1、细胞工程制药技术第二节第二节 细胞融合技术细胞融合技术（一）细胞融合（一）细胞融合（cell fusion)，又称体细胞杂交（somatic hybridiazation），是指两个或更多个相同或不同细胞通过膜 融合形成单个细胞的过程。一、细胞融合技术的建立和发展一、细胞融合技术的建立和发展uMuller于1838年观察到脊椎动的肿瘤细胞能在体内自发地融合产生多核的肿瘤细胞。uVirchow于1858年描述了正常组织、发炎组织以及肿瘤组织中的多核细胞现象。uLuginbuhl于1873年观察到天花病人的血液中也有多核的血细胞存在。uLange于1875年第一个观察到脊椎动物（蛙类）的血液细胞发
2、生融合的过程。uCienkawski(1876)、Buck(1877)、Geddes(1880)在无脊椎动中发现了细胞合并现象。u1958年日本学者冈田（Okada）发现仙台病毒具有触发动物细胞融合的效应。u1974年华裔加拿大学者高国楠创立了聚乙二醇（PEG）化学融合法。u1975年Kohler和Milstein成功地融合了小鼠B-淋巴细胞和骨髓瘤细胞而产生能分泌预定单克隆抗体的杂交瘤细胞。u20世纪80年代出现了电融合技术。（二）细胞融合研究进展（二）细胞融合研究进展生物种类生物种类细胞来源细胞来源成功年代成功年代烟草两个种间苷蓝青菜大豆马唐草矮牵牛龙面花大麦花生大麦大豆小麦矮牵牛油菜大豆
3、玉米大豆大豆野豌豆大麦蚕豆大豆草香木犀酵母菌鸡大豆烟草大豆秋水仙人胡萝卜番茄马铃薯人小鼠叶叶叶根愈伤组织叶叶花瓣种子种子叶悬浮细胞叶花瓣叶悬浮细胞叶悬浮细胞悬浮细胞悬浮细胞叶根悬浮细胞叶原生质体血红细胞悬浮细胞叶悬浮细胞叶腹水癌细胞原生质体叶根尖纤维肉瘤细胞畸胎瘤细胞197219721972197219721972197219721972197219721972197219721972197219721972几种细胞融合成功的例子几种细胞融合成功的例子植物融合细胞成长状态对比植物融合细胞成长状态对比,右瓶为地面融合的右瓶为地面融合的细胞，左瓶中为太空微重力环境下融合的细胞细胞，左瓶中为太空微重
4、力环境下融合的细胞 动物细胞融合实验使用的小白鼠 细胞融合的意义细胞融合的意义u理论上说任何细胞，都有可能通过体细胞杂交而成为新的生物资源。这理论上说任何细胞，都有可能通过体细胞杂交而成为新的生物资源。这 对于种质资源的开发和利用具有深远的意义。对于种质资源的开发和利用具有深远的意义。u融合过程不存在有性杂交过程中的种性隔离机制的限制，为远缘物种间融合过程不存在有性杂交过程中的种性隔离机制的限制，为远缘物种间 的遗传物质交换提供了有效途径。的遗传物质交换提供了有效途径。u体细胞杂交产生的杂种细胞含有来自双亲的核外遗传系统，在杂种的分体细胞杂交产生的杂种细胞含有来自双亲的核外遗传系统，在杂种的分
5、 裂和增殖过程中双亲的叶绿体、线粒体裂和增殖过程中双亲的叶绿体、线粒体DNA亦可发生重组，从而产生新亦可发生重组，从而产生新 的核外遗传系统。的核外遗传系统。u淋巴细胞杂交瘤和单克隆抗体的制备。淋巴细胞杂交瘤和单克隆抗体的制备。二、动物细胞融合和体细胞杂交二、动物细胞融合和体细胞杂交植物细胞融合过程植物细胞融合过程人造小鼠培育过程示意图人造小鼠培育过程示意图显微镜下细胞融合过程显微镜下细胞融合过程融合过程中两个细胞膜从彼此接触到破裂形成细胞桥的变化过程图解融合过程中两个细胞膜从彼此接触到破裂形成细胞桥的变化过程图解1、仙台病毒法、仙台病毒法仙台病毒诱导细胞融合经四个阶段：仙台病毒诱导细胞融合经
6、四个阶段：两种细胞在一起培养，加入病毒，在4条件下病毒附着在细胞 膜上。并使两细胞相互凝聚；在37中，病毒与细胞膜发生反应，细胞膜受到破环，此时需 要Ca2+和Mg2+细胞膜连接部穿通，周边连接部修复，此时需Ca2+和ATP；融合成巨大细胞，仍需ATP。（一）促进细胞融合的方法（一）促进细胞融合的方法病毒促使细胞融合的主要步骤如下：病毒促使细胞融合的主要步骤如下：两个原生质体或细胞在病毒黏结作用下彼此靠近；通过病毒与原生质体或细胞膜的作用使两个细胞膜间互相渗透，胞质互相渗透；两个原生质体的细胞核互相融合，两个细胞融为一体；进入正常的细胞分裂途径，分裂成含有两种染色体的杂种细胞。用灭活的病毒诱导
7、的动物细胞融合过程示意图用灭活的病毒诱导的动物细胞融合过程示意图 原生质体培养包括原生质体的分离、培养、植株再生等过程。本，同时也增加了疫苗的安全性。(5)可形成有性生殖障碍植物的种间杂种；1958年日本学者冈田（Okada）发现仙台病毒具有触发动物细胞融合的效应。(一)原生质体的制备：（5）加5ml 培养液，分别接种5个直径60mm平皿，每个平皿加培养Virchow于1858年描述了正常组织、发炎组织以及肿瘤组织中的多核细胞现象。(1)可实现远缘杂交，获得种间杂种，克服有性杂交配子不亲合性；四、微生物原生质体融合另外，PEG能增加类脂膜的流动性，也使细胞的核、细胞器发生融合成为可能。PEG诱
8、导融合的特点：其优点是融合成本低，勿需特殊设备；可以用各种组织和器官，但多应用叶片、愈伤组织及悬浮培养细胞。融合过程中两个细胞膜从彼此接触到破裂形成细胞桥的变化过程图解二步法是将材料先用果胶酶降解胞间胶层得到单细胞，再用纤维素酶脱壁而释放原生质体。（3）按1：5或1：10混合脾细胞和骨髓瘤细胞后，离心弃去上清，并以消毒滤纸吸胸腺嘧啶核苷激酶缺陷型（TK-）两个原生质体的细胞核互相融合，两个细胞融为一体；优点是易得，用法简单，融合效果稳定。一、细胞融合技术的建立和发展（5）加5ml 培养液，分别接种5个直径60mm平皿，每个平皿加培养u 优点是易得，用法简单，融合效果稳定。u聚乙二醇(PEG)结
9、构为：HOH2C（CH20CH2）nCH2OH，分子量大于 200小于6000者均可用作细胞融合剂。uPEG浓度以W/W；如将10克PEG与10mlEagLe氏液混合（假定1ml 培养液为1g重)，即成50PEG溶液。uPEG经高压灭菌后，与温热的Engle氏液混合。u通常用分子量低于1000的PEG作融合剂最好，50PEG溶液能产生 最多杂交细胞。uPEG溶液在pH6.0时细胞融合率最高。2、聚乙二醇（、聚乙二醇（PEG）法）法聚乙二醇（聚乙二醇（PEG）法细胞融合过程）法细胞融合过程PEG的作用机理的作用机理：Kao等认为，由于等认为，由于PEG分子具有分子具有轻微的负极性，故可以与具有正
10、极性基团的水、蛋白质轻微的负极性，故可以与具有正极性基团的水、蛋白质和碳水化合物等形成和碳水化合物等形成H键，从而在质膜之间形成分子桥，键，从而在质膜之间形成分子桥，其结果是使细胞质膜发生粘连进而促使质膜的融合；另其结果是使细胞质膜发生粘连进而促使质膜的融合；另外，外，PEG能增加类脂膜的流动性，也使细胞的核、细胞能增加类脂膜的流动性，也使细胞的核、细胞器发生融合成为可能。器发生融合成为可能。PEG诱导融合的特点诱导融合的特点：其优点是融合成本低，勿需特殊：其优点是融合成本低，勿需特殊设备；融合子产生的异核率较高；融合过程不受物种限制。设备；融合子产生的异核率较高；融合过程不受物种限制。其缺点
11、是融合过程繁琐，其缺点是融合过程繁琐，PEG可能对细胞有毒害。可能对细胞有毒害。聚乙二醇（聚乙二醇（PEG）法）法细胞融合步骤细胞融合步骤（1）将两种不同亲本细胞各5l06混匀；（2）离心沉淀，吸去上清液；（3）加1ml 50PEG溶液，用吸管吹打，使之与细胞接触1分钟；（4）加9ml 培养液，离心沉淀，吸去上清液；（5）加5ml 培养液，分别接种5个直径60mm平皿，每个平皿加培养 液至 5ml，37的CO2培养箱中培养。（6）624小时后，换成选择培养液筛选杂交细胞。3、电融合法、电融合法 电融合法是80年代出现的细胞融合技术，在直流电脉冲的诱导下，细胞膜表面的氧化还原电位发生改变，使异种
12、细胞粘合并发生质膜瞬间破裂，进而质膜开始连接，直到闭和成完整的膜，形成融合体。电融合法的优点：电融合法的优点：u融合率高、重复性强、对细胞伤害小；u装置精巧、方法简单、可在显微镜下观察或录像观察融合过程；u免去PEG诱导后的洗涤过程、诱导过程可控性强。电融合的基本过程：电融合的基本过程：细胞膜的接触：细胞膜的接触：当原生质体置于电导率很低的溶液中时，电场通当原生质体置于电导率很低的溶液中时，电场通电后，电流即通过原生质体而不是通过溶液，其结果是原生质体在电后，电流即通过原生质体而不是通过溶液，其结果是原生质体在电场作用下极化而产生偶极子，从而使原生质体紧密接触排列成串；电场作用下极化而产生偶极
13、子，从而使原生质体紧密接触排列成串；膜的击穿：膜的击穿：原生质体成串排列后，立即给予高频直流脉冲就可以原生质体成串排列后，立即给予高频直流脉冲就可以使原生质膜击穿，从而导致两个紧密接触的细胞融合在一起。使原生质膜击穿，从而导致两个紧密接触的细胞融合在一起。电融合诱导法原理示意图电融合诱导法原理示意图（二）杂交瘤技术（二）杂交瘤技术只针对某一抗原决定簇的抗体分子称为单克隆抗体只针对某一抗原决定簇的抗体分子称为单克隆抗体。单克隆抗体技术的核心是用骨髓瘤细胞单克隆抗体技术的核心是用骨髓瘤细胞(myeloma cell)与与经特定抗原免疫刺激的经特定抗原免疫刺激的B淋巴细胞淋巴细胞(antigen s
14、timulated B lymphoblast)融合得到杂交瘤细胞融合得到杂交瘤细胞(hybridoma cell)，杂交瘤，杂交瘤细胞既能像骨髓瘤细胞那样在体外无限增殖，又具有细胞既能像骨髓瘤细胞那样在体外无限增殖，又具有B淋巴细淋巴细胞产生特异性抗体的能力。因此，单克隆抗体技术又称为杂胞产生特异性抗体的能力。因此，单克隆抗体技术又称为杂交瘤技术交瘤技术(hybridoma technology）。）。对于种质资源的开发和利用具有深远的意义。200小于6000者均可用作细胞融合剂。(4)在脾中部切开一小口，用注射器芯从一端轻轻压挤，再用无血清培养液冲洗，形成愈伤组织，再形成胚状体。Virch
15、ow于1858年描述了正常组织、发炎组织以及肿瘤组织中的多核细胞现象。(5)可形成有性生殖障碍植物的种间杂种；（5）其他如葡聚糖硫酸酯、聚乙烯醇及电场诱导等融合方法。胸腺嘧啶核苷激酶缺陷型（TK-）需加入甘露醇、山梨醇、蔗糖、葡萄糖、葡萄糖硫酸酯、CaCl22H20(0.经后者染色，有细胞壁者发射绿色荧光。预质壁分离：17-20 酶液中静置半小时，再于2834保温，或将材料置于与酶液中糖浓度相同的溶液中预培养1h左右，再浸于酶液中消化即可达到质壁分离目的；1、骨髓瘤细胞选择及选择性培养基细胞壁再生及细胞分裂：细胞膜的接触：当原生质体置于电导率很低的溶液中时，电场通电后，电流即通过原生质体而不是
16、通过溶液，其结果是原生质体在电场作用下极化而产生偶极子，从而使原生质体紧密接触排列成串；膜的击穿：原生质体成串排列后，立即给予高频直流脉冲就可以使原生质膜击穿，从而导致两个紧密接触的细胞融合在一起。融合过程中两个细胞膜从彼此接触到破裂形成细胞桥的变化过程图解单抗药主要用于癌症和免疫性疾病的治疗。二步法是将材料先用果胶酶降解胞间胶层得到单细胞，再用纤维素酶脱壁而释放原生质体。（3）按1：5或1：10混合脾细胞和骨髓瘤细胞后，离心弃去上清，并以消毒滤纸吸在37中，病毒与细胞膜发生反应，细胞膜受到破环，此时需(1)引颈处死小鼠，用酒精消毒体表；Niels K.Jerne G.Kohler C.Mil
17、stein 杂交瘤技术的基本原理杂交瘤技术的基本原理杂交瘤细胞的制备杂交瘤细胞的制备1、骨髓瘤细胞选择及选择性培养基、骨髓瘤细胞选择及选择性培养基骨髓瘤细胞本身不能分泌抗体骨髓瘤细胞本身不能分泌抗体选择次黄嘌呤鸟嘌呤转磷酸核糖激酶缺陷型（选择次黄嘌呤鸟嘌呤转磷酸核糖激酶缺陷型（HGPRT-）胸腺嘧啶核苷激酶缺陷型（胸腺嘧啶核苷激酶缺陷型（TK-）HAT培养基培养基次黄嘌呤（hypoxanthine，H）氨基喋呤（aminopterin，A）胸腺嘧啶脱氧核苷（thymidine，T）次黄嘌呤鸟嘌呤转磷酸核糖激酶缺陷型（次黄嘌呤鸟嘌呤转磷酸核糖激酶缺陷型（HGPRT-）胸腺嘧啶核苷激酶缺陷型（胸腺
18、嘧啶核苷激酶缺陷型（TK-）2、免疫小鼠、免疫小鼠 免疫程序是取68周龄BalbC雌鼠，基础免疫2周，静脉再加强免疫一次，35天后用于融合。免疫时是否采用佐剂和事先处理抗原，要依抗原性的强弱而定。一般来讲可溶性抗原用完全佐剂效果较好。抗原量同样与抗原强弱有关，以IgG为例，第一次为100g，第二次为50g，免疫途径第一次可经腹腔注射。对于细胞性抗原不用佐剂，每次腹腔注射1l06一1107。3、脾细胞的制备、脾细胞的制备(1)(1)引颈处死小鼠，用酒精消毒体表；引颈处死小鼠，用酒精消毒体表；(2)(2)无菌条件下取出脾脏，剃除结缔组织和脂肪，用无菌条件下取出脾脏，剃除结缔组织和脂肪，用5ml5m
19、l无血清培养液冲洗一次；无血清培养液冲洗一次；(3)(3)把脾脏置于已消毒的把脾脏置于已消毒的9090一一100100目不锈钢网或尼龙纱网中；目不锈钢网或尼龙纱网中；(4)(4)在脾中部切开一小口，用注射器芯从一端轻轻压挤，再用无血清培养液冲洗，在脾中部切开一小口，用注射器芯从一端轻轻压挤，再用无血清培养液冲洗，令细胞通过纱网，收集入平皿中，或用注射器向脾脏内注入令细胞通过纱网，收集入平皿中，或用注射器向脾脏内注入3ml3ml无血清培养无血清培养 液，反复抽吸数次方法获取细胞，再制成细胞悬液亦可；液，反复抽吸数次方法获取细胞，再制成细胞悬液亦可；(5)(5)把细胞悬液注入把细胞悬液注入50ml
20、50ml离心管中，加离心管中，加l0l0一一20ml20ml培养液：轻轻吹打数次，室温中培养液：轻轻吹打数次，室温中 置置5 5分钟；分钟；(6)(6)离心离心(800(800一一10001000转分转分)计数、备用。计数、备用。4、细胞准备、细胞准备（1 1）收集骨髓瘤细胞，用无血清培养液洗）收集骨髓瘤细胞，用无血清培养液洗3 3次次(37)(37)，计数活力细胞，计数活力细胞(不少于不少于9090)；（2 2）收集小鼠脾细胞，用无血清培养液洗）收集小鼠脾细胞，用无血清培养液洗3 3次次(37)(37)，并计细胞数和测定活力细胞；，并计细胞数和测定活力细胞；（3 3）按）按1 1：5 5或或
21、1 1：1010混合脾细胞和骨髓瘤细胞后，离心弃去上清，并以消毒滤纸吸混合脾细胞和骨髓瘤细胞后，离心弃去上清，并以消毒滤纸吸 净多余上清。净多余上清。5、细胞融合、细胞融合(1)将1ml 40的PEG液一滴滴加入列细胞团中，在60秒内加完，同时并不断轻微 转动离心管或用手指轻弹离心管；(2)在不断转动离心管中加1ml无血清培养液，60秒钟内加完；(3)于5分钟内慢慢加完20ml无血清培养液；此时细胞对机械损伤非常敏感，(4)离心(800转分，8分钟)，去上清，用完全培养液10ml悬浮，轻轻混匀；(5)取96孔板，每孔加50l；(6)取等体积细胞悬液，向另一96孔板中加50 l；(7)送入5CO
22、2，温箱中37培养，24小时后更换成HAT选择性培养掖。6、融合后细胞培养、融合后细胞培养(1)融合后710天用HAT培养液半量换液(留一半旧的加一半新的)后每隔23天 半量换液一次；(2)两周后可改用HA培养液半量换液，或仍用HAT培养液；(3)23周后出现杂交细胞集落，细胞个大、圆且透明；(4)待集落增殖生长至13孔时，应进行抗体检测。HAT培养基培养基次黄嘌呤（hypoxanthine，H）氨基喋呤（aminopterin，A）胸腺嘧啶脱氧核苷（thymidine，T）次黄嘌呤鸟嘌呤转磷酸核糖激酶缺陷型（次黄嘌呤鸟嘌呤转磷酸核糖激酶缺陷型（HGPRT-）胸腺嘧啶核苷激酶缺陷型（胸腺嘧啶核
23、苷激酶缺陷型（TK-）7、抗体检测、抗体检测免疫荧光试验放射免疫试验(RIA)联免疫吸附试验(ELISA)至2012年，Biogen（Nasdaq:BIIB）、安进（Nasdaq:AMGN）和UCB（布鲁塞尔证券交易市场：UCB.胸腺嘧啶核苷激酶缺陷型（TK-）半纤维素酶，如Rhozyme HP150，用于悬浮细胞、豆科根瘤、幼苗子叶及根细胞原生质体的分离;(4)在脾中部切开一小口，用注射器芯从一端轻轻压挤，再用无血清培养液冲洗，(1)引颈处死小鼠，用酒精消毒体表；需加入甘露醇、山梨醇、蔗糖、葡萄糖、葡萄糖硫酸酯、CaCl22H20(0.需加入甘露醇、山梨醇、蔗糖、葡萄糖、葡萄糖硫酸酯、CaC
24、l22H20(0.（2）离心沉淀，吸去上清液；进入正常的细胞分裂途径，分裂成含有两种染色体的杂种细胞。(一)原生质体的制备：腹水癌细胞原生质体当愈伤组织达到12mm时，转移至分化培养基上诱导器官分化。通过一定方法除去细胞壁，而得到一个裸露的植物细胞，即为原生质体(Protoplast)。PEG经高压灭菌后，与温热的Engle氏液混合。（三）原生质体培养的目的：聚乙二醇（PEG）法细胞融合步骤但由于植物细胞具有坚硬的细胞壁，不能直接融合，需经酶消化除去细胞壁释放出原生质体，后者生理、生化及遗传学特性与完整细胞基本相同。单抗药主要用于癌症和免疫性疾病的治疗。8、单克隆抗体的大量制备、单克隆抗体的大
25、量制备体内法体内法培养法培养法单克隆抗体的应用单克隆抗体的应用单克隆抗体具有高度的特异性与灵敏性，可以广泛地用于临床医学的疾病单克隆抗体具有高度的特异性与灵敏性，可以广泛地用于临床医学的疾病 诊断，以提高疾病诊断的准确性。诊断，以提高疾病诊断的准确性。利用单克隆抗体技术可以生产各种免疫疫苗，这不仅能大大降低生产成利用单克隆抗体技术可以生产各种免疫疫苗，这不仅能大大降低生产成 本，同时也增加了疫苗的安全性。本，同时也增加了疫苗的安全性。单克隆抗体还有可能用于某些肿瘤的治疗，是人类战胜癌症十分有望的潜单克隆抗体还有可能用于某些肿瘤的治疗，是人类战胜癌症十分有望的潜 在技术。在技术。单克隆抗体技术还
26、可广泛用于各种基础医学研究，从而推动现代医学的不单克隆抗体技术还可广泛用于各种基础医学研究，从而推动现代医学的不 断发展。断发展。人源单克隆抗体人源单克隆抗体主要困难主要困难（1）缺乏合适的人骨髓瘤细胞株作为融合亲本。现有的细胞株大多是融合率不高，杂交瘤抗体产生水平低，而且细胞不稳定，易丧失抗体分泌能力；（2）获得抗原特异的人B淋巴细胞十分困难，因为对人来说，高度免疫获得抗原特异的B淋巴细胞的方法显然是不可行的；（3）大量繁殖杂交瘤细胞以获得所需量的抗体，鼠类杂交瘤可通过小鼠腹腔接种杂交瘤细胞诱生腹水达到这一目的，但是人杂交瘤细胞在鼠类中诱生腹水是很困难的。单克隆抗体工业化生产及应用单克隆抗体
27、工业化生产及应用 单克隆抗体的生产包括细胞培养、提纯和制剂等工艺。单克隆抗体的生产包括细胞培养、提纯和制剂等工艺。作为治疗药品应用的单克隆抗体则必须采用生物反应作为治疗药品应用的单克隆抗体则必须采用生物反应器，大规模培养杂交瘤细胞。器，大规模培养杂交瘤细胞。单克隆抗体药物：单克隆抗体药物：19861986年，美国年，美国FDAFDA批准了第一个批准了第一个单克隆抗体药物上市，距今已经整整单克隆抗体药物上市，距今已经整整2020多年了。截多年了。截止到现在，全世界共有止到现在，全世界共有2121个治疗用抗体药物被批准个治疗用抗体药物被批准上市，实现上市，实现200200亿美元的销售额，在国际，也
28、在国内亿美元的销售额，在国际，也在国内形成了抗体药物开发热潮。形成了抗体药物开发热潮。单克隆抗体工业化生产及应用单克隆抗体工业化生产及应用 单抗药主要用于癌症和免疫性疾病的治疗。现在有单抗药主要用于癌症和免疫性疾病的治疗。现在有5 5大大单抗药物占据了单抗药物占据了80%80%的市场份额，其中罗氏制药的市场份额，其中罗氏制药RocheRoche和和基因泰克（基因泰克（NYSE:DNANYSE:DNA）联合开发上市的单抗药物有）联合开发上市的单抗药物有3 3个，个，分别为分别为AvastinAvastin、HerceptinHerceptin和和RituxanRituxan；另外还有雅培公司；另
29、外还有雅培公司（NYSE:ABTNYSE:ABT）的）的HumiraHumira和强生公司（和强生公司（NYSE:JNJNYSE:JNJ）的）的RemicadeRemicade。5 5大单抗药主宰市场的趋势到大单抗药主宰市场的趋势到20122012年不会发年不会发生太大的变化，仍将占有生太大的变化，仍将占有70%70%的市场。至的市场。至20122012年，年，BiogenBiogen（Nasdaq:BIIBNasdaq:BIIB）、安进（）、安进（Nasdaq:AMGNNasdaq:AMGN）和）和UCBUCB（布鲁塞尔证券交易市场：（布鲁塞尔证券交易市场：UCB.BRUCB.BR）也将有单
30、抗药）也将有单抗药物上市。物上市。三、植物原生质体融合和体细胞杂交三、植物原生质体融合和体细胞杂交 植物原生质培养和细胞融合可用产生远植物原生质培养和细胞融合可用产生远缘杂种；缘杂种；是目前植物细胞及基因工程的核心技术。是目前植物细胞及基因工程的核心技术。植物原生质体培养植物原生质体培养 通过一定方法除去细胞壁，而得到一个裸露通过一定方法除去细胞壁，而得到一个裸露的植物细胞，即为原生质体的植物细胞，即为原生质体(Protoplast)。游离。游离的原生质体像正常的植物细胞那样具有全能性，的原生质体像正常的植物细胞那样具有全能性，在一定条件下培养可以重新再生出完整植株。在一定条件下培养可以重新再
31、生出完整植株。自自19701970年首次获得烟草原生质体再生植株年首次获得烟草原生质体再生植株成功以来，通过原生质体获得再生植株的植物成功以来，通过原生质体获得再生植株的植物约有约有280280余种，其中有余种，其中有2020种为我国首先报道。种为我国首先报道。原生质体培养包括原生质体的分离、培养、原生质体培养包括原生质体的分离、培养、植株再生等过程。植株再生等过程。(一一)原生质体的制备：原生质体的制备：1、材料来源与预处理：、材料来源与预处理：（1）材料来源：）材料来源：可以用各种组织和器官，但多应用叶片、可以用各种组织和器官，但多应用叶片、愈伤组织及悬浮培养细胞。以及茎尖、根愈伤组织及悬
32、浮培养细胞。以及茎尖、根尖、子叶和胚性组织。尖、子叶和胚性组织。（2）预处理：预处理：A.预质壁分离预质壁分离：17-20 酶液中静置半小时，再于酶液中静置半小时，再于2834保温，或将材料置于与酶液中糖浓度相同的溶液中预培养保温，或将材料置于与酶液中糖浓度相同的溶液中预培养1h左右，再浸于酶液中消化即可达到质壁分离目的；左右，再浸于酶液中消化即可达到质壁分离目的；B.预培养预培养:将除去下表皮的叶片于诱导愈伤组织培养基上将除去下表皮的叶片于诱导愈伤组织培养基上培养培养7天，再用酶消化去壁，所得原生质体分裂频率较高；天，再用酶消化去壁，所得原生质体分裂频率较高；C.暗处理暗处理:将室温下生长将
33、室温下生长57个星期的植物材料在黑暗中个星期的植物材料在黑暗中放置放置30h以上，取其叶片制备的原生质体有活力；以上，取其叶片制备的原生质体有活力；D.D.光处理光处理:将叶片于日光或灯光下照射将叶片于日光或灯光下照射26h令其萎蔫，利令其萎蔫，利于撕除下表皮及原生质体分离；于撕除下表皮及原生质体分离；E.E.低温处理低温处理:夏季应用的实验材料其萌动种子应于夏季应用的实验材料其萌动种子应于4过夜过夜后再播种，从其植株叶片上分离的原生质体培养效果较佳。后再播种，从其植株叶片上分离的原生质体培养效果较佳。2.制备原生质体的酶类：制备原生质体的酶类：高等植物细胞壁主要成分为高等植物细胞壁主要成分为
34、a-纤维素，其次为半纤维纤维素，其次为半纤维素、果胶质及蛋白质。细胞生长的不同阶段及不同物种素、果胶质及蛋白质。细胞生长的不同阶段及不同物种的细胞壁组成与结构不同，木质化及次生加厚的细胞壁的细胞壁组成与结构不同，木质化及次生加厚的细胞壁不被酶消化，故选择材料和消化细胞壁的酶类是制备原不被酶消化，故选择材料和消化细胞壁的酶类是制备原生质体关键。生质体关键。常用的酶类有：常用的酶类有：A.纤维素酶，如纤维素酶，如Onozuka R10及及RS，国内常用的为，国内常用的为EA3867，其中含少量果胶酶；，其中含少量果胶酶；B.果胶酶，如果胶酶，如Macerozyme R10 又叫离析酶，主要含又叫离
35、析酶，主要含果胶酶，活力较高，其含杂酶较多，用量不超过果胶酶，活力较高，其含杂酶较多，用量不超过2，作，作用时间长有毒害作用；此外亦用用时间长有毒害作用；此外亦用Pectalyase Y23，也叫，也叫离析软化酶，活力极高，叶片用量一般为离析软化酶，活力极高，叶片用量一般为01，悬浮，悬浮细胞为细胞为005；C.崩溃酶（崩溃酶（Driselase)，为一种粗酶制剂，具有纤维素酶，为一种粗酶制剂，具有纤维素酶及果胶酶活性；及果胶酶活性；D.半纤维素酶，如半纤维素酶，如Rhozyme HP150，用于悬浮细胞、豆，用于悬浮细胞、豆科根瘤、幼苗子叶及根细胞原生质体的分离科根瘤、幼苗子叶及根细胞原生质
36、体的分离;E 蜗牛酶，主要用于体细胞原生质体分离。蜗牛酶，主要用于体细胞原生质体分离。酶液配制：酶液配制：需加入甘露醇、山梨醇、蔗糖、葡萄糖、葡萄糖硫酸酯、需加入甘露醇、山梨醇、蔗糖、葡萄糖、葡萄糖硫酸酯、CaCl22H20(0.1mmol/l一一10mo1l)及及KH2PO4(0.75mmol/l)等渗透稳定剂，以维持原生质体完整性。等渗透稳定剂，以维持原生质体完整性。3原生质体分离及纯化原生质体分离及纯化（1）分离：）分离：原生质体分离有机械法及酶消化法，原生质体分离有机械法及酶消化法，前者产量极低而不多用、后者又分一步法及二步法。前者产量极低而不多用、后者又分一步法及二步法。一步法是将材
37、料在一步法是将材料在2l一一28用纤维素酶及果胶酶用纤维素酶及果胶酶混合液一次性处理混合液一次性处理224h。二步法是将材料先用果胶酶降解胞间胶层得到单二步法是将材料先用果胶酶降解胞间胶层得到单细胞，再用纤维素酶脱壁而释放原生质体。细胞，再用纤维素酶脱壁而释放原生质体。（2）纯化）纯化 A.沉降法沉降法:原生质体混合物经微孔过滤后，低速原生质体混合物经微孔过滤后，低速（150g）离心）离心5min,沉淀再用与酶液具相同糖浓度溶沉淀再用与酶液具相同糖浓度溶液反复洗液反复洗3-4次，后用培养液洗涤备用；次，后用培养液洗涤备用；B.飘浮法飘浮法:离心法纯化的原生质体若含较多碎片及离心法纯化的原生质体
38、若含较多碎片及少量老细胞时可用少量老细胞时可用20蔗糖离心，原生质体浮于蔗糖离心，原生质体浮于液面碎片及老细胞沉降而得以纯化，纯度高，但液面碎片及老细胞沉降而得以纯化，纯度高，但产量低；产量低；C.不连续梯度离心法：将原生质粗提液置于不连续不连续梯度离心法：将原生质粗提液置于不连续浓度梯度的溶液中，经离心后分离不同比重的原生浓度梯度的溶液中，经离心后分离不同比重的原生质体。质体。4原生质体活力测定原生质体活力测定 纯化的原生质体需经活力测定后方可用于培养。纯化的原生质体需经活力测定后方可用于培养。（1）根据形态特征判断其活力：原生质体呈绿色）根据形态特征判断其活力：原生质体呈绿色（若来源于叶片
39、）及圆而鼓者为活原生质体。（若来源于叶片）及圆而鼓者为活原生质体。（2）荧光染料活体染色法：荧光素染料可自由透过）荧光染料活体染色法：荧光素染料可自由透过细胞膜，在细胞内被酯酶水解为荧光素，后者不能自细胞膜，在细胞内被酯酶水解为荧光素，后者不能自由透过细胞膜而滞留于细胞内，在荧光显微镜下根据由透过细胞膜而滞留于细胞内，在荧光显微镜下根据荧光强度即可判断原生质体死活。荧光强度即可判断原生质体死活。（3）酚藏花红染色法：活原生质体能吸收呈红色，）酚藏花红染色法：活原生质体能吸收呈红色，无活性的则不能吸收而无色。无活性的则不能吸收而无色。（二）原生质体培养：（二）原生质体培养：1.培养方法：培养方法
40、：（1）固体培养：平板培养法，）固体培养：平板培养法，1.2%琼脂。琼脂。（2）液体培养：）液体培养：A.浅层培养法浅层培养法:其过程是将其过程是将1mL原生质体悬液置原生质体悬液置于直径于直径4cm培养皿或培养皿或25mL三角瓶中使成薄层后于培三角瓶中使成薄层后于培养箱中培养初期振摇养箱中培养初期振摇12次，防止粘壁；次，防止粘壁；B.固液结合培养法：在混好原生质体的固体培养固液结合培养法：在混好原生质体的固体培养基表面加一层相同成分的液体培养基进行培养。效基表面加一层相同成分的液体培养基进行培养。效果较好。果较好。2.培养条件：培养条件：密度：密度：平板培养平板培养103104个个/ml,
41、液体培养液体培养104105个个/ml温度：温度：多数为多数为25-28 oC,少数少数1637 oC光照：光照：500 lx,18h 或或2800 lx 连续光照连续光照 多数要求黑暗或弱光多数要求黑暗或弱光3.细胞壁再生及细胞分裂：细胞壁再生及细胞分裂：l-3天即再生新细胞壁，表现为体积增加、膨大，再天即再生新细胞壁，表现为体积增加、膨大，再由圆变椭圆。可用质壁分离法证实。也可用由圆变椭圆。可用质壁分离法证实。也可用0.1%ST型型或或WBL型荧光增白剂染色，经前者染色，有细胞壁者型荧光增白剂染色，经前者染色，有细胞壁者在荧光显微镜下呈蓝色荧光。经后者染色，有细胞壁者在荧光显微镜下呈蓝色荧
42、光。经后者染色，有细胞壁者发射绿色荧光。发射绿色荧光。在原生质培养过程中，胞质增加，液泡减少，叶绿在原生质培养过程中，胞质增加，液泡减少，叶绿体或颗粒内含物分散于泡质中或围绕于细胞核周围常体或颗粒内含物分散于泡质中或围绕于细胞核周围常在在1一一2周内发生第一次分裂。不同细胞分裂频率不同。周内发生第一次分裂。不同细胞分裂频率不同。4、愈伤组织或胚状体形成、愈伤组织或胚状体形成 原生质体再生的细胞一旦开始分裂，就可能继续原生质体再生的细胞一旦开始分裂，就可能继续生长：生长：A 形成细胞团，发育成愈伤组织；形成细胞团，发育成愈伤组织；B.形成胚状体，再产生植株；形成胚状体，再产生植株；C.形成愈伤组
43、织，再形成胚状体。形成愈伤组织，再形成胚状体。随着细胞分裂及细胞团形成，已与常规细胞和随着细胞分裂及细胞团形成，已与常规细胞和组织培养相同，故培养组织培养相同，故培养34周需添加含一定量低渗周需添加含一定量低渗稳定剂的新培养基，以满足细胞的营养，亦利于细稳定剂的新培养基，以满足细胞的营养，亦利于细胞团及小愈伤组织的生长。胞团及小愈伤组织的生长。5.植株再生植株再生 大多经愈伤组织诱导分化再生为完整植株。当愈伤大多经愈伤组织诱导分化再生为完整植株。当愈伤组织达到组织达到12mm时，转移至分化培养基上诱导器官分时，转移至分化培养基上诱导器官分化。分化培养基与原生质体培养基差别在于：化。分化培养基与
44、原生质体培养基差别在于：(1)只用蔗糖为碳源，不加渗透稳定剂；只用蔗糖为碳源，不加渗透稳定剂；(2)与原生质体培养基相反，细胞分裂素浓度高于生长与原生质体培养基相反，细胞分裂素浓度高于生长素素;(3)在诱导器官分化过程中，一般采用在诱导器官分化过程中，一般采用15001x左右的高左右的高光强。诱导器官分化的温度与原生质体培养基本相同。光强。诱导器官分化的温度与原生质体培养基本相同。（三）（三）原生质体培养的目的：原生质体培养的目的：1、利用原生质体不具细胞壁的特性可以进行细胞器移、利用原生质体不具细胞壁的特性可以进行细胞器移植和外源物的摄取，原生质体之间可以进行融合而产生植和外源物的摄取，原生
45、质体之间可以进行融合而产生杂种细胞杂种细胞(即体细胞杂交）。即体细胞杂交）。2、是植物基因工程的理想受体，用外源遗传物质对植、是植物基因工程的理想受体，用外源遗传物质对植物原生质体进行改造和转化，然后诱导分裂、分化再生物原生质体进行改造和转化，然后诱导分裂、分化再生出能育的完整基因工程植株。出能育的完整基因工程植株。3、也是研究细胞生物学、分子生物学、体细胞无性系、也是研究细胞生物学、分子生物学、体细胞无性系变异和植物病理学研究的有用工具。变异和植物病理学研究的有用工具。A-E,培养的欧当归培养的欧当归(Levisticum officinale Koch)原生质体分裂再生成植株的过程原生质体
46、分裂再生成植株的过程A-D当归当归(Angelica sinensis(Oliv)Diels)原生质体培养成再生苗原生质体培养成再生苗 E-H,红豆草红豆草(Onobrychis vicaefolia Scop)原生质体培养再生植株原生质体培养再生植株 在外界因素作用下，两个或两个以上植物细在外界因素作用下，两个或两个以上植物细胞合并成一个多核细胞的过程称为植物细胞融合，胞合并成一个多核细胞的过程称为植物细胞融合，或植物体细胞杂交。但由于植物细胞具有坚硬的或植物体细胞杂交。但由于植物细胞具有坚硬的细胞壁，不能直接融合，需经酶消化除去细胞壁细胞壁，不能直接融合，需经酶消化除去细胞壁释放出原生质体
47、，后者生理、生化及遗传学特性释放出原生质体，后者生理、生化及遗传学特性与完整细胞基本相同。在适当条件下来源不同的与完整细胞基本相同。在适当条件下来源不同的植物原生质体可产生融合作用，并可再生细胞壁，植物原生质体可产生融合作用，并可再生细胞壁，形成完整植株。形成完整植株。1、作用：、作用：(1)可实现远缘杂交，获得种间杂种，克服有性可实现远缘杂交，获得种间杂种，克服有性杂交配子不亲合性；杂交配子不亲合性；(2)可获得含另一亲本非整倍体杂种或胞质杂种，可获得含另一亲本非整倍体杂种或胞质杂种，且获得的遗传变异范围极广；且获得的遗传变异范围极广；(3)一次操作可实现两个以上亲本的融合作用一次操作可实现
48、两个以上亲本的融合作用(4)可获得呈现双亲个体基因型总和的杂种；可获得呈现双亲个体基因型总和的杂种；(5)可形成有性生殖障碍植物的种间杂种；可形成有性生殖障碍植物的种间杂种；2.促融因素：促融因素：（1）NaNO3诱导，诱导，NaNO3 可中和原生质体表面负电荷，可中和原生质体表面负电荷，促进原生质体聚集，对原生质体无损害，但融合率低；促进原生质体聚集，对原生质体无损害，但融合率低；（2）高）高Ca2和高和高pH值诱导；值诱导；（3）PEG（聚乙二醇）诱导，在高浓度（聚乙二醇）诱导，在高浓度PEG溶液中，原溶液中，原生质体发生聚集作用，经稀释后，生质体发生聚集作用，经稀释后，50以上原生质体发
49、生以上原生质体发生融合作用；融合作用；（4）高高Ca2+、高、高pH值及值及PEG结合诱导法。结合诱导法。（5）其他如葡聚糖硫酸酯、聚乙烯醇及电场诱导等融合其他如葡聚糖硫酸酯、聚乙烯醇及电场诱导等融合方法。方法。融合过程：融合过程：高密度混合高密度混合2X105个个/ml3.影响融合的因素：影响融合的因素：PEG,高高Ca2+高高pH处理时间。处理时间。4.杂种细胞的筛选：杂种细胞的筛选：（1）遗传互补筛选）遗传互补筛选（2）抗性互补筛选）抗性互补筛选（3）机械筛选）机械筛选5、杂种植株的选择：可利用形态、细、杂种植株的选择：可利用形态、细胞、生化及分子手段鉴定胞、生化及分子手段鉴定四、微生物原生质体融合（一）标记菌种筛选和稳定性鉴定营养缺陷型菌株选择性培养基高渗溶液保存杂种细胞增加稳定性
