养基中有效的营养
32、成分，还会产生一些有毒物质，给发酵带来不利的分，还会产生一些有毒物质，给发酵带来不利的影响。影响。l蛋白质在高温下变性，维生素在高温下失活蛋白质在高温下变性，维生素在高温下失活l葡萄糖与含氨基的物质反应形成葡萄糖与含氨基的物质反应形成5-羟甲基糖醛和羟甲基糖醛和棕色的类黑精（焦化），对微生物有一定的毒性棕色的类黑精（焦化），对微生物有一定的毒性l粘度是培养基物性的重要指标之一，它直接影响粘度是培养基物性的重要指标之一，它直接影响氧的传递、营养成分、无机盐、生长因子等的扩氧的传递、营养成分、无机盐、生长因子等的扩散，从而影响细胞的呼吸、营养成分的吸收，最散，从而影响细胞的呼吸、营养成分的吸收，最
33、终导致影响目标产物的形成。终导致影响目标产物的形成。l“稀配方稀配方”：（：（1）中间补料）中间补料；（2）精料发酵、基础原料液体化；）精料发酵、基础原料液体化；（3）补加无菌水）补加无菌水 l染菌对抗生素生产过程的危害：染菌对抗生素生产过程的危害：l（1）消耗培养基的营养成分；）消耗培养基的营养成分；l（2）使培养条件如溶氧、粘度发生变化；）使培养条件如溶氧、粘度发生变化；l（3）有的杂菌会分泌一些对抗生素产生菌有毒或）有的杂菌会分泌一些对抗生素产生菌有毒或能使抗生素降解失活的物质，从而造成抗生素产量能使抗生素降解失活的物质，从而造成抗生素产量大幅度下降；大幅度下降；l（4）影响后道工序的正
34、常生产、影响产品外观及）影响后道工序的正常生产、影响产品外观及内在质量；内在质量；l（5）如果污染了噬菌体，不仅引起产生菌自溶，）如果污染了噬菌体，不仅引起产生菌自溶，而且还会迅速大面积蔓延，严重威胁抗生素的生产。而且还会迅速大面积蔓延，严重威胁抗生素的生产。l灭菌是指用化学或物理的方法杀灭或去除物料灭菌是指用化学或物理的方法杀灭或去除物料及设备中所有生命物质的技术或工艺过程。及设备中所有生命物质的技术或工艺过程。l（一）物理灭菌（一）物理灭菌l射线灭菌射线灭菌l热灭菌（湿热和干热）热灭菌（湿热和干热）l过滤除菌过滤除菌 l 射线灭菌射线灭菌l1、方法：、方法：通常用紫外线、高能量的电磁波或粒
35、子通常用紫外线、高能量的电磁波或粒子辐射灭菌。其中以紫外线最常用。辐射灭菌。其中以紫外线最常用。l2、原理：紫外线的作用光谱与细菌体内核酸的吸、原理：紫外线的作用光谱与细菌体内核酸的吸收光谱相一致，收光谱相一致，DNA链上核苷酸的碱基因此具有链上核苷酸的碱基因此具有强烈的吸收紫外线的能力，引起强烈的吸收紫外线的能力，引起DNA结构形式的结构形式的变化而导致死亡。变化而导致死亡。l3、特点：紫外线对芽孢和营养细胞都能起作用，、特点：紫外线对芽孢和营养细胞都能起作用，但其穿透力极低，只能用于表面灭菌。对真菌孢但其穿透力极低，只能用于表面灭菌。对真菌孢子的杀灭能力不大。主要用来进行一定空间内空子的杀
36、灭能力不大。主要用来进行一定空间内空气的灭菌（如无菌室等）。气的灭菌（如无菌室等）。l干热灭菌干热灭菌 l1、方法：包括火焰灭菌和热空气灭菌，常用的、方法：包括火焰灭菌和热空气灭菌，常用的干热空气灭菌是利用电热或者红外线在一定设备干热空气灭菌是利用电热或者红外线在一定设备内对各种用具物品进行杀菌。生产上常用的干热内对各种用具物品进行杀菌。生产上常用的干热灭菌的条件是灭菌的条件是160，时间，时间12h。l2、原理：高温时微生物各种与温度有关的氧化、原理：高温时微生物各种与温度有关的氧化过程速率增快。过程速率增快。l3、特点：时间长、耗热量大，应用不广。一般、特点：时间长、耗热量大，应用不广。一
37、般用于灭菌后要求保持干燥状态的物料。用于灭菌后要求保持干燥状态的物料。l湿热灭菌湿热灭菌 l1、方法：、方法：直接用加压湿蒸汽进行物料或设备容器直接用加压湿蒸汽进行物料或设备容器的灭菌。用蒸汽将物料升温到的灭菌。用蒸汽将物料升温到115140保持一定保持一定时间，可杀死各种微生物。常用的灭菌条件是时间，可杀死各种微生物。常用的灭菌条件是120，2030min。l2、原理：在高温及有水分存在的条件下，微生物、原理：在高温及有水分存在的条件下，微生物细胞中的蛋白质极易凝固而引起微生物的死亡。细胞中的蛋白质极易凝固而引起微生物的死亡。l3、特点：经济，快速，适用于大量培养基及发酵、特点：经济，快速，
38、适用于大量培养基及发酵设备的灭菌。设备的灭菌。l介质过滤除菌介质过滤除菌l对培养液中某此不耐热的成分可采用过滤除菌法。对培养液中某此不耐热的成分可采用过滤除菌法。l发酵过程中所用的大量无菌空气也是用过滤除菌发酵过程中所用的大量无菌空气也是用过滤除菌法。法。l1、定义：化学药剂灭菌是通过药剂与微生物细胞接触、定义：化学药剂灭菌是通过药剂与微生物细胞接触而发生诸如蛋白质变性等作用而达到杀灭微生物的目而发生诸如蛋白质变性等作用而达到杀灭微生物的目的。的。l2、灭菌用化学药剂必须具备以下四个条件：、灭菌用化学药剂必须具备以下四个条件：l（1）杀菌谱广。有效浓度低且杀灭微生物的速度快。）杀菌谱广。有效浓
39、度低且杀灭微生物的速度快。l（2）性质稳定，易溶于水且可在常温下使用。）性质稳定，易溶于水且可在常温下使用。l（3）基本上不受有机物、酸、碱和其他物理化学因素）基本上不受有机物、酸、碱和其他物理化学因素的影响。的影响。l（4）无腐蚀性，无毒或低毒，使用安全。）无腐蚀性，无毒或低毒，使用安全。l3、常用的化学药剂：乙醇、甲醛、苯扎溴铵、常用的化学药剂：乙醇、甲醛、苯扎溴铵（新洁尔灭）、戊二醛、环氧乙烷、漂白粉和（新洁尔灭）、戊二醛、环氧乙烷、漂白粉和苯酚（石炭酸）等。苯酚（石炭酸）等。l4、用途：化学灭菌主要用来进行皮肤表面、用途：化学灭菌主要用来进行皮肤表面、器具及无菌区域的灭菌，很少用于培养
40、基的灭器具及无菌区域的灭菌，很少用于培养基的灭菌。菌。l（一）实罐灭菌（分批灭菌）（一）实罐灭菌（分批灭菌）l 分批灭菌是将配制好的培养基投入发酵罐中，分批灭菌是将配制好的培养基投入发酵罐中，经过间接蒸汽预热后，直接通入饱和蒸汽使培养经过间接蒸汽预热后，直接通入饱和蒸汽使培养基和设备一起灭菌。基和设备一起灭菌。l流程：流程：l培养基预热培养基预热 培养基灭菌培养基灭菌 冷却冷却l注意事项：注意事项：l1培养基预热：培养基预热：8090。避免产生冷凝水造。避免产生冷凝水造成培养基稀释。成培养基稀释。l2培养基灭菌：培养基灭菌：120 130，保温，保温30min。各。各路蒸汽进口要畅通，防止逆流
41、，罐内液体翻动要路蒸汽进口要畅通，防止逆流，罐内液体翻动要剧烈，以使罐内物料达到均一的灭菌温度。排汽剧烈，以使罐内物料达到均一的灭菌温度。排汽量不宜过大，以节约蒸汽用量。量不宜过大，以节约蒸汽用量。l3冷却：灭菌将要结束时，应立即引入无菌空冷却：灭菌将要结束时，应立即引入无菌空气以保持罐压，然后开夹套或蛇管冷却水冷却，气以保持罐压，然后开夹套或蛇管冷却水冷却，避免罐压迅速下降，产生负压而抽吸外界空气。避免罐压迅速下降，产生负压而抽吸外界空气。l空罐灭菌即发酵罐罐体的灭菌。空罐灭菌即发酵罐罐体的灭菌。l空罐灭菌一般维持罐压空罐灭菌一般维持罐压1.51052.0105Pa，罐温罐温125130，3
42、045min，直接蒸汽法。，直接蒸汽法。l灭菌后为避免罐压急速下降造成负压，要等到经灭菌后为避免罐压急速下降造成负压，要等到经过灭菌的无菌培养基输入罐内后，才可以开冷却过灭菌的无菌培养基输入罐内后，才可以开冷却水冷却。水冷却。l培养基通过连续灭菌装置，进行快速这续加热灭菌，培养基通过连续灭菌装置，进行快速这续加热灭菌，并快速冷却，再立即输入预先经过空罐灭菌后的发并快速冷却，再立即输入预先经过空罐灭菌后的发酵罐中。酵罐中。l流程：流程：培养基预热培养基预热 连续灭菌连续灭菌 维持灭菌温度维持灭菌温度 冷却冷却l注意事项：注意事项：l1培养基预热：培养基预热：60一一75，避免连续灭菌时由于，避免
43、连续灭菌时由于料液与蒸汽温度相差过大而产生水汽撞击声。料液与蒸汽温度相差过大而产生水汽撞击声。l2连续灭菌：连续灭菌的温度一般以连续灭菌：连续灭菌的温度一般以126一一132为宜。为宜。l3维持灭菌温度：利用维持罐使料液在灭菌温度维持灭菌温度：利用维持罐使料液在灭菌温度下保持下保持57min，以达到灭菌的目的。，以达到灭菌的目的。l4冷却：采用冷水喷淋时，喷淋前冷却管内应充冷却：采用冷水喷淋时，喷淋前冷却管内应充满填料。满填料。l特点：特点：l（1）连续灭菌的时间短、温度较高。培养基受）连续灭菌的时间短、温度较高。培养基受到的破坏较少，故质量较好。连续灭菌时蒸汽到的破坏较少，故质量较好。连续灭
44、菌时蒸汽负荷均衡一致。负荷均衡一致。l（2）不足之处是所需设备较多，操作较麻烦，）不足之处是所需设备较多，操作较麻烦，染菌的机会也相应增多。染菌的机会也相应增多。l发酵附属设备有总空气过滤器、管道、计量罐、发酵附属设备有总空气过滤器、管道、计量罐、补料罐等。补料罐等。l（一）介质除菌的机制一）介质除菌的机制 l1沉降作用沉降作用 l2截留作用截留作用l 3惯性碰撞惯性碰撞 l4扩散现象扩散现象 l5静电吸附静电吸附l1、要求：能耐高温、高压，不易被油水污染。、要求：能耐高温、高压，不易被油水污染。且成本低、易更换。且成本低、易更换。l2、常用的空气过滤介质：棉花、活性炭、玻、常用的空气过滤介质
45、：棉花、活性炭、玻璃棉、超细玻璃纤维纸、石棉滤板等。璃棉、超细玻璃纤维纸、石棉滤板等。l3、新型过滤介质：膜过滤器。、新型过滤介质：膜过滤器。l主要目的：主要目的：l1、提高压缩前空气的质量、提高压缩前空气的质量l去除压缩空气中所带的油和水去除压缩空气中所带的油和水l3、获得无菌空气、获得无菌空气l一、一、发酵过程的主要控制参数与代谢变化发酵过程的主要控制参数与代谢变化l物理参数：物理参数：l1温度（温度（）l发酵整个过程或不同阶段中所维持的温度。发酵整个过程或不同阶段中所维持的温度。l酶反应速率、氧在培养液中的溶解度与传递速酶反应速率、氧在培养液中的溶解度与传递速率、菌体生长速率和产物合成速
46、率率、菌体生长速率和产物合成速率l2压力（压力（Pa）l发酵过程中发酵罐维持的压力发酵过程中发酵罐维持的压力,一般维持在一般维持在0.21050.5105Pa。l保证纯种的培养保证纯种的培养,间接影响菌体代谢。间接影响菌体代谢。l3搅拌转速（搅拌转速（rmin）l搅拌转速是指搅拌器在发酵过程中的转动速度，搅拌转速是指搅拌器在发酵过程中的转动速度，通常以每通常以每1min的转数来表示。的转数来表示。l它的大小与氧在发酵液中的传递速率与发酵液它的大小与氧在发酵液中的传递速率与发酵液的均匀性有关。的均匀性有关。l4搅拌功率（搅拌功率（kw）l指搅拌器搅拌时所消耗的功率，常指每指搅拌器搅拌时所消耗的功
47、率，常指每1m3发发酵液所消耗的功率（酵液所消耗的功率（kwm3）。）。l它的大小与氧容量传递系数有关。它的大小与氧容量传递系数有关。l5空气流量空气流量V（Vmin），简称），简称VVMl每每1min内每单性体积发酵液通入空气的体积，内每单性体积发酵液通入空气的体积，也是需氧发酵的控制参数。也是需氧发酵的控制参数。l与氧的传递和其他控制参数有关。一般控制在与氧的传递和其他控制参数有关。一般控制在0.51.0V（Vmin）范围内。）范围内。l6粘度（粘度（Pas）l 粘度大小可以作为细胞生长或细胞形态的一项粘度大小可以作为细胞生长或细胞形态的一项标志，也能反映发酵罐中菌丝分裂过程的情况。标志，
48、也能反映发酵罐中菌丝分裂过程的情况。l通常用表观粘度表示之：它的大小可改变氧传通常用表观粘度表示之：它的大小可改变氧传递的阻力，又可表示相对菌体浓度。递的阻力，又可表示相对菌体浓度。l7浊度（）浊度（）l 浊度是能及时反映单细胞生长状况的参浊度是能及时反映单细胞生长状况的参数，对某些产品的生产是极其重要的参数，对某些产品的生产是极其重要的参数。数。l8.料液流量（料液流量（Lmin）l这是控制流体进料的参数。这是控制流体进料的参数。l1 pH（酸碱度）（酸碱度）l发酵液的发酵液的pH是发酵过程中各种产酸和产碱的是发酵过程中各种产酸和产碱的生化反应的综合结果。生化反应的综合结果。l它是发酵工艺控
49、制的重要参数之一。它的高低它是发酵工艺控制的重要参数之一。它的高低与菌体生长和产物合成有着重要的关系。与菌体生长和产物合成有着重要的关系。l2基质浓度（基质浓度（g或或mg）l 这是发酵液中糖、氮、磷等重要营养物质的这是发酵液中糖、氮、磷等重要营养物质的浓度。浓度。l它们的变化对产生菌的生长和产物的合成有着它们的变化对产生菌的生长和产物的合成有着重要的影响，也是提高代谢产物产量的重要控重要的影响，也是提高代谢产物产量的重要控制手段。制手段。l在发酵过程中，必须定时测定糖（还原糖和总在发酵过程中，必须定时测定糖（还原糖和总糖）、氮（氨基氮或氨氮）等基质的浓度。糖）、氮（氨基氮或氨氮）等基质的浓度
50、。l3溶解氧浓度溶解氧浓度10-6（ppm）或饱和度（）或饱和度（）l 溶解氧是需氧菌发酵的必备条件。溶解氧是需氧菌发酵的必备条件。l利用溶氧浓度的变化，可了解产生菌对氧利用的规利用溶氧浓度的变化，可了解产生菌对氧利用的规律，反映发酵的异常情况，也可作为发醉中间控制律，反映发酵的异常情况，也可作为发醉中间控制的参数及设备供氧能力的指标。的参数及设备供氧能力的指标。l溶氧浓度一般用绝对含量（溶氧浓度一般用绝对含量（10-6）来表示、有时也）来表示、有时也用在相同条件下，氧在培养液中饱和浓度表示。用在相同条件下，氧在培养液中饱和浓度表示。l4产物的浓度产物的浓度g（u）ml l 这是发酵产物产量高
