1、第四章 免疫荧光细胞化学技术免疫荧光细胞化学技术(immunofluorescence cytochemistry)采用荧光素标记的已知抗体或抗原作为探针，检测待测细胞或组织内的靶抗原或抗体，形成带有荧光素的抗原抗体复合物。利用荧光显微镜观察标本，根据组织细胞中荧光物质的存在，确定抗原或抗体的性质并定位，以及利用定量技术测定含量。免疫荧光细胞化学技术包括荧光抗体法和荧光抗原法荧光抗体法：荧光抗原法：用荧光抗体示踪或检查相应抗原的方法。较常用用已知的荧光抗原标记物示踪或检查相应抗体的方法。荧光抗体法+荧光抗原法=免疫荧光细胞（组织）技术?免疫荧光细胞化学方法：直接法、间接法?免疫荧光染色标本制备
2、：涂片、印片、细胞单层培养物、组织切片片经适当固定后染色，或不固定直接染色。主要内容一、荧光的特征二、荧光素三、荧光素标记抗体的方法四、荧光抗体的质量鉴定五、免疫荧光组化染色方法六、荧光显微镜七、非特异性荧光的消除方法八、免疫荧光细胞化学的对照染色一、荧光的特征分子都含有电子，电子在不停地运动着。根据量子理论，运动着的电子可以处于一系列不连续的能量状态中，电子遵守一定的规则，要以从一个能级向另一能级跃迁，并伴随着与能级差相对应的特定能量的吸收或释放。激发:当电子吸收能量跃迁到较高能级，这个过程叫激发。发射:以辐射方式跃迁时，能量转化成相应波长的光，这个过程叫发射。?荧光(fluorescenc
3、e)跃迁到激发态的电子，大多处于单重激发态。如果电子直接从单重激发态以辐射方式跃迁到基态，由于单重激发态很不稳定，半衰期很短，发射持续的时间也很短，这种发射光，叫荧光。即指一个分子或原子吸收了给予的能量后即刻引起发光，停止能量供给，发光也瞬时停止(一般持续lO-7lO-8s)。二 荧光素能够产生荧光并能作为染料的化合物称为荧光素；必须具备：吸收激发光的光能并发射荧光。1 具备用于标记抗体的荧光素条件(1)应具有与蛋白质分子形成共价键的化学基团，结合后不易离解，而未结合的色素及其降解产物易排除。(2)荧光效率高，与蛋白质结合后荧光素质量下降不多。(3)标记后对抗体的免疫学性质和生化性质无影响。(
4、4)结合方法简便而快速，并且较稳定。(5)荧光素容易溶解，溶解后不会和其他物质发生化学反应。(6)荧光颜色与背景组织的自发荧光颜色对比鲜明，能清晰判断结果。2 荧光素的种类：呈黄色、橙黄或褐黄色粉末或结晶，性质稳定，在室温下能保存2年以上，在低温中可保存多年。易溶于水和酒精。呈现黄绿色荧光。在碱性条件下，FITC的异硫氰酸基在水溶液中与免疫球蛋白的自由氨基经碳酰胺化而形成硫碳氨基键,成为标记荧光免疫球蛋白，即荧光抗体。一个IgG分子最多能标记15-20个FITC分子(1)异硫氰酸荧光素(FITC)最大吸收光谱：490495nm，最大发射光谱：520530nm。分子量：389.4KD?(2)四乙
5、基罗达明(RB200)褐红色粉末，不溶于水，易溶于酒精和丙酮，性质稳定，可长期保存。呈明亮橙红色荧光。RB200在五氯化磷(PCl5)作用下转变成磺酰氯，在碱性条件下易与蛋白质的赖氨酸一氨基反应结合而标记在蛋白分子上。最大吸收光谱:570nm最大发射光谱:596600nm分子量：580KD(3)四甲基异硫氰酸罗达明(TMRITC)紫红色粉末，罗达明的衍生物，易溶于水，性质较稳定。呈橙红色荧光，与FITC的黄绿色荧光对比清晰，与蛋白质结合方式同FITC。它可用于双标记示踪研究。最大吸收光谱:550nm最大发射光谱:620nm(4)4-乙酰胺-4-异硫氰酸-2-硫酸芪（SITS）-蓝色荧光(5)得
6、克萨斯红（Texas red）(6)藻红素R(7)花青（Cyanine,Cy2,Cy3,Cy5）?四、荧光抗体的质量控制主要进行特异性和敏感性两个方面的鉴定。1 特异性染色效价测定-与相应抗原标本染色2 非特异性染色测定-与相类似抗原标本染色3 吸收试验-在荧光抗体中加入过量抗原，吸收后再用相应抗原标本染色，结果无明显阳性荧光。4 F/P比值的测定方法F（荧光素）和P（抗体蛋白）的克分子比值反映荧光抗体的特异性染色质量，F/P=1-2，过高-非特异染色增强；过低-荧光很弱，降低敏感性。荧光抗体的保存?0-4或或-20低温保存，防止抗体活性降低和蛋白变性；低温保存，防止抗体活性降低和蛋白变性；小
7、量分装；真空干燥后更易长期保存。五、荧光抗体染色方法适用标本：涂片、印片、细胞单层培养物或组织切片，经适当固定或不固定；方法：直接法、间接法1 直接法（1）基本原理用已知特异性抗体与荧光素结合，制成荧光特异性抗体，直接与细胞或组织中相应抗原结合，在荧光显微镜下即可见抗原存在部位呈现特异性荧光。特点：适合做细菌、螺旋体、原虫、真菌及浓度较高的蛋白质抗原如肾、皮肤的检查和研究。但一种荧光抗体只能检查一种抗原，敏感性较低阴性对照：采用正常血清染色，结果为阴性。2 间接法（1）基本原理先用未标记特异性抗原与细胞或组织内抗体反应，再用此抗原的特异性荧光抗体与结合在细胞内抗体上的抗原相结合，抗原夹在细胞抗
8、体与荧光抗体之间，故称夹心法。优点：只需制备一种荧光抗体可检出多种抗原，敏感性较高，能解决一些不易制备动物免疫血清的病原体（麻疹）等的研究和检查，广泛应用于自身抗体和感染病人血清的检验。缺点：非特异性着色机会较多，染色时间长。阴性对照：用正常血清代替一抗，其余步骤同上。结果荧光处即阳性细胞分布部位。4 双重免疫荧光染色法适用：在同一细胞组织标本上需要同时显示两种抗原。方法：如A抗原的抗体-FITC 标记，B抗原的抗体-RB200标记。(1)一步双染法将两种标记抗体按适当比例混合（A+B)；直接法进行染色反应。(2)二步双染法先用RB200标记的B抗体,不必洗去；再用FITC标记的A抗体染色；按
9、间接法进行。结果：A抗原呈黄绿色荧光；B抗原呈桔红色荧光。5 膜抗原荧光抗体染色方法?原理和步骤：直接法或间接法；适用：可对活细胞在试管内进行染色，常用于T和B细胞、细胞培养物、瘤细胞抗原、受体等。结果：阳性荧光主要在细胞膜上。?六、荧光显微镜检查方法1 荧光显微镜超高压光源、滤板系统(包括激发和压制滤板)、光学系统和摄影系统等主要部件组成，是利用一定波长的光激发标本发射荧光。（1）光源光源的亮度应根据荧光素的类型选择。小功率汞灯可满足激励一般荧光染料的要求。（2）滤板系统：包括激发滤片，阻断滤片、隔热滤片，分光镜和其他中性滤片。是荧光显微镜的重要组成部分，是获得特定波长光，清晰的荧光影像和发
10、挥显微镜最佳性能之关键。了解滤片性能，正确地选择滤片是观察荧光效应的前提和必要条件。荧光显微镜的滤片系统激励法U分光镜DM400激发滤光片BP330-385BP360-370BP400-410截止滤光片BA420用途自动荧光观察法，DAPI(联脒基吲哚)：DNA Hoechest 33358,33342 染色体VDM455BA455儿茶酚胺观察BVDM455BP400-440BP420-440BA475芥子喹吖因；染色体硫磺素S：淋巴细胞吖淀黄素：核酸BDM500BP450-480BP470-490BP420-480BA515异硫氰酸荧光素：荧光抗体观察吖啶橙：DNA，RNA金胺结核杆菌IBD
11、M505PB460-490BP470-BA515IF?3 使用荧光显微镜注意事项?(1)应在暗室中进行检查。汞灯点燃5-15min，光源稳定后观察；(2)防止紫外线对眼睛的损害。在调整光源时应戴上防护眼镜；(3)检查时间每次以12h为宜，超过90min，超高压汞灯强度最多不超2-3h;?逐渐下降，荧光减弱；标本在紫外线照射3-5min后，荧光减弱；(4)荧光显微镜光源寿命有限，标本应集中检查，以节省时间，荧光显微镜光源寿命有限，标本应集中检查，以节省时间，保护光源。光源关闭后必须在保护光源。光源关闭后必须在30min后才能再启动光源，一天中后才能再启动光源，一天中应避免数次点燃光源；应避免数次
12、点燃光源；(5)标本染色后应立即观察。4 荧光图像的记录方法?荧光图像：具有形态学特征、荧光的颜色和亮度荧光显微镜摄影：基本同普通显微镜摄影技术高速感光胶片如ASA200以上或24 以上以上半自动或全自动显微摄影系统装置，或CCD与计算机联接，将图像存在软盘上?缺点：紫外光对荧光猝灭作用大（如FITC标记物，紫外光照射30s，荧光亮度降低50%），曝光速度要求高。?七、非特异性染色的产生产生的原因：（1）部分荧光素未与蛋白质结合，形成了聚合物和衍化物.（2）抗体以外的血清蛋白与荧光素结合形成荧光素脲蛋白，可与组织成分结合。（3）组织中还可能存在类属抗原与相应抗体结合。（4）制备的免疫血清中混杂
13、抗其他组织成分的抗体。（5）抗体分子上标记的荧光素分子太多，过量标记的抗体分子带过多的阴离子，可吸附于正常组织上而呈现非特异性染色。（6）荧光素不纯，标本固定不当等。八、免疫荧光细胞化学的对照染色为了排除某些非特异性染色，保证免疫荧光细胞化学染色的准确性，必须在初次试验时进行以上对照试验，从而检测抗原与抗体的结合是否是特异的。常用对照如下：阳性对照阴性对照自发荧光对照1 阳性对照用已知存在某相应抗原组织标本染色，结果为阳性2 阴性对照(1)空白细胞对照(2)抑制实验用未标记荧光素的抗体与标本内相应靶抗原反应，然后再加入用荧光素标记的相同抗体进行染色反应，结果应为阴性。(3)抗原对照用确知不存在某相应抗原的标本染色。3 自发荧光对照标本只加PBS或不加PBS。结 束
