1、导师：李泽庚导师：李泽庚 教授教授清肺解毒饮对两种老龄大鼠肺炎模型作用机理的对比研究n研究生：张开宇研究生：张开宇汇报内容 一、研究目标 二、研究方案 三、技术路线 四、预期成果 五、年度研究计划及预期进展 六、经费预算研究目标 本研究基于气虚血瘀，易感外邪，毒损肺络是老年肺炎的致病理论，结合多年的肺气虚证和我院长期应用清肺解毒饮治疗老年肺炎实践所展示的疗效优势,按照中医药规律开展肺炎链球菌和肺炎克雷伯菌老龄大鼠模型的清肺解毒、益气活血，“菌毒并治”，清补并用干预治疗的对比研究，宏观与微观相结合，体内和体外相结合，阐明清肺解毒饮治疗老龄大鼠肺炎模型作用机理，为中医药治疗老年肺炎奠定新的理论基础
2、。1、提出气虚是老年肺炎的始动和根本因素，外感六淫是发病诱因，痰阻血瘀是重要病理产物；气虚血瘀，易感外邪，毒损肺络是老年肺炎的主要病理过程。气虚血瘀、感邪痰阻是肺炎发病、治疗、预后的关键因素。提出以清肺解毒化痰、益气活血散瘀为治法，“菌毒并治”、清补并用的治疗老年肺炎新思路新思路。2、本课题率先开展中药复方干预治疗老龄大鼠肺炎模型的探索性研究，通过对比观察肺炎链球菌和肺炎克雷伯菌老龄大鼠模型的肺部炎性病灶影像改变、肺组织病理改变、肺组织炎症因子调节，阐明基于“菌毒并治”法干预治疗老龄大鼠肺炎模型的作用机理，开创中医药干预治疗老年肺炎研究的新方法新方法。创新点研究方案1 实验药物 清肺解毒饮：取
3、人参，金银花，桑白皮，贯众，柴胡，栝楼，丹皮，虎杖、玉竹等中药饮片（安徽中医学院第一附属医院提供）加水，煎煮三次，过滤，合并滤液，浓缩至每毫升含生药0.819g的药液，置4冰箱中保存备用。2、实验试剂2.1 水合氯醛(2509/瓶):由北京北化精细化学品有限责任公司提供，批号:20070328，使用时配置成25%溶液。2.2肺炎链球菌和肺炎克雷伯菌：分别由我院细菌室临床分离并经API细菌鉴定系统鉴定。分别营养琼脂斜面存种，4冰箱保存;使用前接种于普通牛肉汤培养基内，置37恒温箱内增殖48小时，用无菌生理盐水稀释适当浓度(2.4X109FU/ml)并计数。实验中细菌的培养和菌液的准备由我微生物室
4、协助完成研究方案2.3 多聚甲醛分析纯(500g/瓶)：由北京化学试剂公司提供，批号:980107。用时配成4%的多聚甲醛固定液。方法为:多聚甲醛40g置于二角烧瓶中，加入500-800ml 0.lmol/L的PBS溶液中，力热至60左右，缓慢搅拌，使粉末完全溶解，通常需要Na0H溶液助溶，最后用0.1mol/L的PBS溶液加至1000ml，充分混匀，冷藏保存备用。2.4 肿瘤坏死因子(TNF-a)、Y干扰素(IFN-Y)、白细胞介素-6(IL-6)、白细胞介素-8(IL-8)、白细胞介素-10(IL-10)、ELISA试剂盒由R&D公司国内分装批号:201012。研究方案3、主要仪器 生化培
5、养箱；可见紫外分光光度计；精密天平；数字移液器；型冷冻离心机；显微镜及显微照相系统；离心机；六孔水浴锅；隔水式电热恒温培养箱;净化工作台;电热手提压力蒸气消毒器等。研究方案4 方法4.1老龄大鼠肺炎模型建立4.1.1 建立老龄大鼠肺炎模型的标准参照Yershov等分别采用肺炎链球菌、肺炎克雷伯菌气管内注入，肺炎大鼠模型成功的判定标准如下:1)临床诊断标准:体温40;气管内脓性分泌物;呼吸困难和气促,唇、舌、耳出现紫绀。当以上4项出现3项时判断为阳性。2)放射学标准:进行性肺部浸润性病变;空洞形成;胸腔积液。至少1项出现为阳性。研究方案3)实验室标准:肺功能损害;PaO2/fiO211 000或
6、4 000/连续2d;支气管肺泡灌洗液细胞数1103/L。3项中至少出现2项认为是阳性。4)微生物学标准:至少1个标本中细菌含量1104CFU/g肺组织;支气管肺泡灌洗液中 细菌浓度1104CFU/mL。以上2项任意1项出现认为是阳性。5)肉眼观察标准:至少1个肺叶损伤评分3，至少1个胸膜腔出现渗出或纤维蛋白沉积。至少出现项为阳性。6)组织学标准:至少1个标本在毛细血管和邻近的肺泡区域出现多核白细胞的聚集。肺组织肉眼观察评分标准为:正常,0分；疤痕,1分;轻度充血,2分;红色度,分;灰色度,4分;黄色度,5分。研究方案4.1.2 建立老龄大鼠肺炎模型的方法 选用SD老龄大鼠20-22月龄，体重
7、560g士90g经口咽滴入气管法腹腔注射(0.2-0.25)ml0.65%的戊巴比妥钠使大鼠麻醉，并经上中切牙点悬吊。用一接注射器的钝圆针头经口插入气管，分别滴入40L约含有107CFU处于对数生长期的肺炎链球菌、肺炎克雷伯菌混悬液(在滴入时堵住鼻孔)，使接种物入肺。急性肺炎很快诱导成功,1-4h后即出现菌血症,未治疗的小鼠2-3d死亡，死亡时肺组织匀浆细菌计数超过108CFU/mL。并通过肺炎大鼠模型建立判定标准证实肺炎模型建立成功。研究方案4.2 实验动物分组：将140只（SPF级）SD老龄雄性大鼠随机分为7组，分别为正常对照组、肺炎链球菌老龄大鼠模型组、肺炎克雷伯菌老龄大鼠模型组及两种模
8、型治疗的清肺解毒饮高、低剂量组(分别简称肺链高、低剂量组和肺克高、低剂量组)。每组均20只。4.3实验给药与剂量：按上述方法造模后给药，每组给药剂量均根据大鼠体重按成人一日剂量折算按公式大鼠等效剂量(mg/kg)=折算系数成人剂量(mg/kg)计算出大鼠等效剂量：中药：8.19 g/kg，中药高、低剂量组分别给予中药46、11.5 g/(kgd)灌胃;正常对照组和两种老龄大鼠肺炎模型组分别灌以生理盐水。连续给药3天，然后分组分批处死肺炎老龄模型大鼠。每日观察小鼠的生存率、死亡率、体重、体温的变化至感染后14 d。4.4观察指标与检测方法4.4.1一般指标观察接种后动物的临床表现包括实验大鼠的神
9、态、毛色、摄食、饮水、活动等情况的变化；体重、肛温测定，并做好记录；观察生存时间、死亡时间及死亡数，对各组大鼠的死亡情况进行登记；4.4.2各组外周血象和支气管肺泡灌洗液(BALS)白细胞和中性粒细胞计数；4.4.3实验前后大鼠肺部X线。研究方案4.4.4 肺指数的测定 将大鼠处死，解剖取肺,准确称质量,计算肺指数、肺指数抑制率。小鼠肺质量/g肺指数=；小鼠体质量/g (对照组肺指数均值-治疗组肺指数均值)肺指数抑制率=-100%对照组肺指数均值4.4.5光学显微镜检查：肺组织经梯度酒精系列脱水、浸蜡、石蜡包埋、切片、HE染色，显微镜下观察各组肺炎老龄大鼠肺组织病理形态学改变并照相;4.4.6
10、肺组织TNF-、IFN-Y、IL-6、IL-10等炎性因子的测定;研究方案研究方案5、统计分析实验数据采用SPSS 160软件进行统计学分析。计量资料以均值标准差(x珋s)表示，多组间差异采用单因素方差分析(one-way ANOVA)，两两组间比较用LSD法;计数资料用2检验统计，P005为有显著性差异。技术路线 预期成果 1、阐明清肺解毒饮对两种老龄大鼠肺炎模型的肺部炎性病灶影像学改变、肺组织病理改变、肺组织炎症因子调节三者变化的相关性；“菌毒并治”法运用清肺解毒饮治疗老龄大鼠肺炎模型的作用机理，形成研究技术报告。2、发表国内核心期刊论文4-6篇；3、申报成果1项。年度研究计划及预期进展（1）2012年8月2012年12月文献查新，完善研究方案和研究方法；订购实验动物、相关试剂；（2）2013年1月2013年12月动物实验；相关指标检测；数据初步处理，发表阶段性研究论文2篇；参加全国性学术活动一次并进行大会交流；（3）2014年1月2014年8月实验资料的全面整理、实验数据分析、总结，完成研究技术报告；发表学术论文2-4篇。经费预算 科研业务费2.1x线检查、病理光镜观察、炎症因子检测，文献检索、查询、方案论证、论文发表版面费等 实验材料费0.7实验动物及饲养、试剂 仪器设备费0.1实验仪器、设备使用费 协作费 0.1指标检测协作费 合 计3.0谢 谢敬请各位专家指正
