1、Dr.Wang Hui,Faculty of Laboratory Medicine in Xinxiang Medical College重点：生物素的理化性质与标记 生物素-亲和素系统基本类型及原理 生物素-亲和素系统在ELISA中的应用 难点：生物素-亲和素系统基本类型及原理Dr.Wang Hui,Faculty of Laboratory Medicine in Xinxiang Medical College概述：n70年代后期在免疫酶技术中利用生物素-亲和素系统(Biotin-Avidin System BAS)标记抗体发展了又一种新型生物反应放大技术。Dr.Wang Hui,Fa
2、culty of Laboratory Medicine in Xinxiang Medical Collegen早在1916年Bateman第一個發現雞蛋蛋白中有一種有毒物質，直到1927年Boas才發現某種食物可以預防蛋白的毒性。之後的研究，即將此種可抗蛋白毒性的物質-生物素分離出來。生物素的結構於1936年被發明而出，也在1943年即能在實驗室中合成此種物質。Dr.Wang Hui,Faculty of Laboratory Medicine in Xinxiang Medical College第一节 生物素亲和素系统的特点Dr.Wang Hui,Faculty of Laborato
3、ry Medicine in Xinxiang Medical CollegeDr.Wang Hui,Faculty of Laboratory Medicine in Xinxiang Medical CollegeDr.Wang Hui,Faculty of Laboratory Medicine in Xinxiang Medical College亲和素（Avidin)耐热并耐受多种蛋白水解酶的作用，与生物素结合后稳定性更好。每个亲和素能结合四个分子的生物素。Dr.Wang Hui,Faculty of Laboratory Medicine in Xinxiang Medical C
4、ollegenBAS可用于微量抗原、抗体及受体的定量、定性检测及定位观察研究，也可制成亲和介质用于上述各类物质的纯化。nBAS的特点：灵敏度高、特异性强、稳定性好、适用于多种反应体系。Dr.Wang Hui,Faculty of Laboratory Medicine in Xinxiang Medical College第二节 生物素的理化性质与标记一、生物素及其活化 n生物素经活化后,可容易地与各种抗原、抗体、酶及核酸分子中相应基团偶联形成生物素化标记物。Dr.Wang Hui,Faculty of Laboratory Medicine in Xinxiang Medical Colle
5、ge几种常用于标记不同类型生物大分子的活化生物素的制备及特性。n标记蛋白质氨基的活化生物素 此种活化生物素的制备方法是将生物素与 N-羟基丁二酰胺在碳二亚胺的作用下进行缩和，生成生物素N-羟基丁二酰亚胺酯（BNHS)BNHS分子酯键中的-C=O 基团可与蛋白质分子中赖氨酸的氨基形成肽键，从而使蛋白质标记上生物素 Dr.Wang Hui,Faculty of Laboratory Medicine in Xinxiang Medical Collegen生物素的分子量较小，当与抗体或酶反应形成生物素标记结合物后，由于大分子蛋白的空间位阻效应(steric hindrance),可对生物素与亲和素
6、间的结合以及BAS的应用效果造成干扰。Dr.Wang Hui,Faculty of Laboratory Medicine in Xinxiang Medical Collegen长臂活化生物素(BCNHS)是在生物素和 N-羟基丁二酰亚胺之间添加了两个 6-氨基己糖分子基团，形成连结臂，使其与抗体、酶等生物大分子结合后，不受位阻效应的影响,更易发挥生物素的活性作用。Dr.Wang Hui,Faculty of Laboratory Medicine in Xinxiang Medical College(二)标记蛋白质醛基的活化生物素 用于此类标记的活化生物素有两种:n生物素酰肼(bioti
7、n hydrazine,BHZ)主要用于偏酸性糖蛋白的生物素标记 n肼化生物胞素(biocytin hydrazine,BCHZ)除可与蛋白质的醛基结合外，它还与 N-羟基丁二酰亚胺酯（BNHS）相同，能与蛋白质的氨基结合，因此其适用范围较BHZ宽。Dr.Wang Hui,Faculty of Laboratory Medicine in Xinxiang Medical College（三）标记蛋白质巯基的活化生物素 n3 (N 马来酰亚胺丙酰)-生物胞素 3-(N-maleimido-propiny)-biocytin,MPB 是能特异地与蛋白质巯基结合的活化生物素试剂 Dr.Wang H
8、ui,Faculty of Laboratory Medicine in Xinxiang Medical College（四）标记核酸的活化生物素 n活化生物素可通过缺口移位法、化学偶联法、光化学法及末端标记法等技术使生物素的戊酸侧链通过酰胺键与核酸分子相连,构成生物素标记的核酸探针。n光生物素(photobiotin)它是一种化学合成的生物素衍生物 n生物素脱氧核苷三磷酸 先将生物素与某种脱氧核苷酸连接成活化生物素nBNHS和BHZ二者均可以在一定条件下与核酸胞嘧啶分子中的 N4 氨基交联,使核酸分子生物素化。Dr.Wang Hui,Faculty of Laboratory Medici
9、ne in Xinxiang Medical College二、生物素标记蛋白质（一）生物素化蛋白质衍生物的特性 n一个蛋白质分子可联结多个生物素分子,从而使其具较高的比活性,在与亲和素的反应中成为多价。生物素化大分子的多价性,是 BAS 多级放大作用的物质基础。n生物素化蛋白质衍生物有二类,一种是生物素化的大分子生物活性物质(如抗原、抗体),另一种是标记材料(如酶)结合生物素后制成的标记物。Dr.Wang Hui,Faculty of Laboratory Medicine in Xinxiang Medical College(二)标记方法 n1.标记抗体、抗原 抗体是常用的生物活性大分子
10、物质。由于一个抗体分子可连接多个生物素分子,因此一个生物素化的抗体分子在反应时可与多个亲和素分子结合 n常用于标记抗体的活化生物素是 BNHS，但对于分子偏酸性的抗原,标记时多采用 BHZ。n2.标记酶 可标记HRP、半乳糖昔酶(-Gal)和碱性磷酸酶(AP)。Dr.Wang Hui,Faculty of Laboratory Medicine in Xinxiang Medical College(三)标记注意事项 n应根据抗原或抗体分子结构中所带可标记基团的种类(氨基、醛基或巯基)以及分子的理化性质(酸性、中性或碱性),选择相应的活化生物素和反应条件。n标记反应时,活化生物素与待标记抗原或
11、抗体应有适当的比例,使每个蛋白质分子上标记的生物素分子数量控制在一定范围,以免影响标记物的活性。Dr.Wang Hui,Faculty of Laboratory Medicine in Xinxiang Medical Collegen 为减少生物素标记蛋白质后,大分子物质造成的空间位阻影响,有利于生物素与亲和素的结合,可在生物素与被标记物间加入交联臂样结构。n生物素与抗原、抗体等蛋白质结合后,不影响后者的免疫活性；标记酶时则结果有不同,对 HRP、葡萄糖氧化酶和半乳糖苷酶,酶活性不受偶联生物素的干扰,但某些酶(如碱性磷酸酶)在标记生物素后,其活性会有一定程度降低。n Dr.Wang Hui
12、,Faculty of Laboratory Medicine in Xinxiang Medical College第三节 亲和素、链霉亲和素的理化性质与标记 一、亲和素及其活性n亲和素富含的色氨酸与其活性密切相关,是亲和素与生物素咪瞠环酬结合的基团。Dr.Wang Hui,Faculty of Laboratory Medicine in Xinxiang Medical College二、链霉亲和素及其活性 n链霉亲和素(streptavidin,SA)是由链霉菌分泌的一种蛋白质。链霉亲和素分子由 4 条相同的肽链组成,其氨基酸组成中,甘氨酸和丙氨酸的含量较大,而且结合生物素的活性基团也
13、是肽链中的色氨酸残基；链霉亲和素是一种稍偏酸性的蛋白质,并且不带任何糖基。Dr.Wang Hui,Faculty of Laboratory Medicine in Xinxiang Medical Collegen链霉亲和素分子中每条肽链都能结合一个生物素,因此与亲和素一样,一个链霉亲和素分子也能结合 4 个生物素分子。Dr.Wang Hui,Faculty of Laboratory Medicine in Xinxiang Medical College三、亲和素(或链霉亲和素)的标记 n几乎所有用于标记的物质均可以同亲和素(AV)或链霉亲合素(SA)结合。n最常用的是酶、异硫氨酸荧光素
14、(FITC)和胶体金。n亲和素或链霉亲和素均为大分子蛋白,其与酶的标记结合物的制备除可用普通酶标记蛋白 质分子的直接标记法外,由于其特有的与生物素结合的性能,还可以通过与生物素化酶复合物中的生物素结合,间接地与酶形成结合物。Dr.Wang Hui,Faculty of Laboratory Medicine in Xinxiang Medical College第四节 生物素-亲和素系统的应用 n生物素与亲和素间的结合亲和力高、特异性强,且各自均可以与各型大小分子偶联,以及二者在结合反应时具有的多级放大作用等优越性 Dr.Wang Hui,Faculty of Laboratory Medic
15、ine in Xinxiang Medical College一、生物素-亲和素系统基本类型及原理 nBAS 在应用中的基本类型有二种:一类以游离亲和素为中间物,分别连接包含生物素化大分子的待检反应体系和标记生物素,称为 BAB 法(biotin-avidin bind,BAB);后来又在此基础上 发展了亲和素-生物素化酶复合物技术(avidin-biotin-peroxidase complex,ABC).n 另一类是直接用标记亲和素连接生物素化大分子反应体系进行检测的 BA 法,或称标记亲和素生物素法(labeled avidin-biotin,LAB)。Dr.Wang Hui,Facul
16、ty of Laboratory Medicine in Xinxiang Medical CollegenBAB 法:也称为桥联亲和素-标记生物素法(bridged avidin-biotin technique,BRAB),是以游离的亲和素(或链霉亲和素)作为桥联剂,利用亲和素的多价性,将检测反应体系中抗原-生物素化抗体复合物与标记生物素(如酶标生物素)联结起来,达到检测反应分子的目的。Dr.Wang Hui,Faculty of Laboratory Medicine in Xinxiang Medical CollegenABC 法:是在 BAB 法基础上的改良,其原理是预先按一定比例
17、将亲和素(或链霉亲和素)与酶标生物素结合,形成可溶性的亲和素(或链霉亲和素)-生物素-过氧化物酶复合物(ABC 或 SABC)。当其与检测反应体系中的生物素化抗体(直接法)或生物素化第二抗体(间接法)相遇时,ABC(或 SABC)中未饱和的亲和素(或链霉亲和素)结合部位即可与抗体上的生物素结合,使抗原-抗体反应体系与 ABC(或 SABC)标记体系连成一体进行检测。Dr.Wang Hui,Faculty of Laboratory Medicine in Xinxiang Medical CollegenBA 法：是以标记亲和素(或链霉亲和素)直接与免疫复合物中的生物素化抗体连接进行检测。Dr
18、.Wang Hui,Faculty of Laboratory Medicine in Xinxiang Medical College二、生物素-亲和素系统在酶免疫测定中的应用 n生物素亲和素系统在ELISA中的应用：把 BAS与 EIISA偶联起来,可大大提高 ELISA 测定的灵敏度。nBAS与ELISA 偶联应用的形式有多种。如用于固相化抗体或抗原的制备,即是先将亲和素(或链霉亲和素)包被于固相载体,抗体或抗原也先与生物素结合,然后通过亲和素-生物素反应而使生物素化的抗体或抗原固相化。nBAS 亦可用于 ELISA 终反应的放大:用生物素化的抗体替代常规 ELISA 中的酶标抗体,然后
19、连接亲和素酶结合物(BA-ELISA)、或亲和素及酶标生物素或 ABC 试剂(ABC-ELISA),从而使反应信号放大,提高检测灵敏度。Dr.Wang Hui,Faculty of Laboratory Medicine in Xinxiang Medical College(二)生物素亲和素系统在均相酶免疫测定 nBAS 除了作为免疫测定的放大系统外,还可作为均相酶免疫测定(HEI)中高效的酶活性调变系统。n在BAS-HEI系统中,预先将作为配体的生物素与酶偶联,形成的生物素酶复合物具有完整的酶活性；亲和素作为特异的酶结合体(类似于抗体),可与生物素酶复合物结合。当生物素酶复合物与亲和素结合
20、后,酶因活性中心受空间位阻作用而失活。Dr.Wang Hui,Faculty of Laboratory Medicine in Xinxiang Medical College三、生物素-亲和素系统在荧光免疫技术中的应用 nBAS 用于荧光抗体技术,通常采用 BA 法,即用荧光素直接标记亲和素(或链霉亲和素)；也可采用游离亲和素(或链霉亲和素)搭桥,两端分别连接生物素化抗体和荧光素标记的生物素(BAB法)或荧光标记的抗亲和素(或链霉亲和素)抗体的夹心法。Dr.Wang Hui,Faculty of Laboratory Medicine in Xinxiang Medical College
21、四、生物素.亲和素系统在放射免疫测定中的应用 nBAS 主要与免疫放射分析(IRMA)检测体系偶联,用于对终反应的放大(BA 法):先将针对不同抗原决定簇的固相抗体和生物素化抗体与抗原(标准抗原和待测抗原)同时反应,在固相载体表面形成双抗体夹心免疫复合物；再加入125I标记的亲和素(或链霉亲和素)与复合物中的生 物素结合,最终使反应信号放大,进一步提高 IRMA 的灵敏度。Dr.Wang Hui,Faculty of Laboratory Medicine in Xinxiang Medical College五、生物素亲和素系统在分子生物学中的应用 n主要集中在以生物素标记核酸探针进行的定位检测,用 BAS 制备的亲和吸附剂进行基因的分离纯化以及将免疫测定技术与 PCR 结合建立免疫-PCR(immum-PCR)用于抗原的检测等三方面 Dr.Wang Hui,Faculty of Laboratory Medicine in Xinxiang Medical College思考题n试述ABC法的原理 n试述BABELISA夹心法测抗原的原理及过程n简述几种常用于标记不同类型生物大分子的活化生物素。
