1、临床基因扩增检测技术分析前质量控制上海市临床检验中心徐 翀全面质量管理全面质量管理阿曼德阿曼德费根堡姆费根堡姆（Armand Vallin Feigenbaum）全面质量控制之父、质量大师、全面全面质量控制之父、质量大师、全面质量控制的作者质量控制的作者最早提出全面质量管理概念，努力摈弃当时最受关注的质量控制最早提出全面质量管理概念，努力摈弃当时最受关注的质量控制的技术方法，而将质量控制作为一种管理方法。的技术方法，而将质量控制作为一种管理方法。临床实验室的全面质量管理 2003年3月正式颁布医学实验室质量和能力专用要求（ISO/IEC 15189），其核心就是加强实验室的全面质量管理。全面质
2、量管理就是按系统学的原理，建立一个体系，使在实验的全过程中所有影响实验结果的要求和环节都处于受控状态，保证每个环节的协调和统一，确保实验结果始终可靠。全面质量管理的划分 为了方便管理，ISO/IEC 15189文件将实验过程各环节划分为分析前质量管理、分析中质量管理和分析后质量管理。分析前质量管理的内涵 ISO/IEC 15189对于分析前程序的明确定义：按照时间顺序，从临床医生开出医嘱开始，到分析检验程序时终止的步骤，包括检验申请、患者的准备、原始样品的采集、运送到实验室并在实验室进行传输。这个过程大部分工作都是医生、护士、护工等在实验室以外完成的。分析后质量评估分析后质量评估分析中质量控制
3、分析中质量控制 患者患者准备准备检查患者检查患者申请检验申请检验标本标本采集采集标本标本运送运送标本标本处理处理人员素质人员素质工作环境工作环境实验用水实验用水实验室管理实验室管理仪器质量保证仪器质量保证方法选择与评价方法选择与评价试剂选择与评价试剂选择与评价建立操作规程建立操作规程室内质控及分析室内质控及分析标本分析测定标本分析测定临床医师临床医师反馈信息反馈信息室内室内复查复查保留标本保留标本随时复查随时复查运送报告运送报告患者投诉患者投诉室间质评室间质评 登记登记填发报告填发报告分析前质量保证分析前质量保证分析中质量控制分析中质量控制分析前程序的特点 分析前阶段所占时间比例大。分析前程序
4、的特点分析前质量管理是最易出现问题、涉及人员最多、潜在因素最多、最难控制的环节。发生在临床实验室的错误分析Analytical factors%of total errorspre-analytical factors4668.2post-analytical factors18.547intra-analytical factors15Mario Plebani.Errors in clinical laboratories or errors in laboratory medicine?Clinical Chemical Laboratory Medicine.2006,Volume 4
5、4,Issue 6,750759发生在临床实验室的错误分析临床反馈不满意的检临床反馈不满意的检验结果，验结果，80%的报告的报告最终可溯源到标本质最终可溯源到标本质量不符合要求。量不符合要求。医疗机构临床实验室管理办法卫医发200673号 第十五条 医疗机构和采供血机构应有分析前质量保证措施，应制定患者准备、标本采集、标本贮存、标本运送、标本接收等标准操作规程，标本采集和接收记录完整，并由医疗机构和采供血机构组织实施。序序号号审核内容审核内容审核意见审核意见符合基本符合但有缺陷不符合暂不需要考核评论与说明6标本管理6.1实验室有各类患者准备、标本采集、运送、接收（或拒收）、保存或安全处置的具体
6、要求和操作规程6.2标本运送应符合生物安全的要求，组织标本应立刻冷冻并于低温条件下运送，标本采集、运送、接收全程可跟踪6.3在接收标本时应有其状态的详细记录6.4实验室应确定标本是否符合检测要求，拒收标本原因要明确6.5标本检测全过程包括核酸提取、扩增、杂交、保存等都应保持标本的唯一编号6.6实验室应对标本保存条件进行监控和记录上海市临床基因扩增检验及相关分子诊断技术审核表做好分析前质量管理要点 建立实验室分析前质量管理文件 加强与医生、护士、受检者和实验室人员的沟通与培训 通过Lis-His网络化管理临床基因扩增实验室分析前质量管理 软件：1.检测人员：应当经省级以上卫生行政部门指定机构技术
7、培训合格后，方可从事临床基因扩增检验工作。2.临床医生、护士、护工及标本接收人员等需沟通与培训。临床基因扩增实验室分析前质量管理 硬件 临床基因扩增检验实验室区域设置 1.试剂储存和准备区2.标本制备区3.扩增反应混合物配制和扩增区4.扩增产物分析区临床基因扩增实验室分析前质量管理质量质量手册手册 程序性文件程序性文件 质量记录质量记录 （表格、记录本等）（表格、记录本等）作业指导书作业指导书（标准操作规程）（标准操作规程）文件第三层次：第三层次：具体工作具体工作人员使用更详细文件人员使用更详细文件 第四层次：第四层次：用于质用于质量体系运行的证实依量体系运行的证实依 质量体系文件层次图质量体
8、系文件层次图纲领文件纲领文件 支持文件支持文件 证实监督文证实监督文 分析前质量管理相关SOP文件临床标本的采集、运送、接收和保存 每类标本或每个项目的特定标本如：血清、血浆、分泌物、尿液、痰、脑脊液、胸腹水及组织等，都应有一个采集、运送、接收和保存的SOP。分析前质量管理相关SOP文件 编写目的：通过规范相应临床标本的采集方法、所用容器、运送方式、保存条件及接收，确保所采集的标本在检测前的有效性。分析前质量管理相关SOP文件基本内容：1.特定标本采集的具体方法和步骤2.明确规定标本的采集容器要求3.明确标本的采集量4.明确标本采集后送到实验室检测所能允许的最大时间间隔5.明确标本采集后，在送
9、往实验室检测前的保存方式和条件6.明确标本从采集处运送至实验室过程中所要求的运送条件7.明确标本接收时，签收的程序、拒收的标准和标本惟一编号的规则8.规定标本在实验室内的短期和长期保存条件和要求9.制定保证标本安全，即如何防止标本丢失、调换、变质的措施分析前质量管理的核心问题 医嘱（责任人医生）标本采集（责任人医生、护士）标本运送与保存（责任人护工）标本验收与保存（责任人检验人员）检验申请表信息充分1.患者的唯一标识2.医生的姓名或唯一标识，最终检验报告目的地3.原始样品的类型4.申请的检验项目5.患者的相关临床资料，至少包括性别和出生日期6.原始样品采集日期和时间7.实验室收到样品的日期和时
10、间标本的采集 标本采集时间对扩增结果的影响 病原体感染机体后，特定的临床标本中，病原体含量能达到PCR检出水平的时间点，并不能覆盖整个感染过程，可能只是在感染或疾病发生发展过程中的某一个时间段。如HBV何HCV感染后，在特异抗原和抗体出现以前，血循环中即可有较高浓度病原体存在，而当抗体出现后，病原体的浓度可能会低于PCR或RT-PCR方法的测定下限。标本的采集 标本采集时间对扩增结果的影响采集血液标本需空腹，脂血干扰核酸测定采集肺结核患者标本，晨起后生理盐水反复漱口后用力深咳标本的采集 标本的采集类型1.血液标本：用于HBV、HCV检测。研究表明对于病原体RNA测定，最好使用EDTA抗凝全血标
11、本（严禁使用肝素），抗凝后6h内分离血浆。如使用血清标本，则需尽快（2h内）分离血清。2.痰液：结合分枝杆菌病检测。3.各种分泌物：泌尿生殖道拭子用于衣原体检测。4.尿液、脑脊液、浆膜腔液、胸腹水和组织等。5.PCR标本应独立收集，密闭运输，不能使用从其他检测如生化、免疫、血液学检测分出的标本。肝素对PCR检测的影响 肝素使DNA抽提得率降低肝素能结合并激活全血中多种蛋白酶原和补体系统，由此引起的一系列反应使DNA在提取过程中不断降解。肝素在DNA提取过程中难以去除肝素为含多量硫酸基团的粘多糖硫酸酯，溶于水，不溶于有机溶剂。理化性质决定了在DNA抽提过程中，不能被酚、氯仿去除，也不能被乙醇沉淀
12、、洗涤去除。肝素对PCR检测的影响 肝素使PCR扩增效率降低1.肝素对DNA聚合酶具有强大的亲和力，使后者不能与Mg2+作用形成正确的亲引物-模板符合体的活性中心。2.肝素带有强大负电荷，与DNA聚合酶结合后与同样带有较高负电荷的模板DNA之间产生排斥作用。3.肝素携带的强大负电荷中和反应体系中的阳离子如Mg2+和K+，使作为DNA聚合酶辅助因子的Mg2+浓度下降。使用一次性无菌及无核酸酶的材料绿头管为含肝素类抗凝剂标本的采集 标本采集过程泌尿生殖道分泌物采集1.消毒：采集部位如为泌尿生殖道，过度消毒可能会去掉或破坏靶微生物。2.采集：将拭子深入至尿道口2至3厘米处用力旋转1至2圈。痰液采集1
13、.患者漱口，用力咳出气管深出第一口痰于清洁干燥无菌的容器内。2.对于无痰或少痰的患者，可用45加温的100g/L NaCl水溶液雾化吸入或改变体位以使痰液易于咳出。3.对于小儿可以轻压胸骨柄上方以诱导咳痰，用消毒棉拭子刺激喉部引起咳嗽反射，用棉拭子采集标本标本的运送与保存 标本采集后，应尽快送至检测实验室。1.采集后的所有样本在送至实验室之前，均应暂放在28临时保存。2.靶核酸为DNA的标本，如为无菌条件下采集，可在室温下8小时内运送。3.靶核酸为RNA的标本，短时间内的运送（如10min左右），可在室温下运送；如时间较长，则应在加冰条件下运送。如在标本中加入了适当的稳定剂（如GITC）的血标
14、本，则可在室温下运送或邮寄。4.靶核酸为RNA的标本，采集后建议在4h内送至实验室。5.标本运送过程中应充分考虑生物安全问题。有合适的容器转运标本，带盖的透明转运盒，有生物危害标识。标本的验收 标本接收的地点 不宜放在在标本制备区，减少实验室污染的机会。可在四区外单独设置或与其他临床标本接收处放在一起。标本的验收 采样质量评价1.血清（浆）标本：体积不少于2ml。观察是否溶血、脂血、黄疸及其程度。严重溶血：血红蛋白及其代谢产物可能抑制Taq酶活性，使PCR扩增效率明显降低。严重黄疸：胆红素可抑制Taq酶活性。脂血：低密度脂蛋白对荧光有屏蔽和吸收作用，故对Real Time PCR有干扰。标本的
15、验收 采样质量评价2.分泌物标本：从细胞组成、所需类型细胞的数量进行评价 泌尿生殖道分泌物标本可以显微镜下观察是否有上皮细胞存在3.痰液标本：体积不少于5ml。外观规定脓样、血性、干酪样及脓性粘液样痰为合格。镜下用油镜观察白细胞大于10个。标本的验收 核对标本的采集时间，严格控制标本运送时间1.靶核酸为DNA的标本，如为无菌条件下采集，可在室温下8小时内送达。2.靶核酸为RNA的标本，采集后4h内送至实验室，并注意运送条件。标本的验收 标本的唯一性编号编号时，建议体现出项目的区别，比如：2012年3月19日，第一个送达的HBV-DNA标本，可编号成B12031901可用字母C用于HCV-RNA
16、，T用于TB-DNA，P用于HPV-DNA的编号 交接填表、签名，拒收填表、签名临床PCR实验室标本接收记录唯一编号唯一编号姓名姓名性别性别病历号病历号采集时间采集时间接收时间接收时间标本类别标本类别标本状态标本状态男男女女 月月 日日 时时 月月 日日 时时全血全血 正常正常男男女女 月月 日日 时时 月月 日日 时时全血全血 正常正常男男女女 月月 日日 时时 月月 日日 时时全血全血 正常正常男男女女 月月 日日 时时 月月 日日 时时全血全血 正常正常男男女女 月月 日日 时时 月月 日日 时时全血全血 正常正常以上标本编号从以上标本编号从 至至 ，送检人（签字）：，送检人（签字）：接
17、收人（签字）：接收人（签字）：。以上标本编号从以上标本编号从 至至 ，送检人（签字）：，送检人（签字）：接收人（签字）：接收人（签字）：。以上标本编号从以上标本编号从 至至 ，送检人（签字）：，送检人（签字）：接收人（签字）：接收人（签字）：。临床PCR实验室标本拒收记录（一）姓名姓名性别性别病历号病历号采集时间采集时间接收时间接收时间标本类别标本类别拒收原因拒收原因拒收人签字拒收人签字送检人签字送检人签字男男女女 月月 日日 时时 月月 日日 时时全血全血 正常正常男男女女 月月 日日 时时 月月 日日 时时全血全血 正常正常男男女女 月月 日日 时时 月月 日日 时时全血全血 正常正常男男
18、女女 月月 日日 时时 月月 日日 时时全血全血 正常正常男男女女 月月 日日 时时 月月 日日 时时全血全血 正常正常临床PCR实验室标本拒收记录（二）姓名姓名性别性别病历号病历号采集时间采集时间接收时间接收时间标本类别标本类别拒收原因拒收原因拒收人签字拒收人签字送检人签字送检人签字男男女女 月月 日日 时时 月月 日日 时时全血全血 正常正常标本拒收原因：标本拒收原因：（1）患者姓名或病历号不符）患者姓名或病历号不符（2）标本容器为非不含任何添加剂的真空采血管）标本容器为非不含任何添加剂的真空采血管（3）采血量低于）采血量低于2ml（4）标本采用肝素抗凝）标本采用肝素抗凝（5）容器破损）容
19、器破损（6）标本采集后送检时间超时）标本采集后送检时间超时（7）标本重度或中度溶血）标本重度或中度溶血（8）标本脂血）标本脂血（9）标本类型不正确）标本类型不正确（10）其它：）其它：标本的处理和保存 血清（浆）1.最理想的做法：分离血清（浆）时，分出两管，一管用于测定，一管用于长期保存备查。2.HBV：分离出的血清（浆）如不立即提取核酸，保存于-20待检。3.HCV：尽快分离血清(浆),如不立即提取RNA，保存于-20待检。4.RNA长期保存：吸取200l血清，加20u RNasin（RNA酶抑制剂），保存于-70。5.如不分管，已发出结果报告的标本应及时转移至冰箱保存，并由专人负责管理，保
20、存1-2周（时间长短根据报告单上的承诺而定）。标本的处理和保存 全血标本1.全血标本如用于DNA提取，可4下短期保存（数天），时间长易降解，如用于RNA检测，应在取血后尽快提取RNA。2.最好将DNA或RNA提取后，置-70保存。标本的处理和保存 外周血单个核细胞1.用淋巴细胞分离液分离单个核细胞。2.加红细胞裂解液裂解残余红细胞，生理盐水洗涤数次离心取沉淀。3.如短期内不提取核酸，置-70保存。标本的处理和保存淋巴细胞分离液分淋巴细胞分离液分离单个核细胞离单个核细胞标本的处理和保存 外周血单个核细胞 有研究表明，HCV-RNA和HGV-RNA的丰度外周血单个核细胞高于血浆。病毒感染外周血单个
21、核细胞后并在其中复制，然后释放入血浆，因此检测细胞内病毒RNA比检测血浆更有价值。标本的处理和保存 痰液1.由于痰标本中含大量粘蛋白和杂质，故在核酸提取时，一定要对标本进行前处理，即用4%NaOH液化，去除粘蛋白。2.液化的痰标本如不立即用于核酸提取，可保存于-20。3.处理后的棉拭子、体液、脓液如不立即用于核酸提取，可保存于-20。标本的处理和保存 棉拭子1.将棉拭子置于适量生理盐水中,充分震荡洗涤后,室温静置510分钟,待大块状物下沉后,取上清立即离心,其后的沉淀即可用于DNA提取。2.如不立即用于核酸提取,则需保存于-70下。标本的处理和保存 脓液1.脓液的处理依情况而定,如用于分枝杆菌(如结核杆菌)核酸测定的标本,粘稠的脓液可采用痰标本的处理模式，先进行液化，再离心取沉淀提取DNA；水样的脓液则直接离心,沉淀用生理盐水洗23次后,即可用于DNA提取。2.对于用于非分枝杆菌测定的脓液标本,如过于粘稠,则加入适量生理盐水,充分振荡后,静置,取上清立即离心,沉淀用于DNA提取;如为水样,则按上述直接离心取沉淀即可。3.沉淀标本的保存条件同样为-70。标本的处理和保存 组织新鲜组织最好保存于50%乙醇中，具体方法：先用生理盐水将组织洗一次，切成小块，加入适量生理盐水，然后边摇边加入无水乙醇至终浓度为50%，这样固定的组织标本室温下可保存数日，4可保存6年。谢谢关注
