1、蛋白质免疫印迹技术Ppt一、免疫学一、免疫学n研究抗原物质的结构和功能；研究抗原物质的结构和功能；n免疫应答产物的结构和功能；免疫应答产物的结构和功能；n抗原刺激机体产生免疫应答的规律。抗原刺激机体产生免疫应答的规律。n免疫学的研究范围很广，与很多相关学科交织在免疫学的研究范围很广，与很多相关学科交织在一起，并且发展成了很多学科，如免疫生物学、一起，并且发展成了很多学科，如免疫生物学、免疫遗传学、血液免疫学、肿瘤免疫学等。免疫遗传学、血液免疫学、肿瘤免疫学等。n随着免疫生物学的发展，人们发现在高等动物体随着免疫生物学的发展，人们发现在高等动物体内存在着具有免疫功能的组织结构（即免疫系统内存在着
2、具有免疫功能的组织结构（即免疫系统）。）。淋巴组织淋巴组织免疫活性细胞免疫活性细胞免疫活性介质免疫活性介质免疫系统功能的生理和病理表现免疫系统功能的生理和病理表现功能名称功能名称 生理功能生理功能 病理表现病理表现免疫防御免疫防御 清除病原微生物及其它抗原性异物清除病原微生物及其它抗原性异物 超敏反应（强）超敏反应（强）免疫缺陷病（弱）免疫缺陷病（弱）免疫自稳免疫自稳 清除损伤或衰老细胞清除损伤或衰老细胞 自身免疫性疾病自身免疫性疾病免疫监视免疫监视 清除突变或畸变细胞清除突变或畸变细胞 防止肿瘤发生防止肿瘤发生 肿瘤或病毒持续性肿瘤或病毒持续性 杀伤病毒感染细胞杀伤病毒感染细胞 感染感染n当
3、外源异体物质，如细菌、病毒、蛋白质、多当外源异体物质，如细菌、病毒、蛋白质、多糖等进入动物机体后，可以激活机体免疫系统糖等进入动物机体后，可以激活机体免疫系统，产生对外源物质的排除作用，从而保护机体，产生对外源物质的排除作用，从而保护机体免受外源物质的侵害。免受外源物质的侵害。n机体的这一特异免疫应答功能的细胞基础是淋机体的这一特异免疫应答功能的细胞基础是淋巴细胞。巴细胞。n免疫应答的类型免疫应答的类型（一）固有性免疫应答（一）固有性免疫应答（innate immune response)innate immune response)又称先天性免疫应答，非特异性免疫应答：是机体又称先天性免疫应
4、答，非特异性免疫应答：是机体在种系发育和进化过程中形成的免疫防御功能。在种系发育和进化过程中形成的免疫防御功能。（二）适应性免疫应答（二）适应性免疫应答（adaptive immune responseadaptive immune response）又称获得性免疫应答，特异性免疫应答，是机体出又称获得性免疫应答，特异性免疫应答，是机体出生后通过与抗原物质接触后所产生的一系列防御功能。生后通过与抗原物质接触后所产生的一系列防御功能。（具有特异性、多样性、记忆性、耐受性、自限性）（具有特异性、多样性、记忆性、耐受性、自限性）（1）抗原与佐剂的混合：取1.免疫途径有多种多样，如静脉内、腹腔内、肌肉
5、内、皮内、皮下、淋巴结内注射等。如要获得大量的抗体，多采用大动物；第二次加强免疫后一周，即可采血，收集抗血清。一般常用皮下或背部多点皮内注射，每点注射0.目前实践中常应用的佐剂福氏佐剂。然后与能特异性识别待检蛋白的抗体进行反应；常见的抗原有蛋白质、多糖、磷脂、脂多糖、结合蛋白质、核酸、激素等有机物。一抗杂交：初级抗体（第一抗体）是特异性的。常用的实验动物为羊、家兔、豚鼠和鼠等。辣根过氧化物酶法（HRP）效价测定的方法常用的是单向扩散免疫法，此法对所有的抗体均适用。辣根过氧化物酶EC 1.目前实践中常应用的佐剂福氏佐剂。效价 抗血清的效价，就是指血清中所含抗体的浓度或含量。是一种将高分辨率凝胶电
6、泳和免疫化学分析技术相结合的杂交技术。免疫扩散试验2mL），贮于-20以下冰箱保存。存在于血清、体液中，是构成机体免疫作用的主要物质。将通过PAGE分离的蛋白质转移到NC膜或PVDF膜上；抗原和免疫原性抗原和免疫原性n抗原（抗原（antigensantigens，AgAg）是指能够刺激机体免疫活性细）是指能够刺激机体免疫活性细胞产生抗体或致敏淋巴细胞，并在体内或体外发生特胞产生抗体或致敏淋巴细胞，并在体内或体外发生特异性反应的物质。异性反应的物质。n常见的抗原有蛋白质、多糖、磷脂、脂多糖、结合蛋常见的抗原有蛋白质、多糖、磷脂、脂多糖、结合蛋白质、核酸、激素等有机物。白质、核酸、激素等有机物。n
7、抗原具有两方面的特性：免疫原性（抗原具有两方面的特性：免疫原性（immunogenicityimmunogenicity）和免疫反应性（）和免疫反应性（immunoreactivityimmunoreactivity）。）。q免疫原性（免疫原性（immunogenicityimmunogenicity）是指抗原刺激机体引起免疫应）是指抗原刺激机体引起免疫应答的能力。答的能力。q免疫反应性（免疫反应性（immunoreactivityimmunoreactivity）是指抗原与相应免疫应答）是指抗原与相应免疫应答产物产物(即抗体即抗体)在体内或体外发生特异性结合反应的能力在体内或体外发生特异性结
8、合反应的能力。抗原的分类抗原的分类n抗原可以分为完全抗原和半抗原。抗原可以分为完全抗原和半抗原。n完全抗原：具有免疫原性和免疫反应性的抗原称完全抗原：具有免疫原性和免疫反应性的抗原称为完全抗原（为完全抗原（complete antigencomplete antigen）n半抗原：只具有免疫反应性而无免疫原性的抗原半抗原：只具有免疫反应性而无免疫原性的抗原称为半抗原（称为半抗原（haptenhapten），也称为不完全抗原），也称为不完全抗原(incomplete antigen)(incomplete antigen)。与蛋白质结合后成为完。与蛋白质结合后成为完全抗原。半抗原能与相应的抗体或
9、致敏淋巴细胞全抗原。半抗原能与相应的抗体或致敏淋巴细胞发生特异性结合反应。绝大多数多糖和所有类脂发生特异性结合反应。绝大多数多糖和所有类脂都属于半抗原。都属于半抗原。将通过PAGE分离的蛋白质转移到NC膜或PVDF膜上；收集的血液置于室温下1h左右，凝固后，置4下，过夜（切勿冰冻）析出血清，离心，4000rpm,10min。1ml/cm2的量加入加入一抗溶液与滤膜温育。Westernblotting 检测抗血清5mL完全佐剂混合，震荡混匀，制成油包水的形态2mL，34点注射。二、印迹法（blotting）可发生于体内（in vivo），也可发生于体外（in vitro）。固定：蛋白质进行聚丙烯
10、酰胺凝胶电泳（PAGE）并从胶上转移到硝酸纤维素膜上。第二部分 Westernblotting 检测抗血清第二部分 Westernblotting 检测抗血清（八）抗血清质量的评价（3）皮下多点注射，每点注射量应小于0.2mL），贮于-80以下冰箱，或冻干后贮存于4冰箱保存。二抗杂交：第二抗体或配体试剂对于初级抗体是特异性结合并作为指示物。5mg/mL菠萝蛋白酶以0.二、印迹法（blotting）存在于血清、体液中，是构成机体免疫作用的主要物质。抗体的种类抗体的种类n抗体（抗体（antibodiesantibodies，Ab)Ab)是专门对抗抗原特异是专门对抗抗原特异结构的球蛋白，故也称为免疫
11、球蛋白（结构的球蛋白，故也称为免疫球蛋白（immunoglobulins,Ig)immunoglobulins,Ig)。存在于血清、体液中。存在于血清、体液中，是构成机体免疫作用的主要物质。，是构成机体免疫作用的主要物质。n免疫球蛋白依据其理化性质及生化性质的不同免疫球蛋白依据其理化性质及生化性质的不同，分为五种类型：，分为五种类型：IgGIgG、IgAIgA、IgMIgM、IgDIgD和和IgEIgE。n人体血清中人体血清中IgGIgG含量最多，含量最多，IgAIgA次之，次之，IgMIgM较较少，少，IgDIgD和和IgEIgE微量。微量。n抗原抗体反应（抗原抗体反应（antigen-an
12、tibody reactionantigen-antibody reaction）n是指抗原与相应抗体之间所发生的特异性结合反应。可发是指抗原与相应抗体之间所发生的特异性结合反应。可发生于体内（生于体内（in vivoin vivo），也可发生于体外（），也可发生于体外（in vitroin vitro）。）。n体内反应可介导吞噬、溶菌、杀菌、中和毒素等作用；体内反应可介导吞噬、溶菌、杀菌、中和毒素等作用；n体外反应：可出现凝集反应、沉淀反应、补体参与的反应体外反应：可出现凝集反应、沉淀反应、补体参与的反应及中和反应等各种不同的反应类型。及中和反应等各种不同的反应类型。n因抗体主要存在于血清中
13、，在抗原或抗体的检测中多采用因抗体主要存在于血清中，在抗原或抗体的检测中多采用血清作试验，所以体外抗原抗体反应亦称为血清学反应（血清作试验，所以体外抗原抗体反应亦称为血清学反应（serologic reactionserologic reaction）。）。二、印迹法（二、印迹法（blotting）n印迹法是指将样品转移到固相载体上，而后利用相应印迹法是指将样品转移到固相载体上，而后利用相应的探测反应来检测样品的一种方法。的探测反应来检测样品的一种方法。n19751975年，年，SouthernSouthern建立了将建立了将DNADNA转移到硝酸纤维素膜（转移到硝酸纤维素膜（NCNC膜）上，
14、并利用膜）上，并利用DNADNARNARNA杂交检测特定的杂交检测特定的DNADNA片段的片段的方法，称为方法，称为Southern Southern 印迹法。印迹法。n人们用类似的方法，对人们用类似的方法，对RNARNA和蛋白质进行印迹分析，对和蛋白质进行印迹分析，对RNARNA的印迹分析称为的印迹分析称为NorthernNorthern印迹法，对单向电泳后的印迹法，对单向电泳后的蛋白质分子的印迹分析称为蛋白质分子的印迹分析称为WesternWestern印迹法，对双向电印迹法，对双向电泳后蛋白质分子的印迹分析称为泳后蛋白质分子的印迹分析称为EasternEastern印迹法印迹法三、蛋白免
15、疫印三、蛋白免疫印迹迹的应用的应用n免疫印迹法免疫印迹法 (immunoblotting test,IBT)，亦称酶联，亦称酶联免疫电转移印斑法免疫电转移印斑法(enzyme linked immunoelectrotransfer blot,EITBn是一种将高分辨率凝胶电泳和免疫化学分析技术是一种将高分辨率凝胶电泳和免疫化学分析技术相结合的杂交技术。相结合的杂交技术。n具有分析容量大、敏感度高、特异性强等优点。具有分析容量大、敏感度高、特异性强等优点。n是检测蛋白质特性、表达与分布的一种最常用的是检测蛋白质特性、表达与分布的一种最常用的方法。方法。蛋白质免疫印迹检测技术蛋白质免疫印迹检测技
16、术一、实验目的一、实验目的二、实验原理二、实验原理三、实验仪器三、实验仪器四、操作步骤四、操作步骤五、实验结果与分析五、实验结果与分析六、思考题六、思考题一、实验目的一、实验目的n学习掌握动物抗血清的制备原理及技术学习掌握动物抗血清的制备原理及技术n通过实际操作学会动物抗血清的制备通过实际操作学会动物抗血清的制备n掌握掌握WesternWesternblottingblotting的基本原理的基本原理 n熟悉熟悉WesternWesternblottingblotting的实验操作的实验操作 二、实验原理二、实验原理n第一部分第一部分 动物的常规免疫及抗血清的制备动物的常规免疫及抗血清的制备n
17、第二部分第二部分 WesternWesternblotting blotting 检测抗血清检测抗血清 n将适当的抗原物质注入动物体内，经过一定时间，动将适当的抗原物质注入动物体内，经过一定时间，动物血清中可出现大量特异性抗体，这种含抗体的血清物血清中可出现大量特异性抗体，这种含抗体的血清称为免疫血清。称为免疫血清。n优质免疫血清的产生，主要取决于抗原的纯度和免疫优质免疫血清的产生，主要取决于抗原的纯度和免疫原性，以及动物应答的能力。此外，尚需考虑免疫途原性，以及动物应答的能力。此外，尚需考虑免疫途径、抗原剂量、注射次数、时间间隔、有无佐剂等因径、抗原剂量、注射次数、时间间隔、有无佐剂等因素。
18、素。第一部分第一部分 动物的常规免疫及抗血清的制备动物的常规免疫及抗血清的制备（一）多克隆抗体的概念（一）多克隆抗体的概念n抗原通常是由多个抗原决定簇组成的。抗原通常是由多个抗原决定簇组成的。n由一种抗原决定簇刺激机体，由一个由一种抗原决定簇刺激机体，由一个B B淋巴细胞接淋巴细胞接受该抗原所产生的抗体称之为单克隆抗体（受该抗原所产生的抗体称之为单克隆抗体（Monoclone antibodyMonoclone antibody）。）。n由多个抗原决定簇刺激机体，相应地就产生各种由多个抗原决定簇刺激机体，相应地就产生各种各样的单克隆抗体，这些单克隆抗体混杂在一起各样的单克隆抗体，这些单克隆抗体
19、混杂在一起就是多克隆抗体。就是多克隆抗体。n机体内所产生的抗体就是多克隆抗体。机体内所产生的抗体就是多克隆抗体。抗体的结构抗体的结构（二）用于免疫的动物（二）用于免疫的动物n由于动物的遗传性不同，同一抗原对不同动物由于动物的遗传性不同，同一抗原对不同动物或同种不同品系动物、或不同个体，产生特异或同种不同品系动物、或不同个体，产生特异免疫应答的强弱是不同的。因此，进行动物免免疫应答的强弱是不同的。因此，进行动物免疫时，必须选择对该抗原敏感的、年轻的健康疫时，必须选择对该抗原敏感的、年轻的健康动物。动物。n常用的实验动物为羊、家兔、豚鼠和鼠等。一常用的实验动物为羊、家兔、豚鼠和鼠等。一般为般为6
20、6个月大小的动物。个月大小的动物。简单快速封闭非特异性抗体结合掌握Westernblotting的基本原理抗体（antibodies，Ab)是专门对抗抗原特异结构的球蛋白，故也称为免疫球蛋白（immunoglobulins,Ig)。2mL），贮于-80以下冰箱，或冻干后贮存于4冰箱保存。是一种将高分辨率凝胶电泳和免疫化学分析技术相结合的杂交技术。体内反应可介导吞噬、溶菌、杀菌、中和毒素等作用；某些由大分子（如蛋白类）抗原所产生的抗体，可用双扩散等方法测定。防止肿瘤发生 肿瘤或病毒持续性二抗杂交：第二抗体或配体试剂对于初级抗体是特异性结合并作为指示物。由于动物的遗传性不同，同一抗原对不同动物或同
21、种不同品系动物、或不同个体，产生特异免疫应答的强弱是不同的。底物显色：被适当保温后的酶标记蛋白质区带，产生可见的、不溶解状态的颜色反应。苦味酸（以75%乙醇配置）标记小鼠5mL不完全佐剂混合震荡混匀，制成油包水的形态。将通过PAGE分离的蛋白质转移到NC膜或PVDF膜上；免疫学的研究范围很广，与很多相关学科交织在一起，并且发展成了很多学科，如免疫生物学、免疫遗传学、血液免疫学、肿瘤免疫学等。封闭非特异性抗体结合麻烦体内反应可介导吞噬、溶菌、杀菌、中和毒素等作用；佐剂主要可分为两种：一种本身具有免疫原性，如百日咳杆菌、抗酸杆菌（结核分枝杆菌）以及革兰阴性杆菌等；（一）固有性免疫应答（innate
22、 immune response)只有在对抗血清的效价、特异性、亲合力等方面作彻底的评价后，才可使用所取得的抗血清。可发生于体内（in vivo），也可发生于体外（in vitro）。n动物种类的选择主要根据抗原的生物学特性和所要获得动物种类的选择主要根据抗原的生物学特性和所要获得抗血清数量。抗血清数量。q如要获得大量的抗体，多采用大动物；如要获得大量的抗体，多采用大动物；q如要是获得直接标记诊断的抗体，则直接采用本动物；如要是获得直接标记诊断的抗体，则直接采用本动物；q如要获得间接的标记诊断用抗体，则必须用异源动物制备如要获得间接的标记诊断用抗体，则必须用异源动物制备抗体；抗体；q如果难以获
23、得的抗原，且抗体的需要量少，则可以采用纯如果难以获得的抗原，且抗体的需要量少，则可以采用纯系小鼠制备。系小鼠制备。n一般实验室采用的抗体，多用兔和羊制备，因动物反应一般实验室采用的抗体，多用兔和羊制备，因动物反应良好，而且能够提供足够数量的血清。良好，而且能够提供足够数量的血清。（三）抗原（三）抗原n抗原是多种多样的，就其化学成分而言，有蛋白抗原是多种多样的，就其化学成分而言，有蛋白质抗原、类脂抗原、多糖类抗原和核酸抗原等。质抗原、类脂抗原、多糖类抗原和核酸抗原等。n为了获得较好的抗血清，最好是选用蛋白质抗原为了获得较好的抗血清，最好是选用蛋白质抗原。n不同的抗原，其免疫原性的强弱均不相同，这
24、种不同的抗原，其免疫原性的强弱均不相同，这种免疫原性的强弱取决于抗原的分子量、化学活性免疫原性的强弱取决于抗原的分子量、化学活性基团、立体结构等。基团、立体结构等。（四）免疫途径（四）免疫途径n免疫途径有多种多样，如静脉内、腹腔内、肌肉免疫途径有多种多样，如静脉内、腹腔内、肌肉内、皮内、皮下、淋巴结内注射等。内、皮内、皮下、淋巴结内注射等。n一般常用皮下或背部多点皮内注射，每点注射一般常用皮下或背部多点皮内注射，每点注射0.1mL0.1mL左右。左右。n实验中实验中0.2mL0.2mL，3 34 4点注射。点注射。n皮下注射皮下注射（五）佐剂（五）佐剂n应用佐剂的目的是为了提高抗原对机体的应用
25、佐剂的目的是为了提高抗原对机体的免疫原性，从而提高抗体的效价。免疫原性，从而提高抗体的效价。n佐剂主要可分为两种：一种本身具有免疫佐剂主要可分为两种：一种本身具有免疫原性，如百日咳杆菌、抗酸杆菌（结核分原性，如百日咳杆菌、抗酸杆菌（结核分枝杆菌）以及革兰阴性杆菌等；另一种本枝杆菌）以及革兰阴性杆菌等；另一种本身无免疫原性，如氢氧化铝、磷酸钙、矿身无免疫原性，如氢氧化铝、磷酸钙、矿物油乳剂、表面活性剂等。物油乳剂、表面活性剂等。n目前实践中常应用的佐剂福氏佐剂。目前实践中常应用的佐剂福氏佐剂。存在于血清、体液中，是构成机体免疫作用的主要物质。第二部分 Westernblotting 检测抗血清免
26、疫途径有多种多样，如静脉内、腹腔内、肌肉内、皮内、皮下、淋巴结内注射等。常用的实验动物为羊、家兔、豚鼠和鼠等。存在于血清、体液中，是构成机体免疫作用的主要物质。在无菌条件，吸出血清，分装（0.5mL完全佐剂混合，震荡混匀，制成油包水的形态第二部分 Westernblotting 检测抗血清完全抗原：具有免疫原性和免疫反应性的抗原称为完全抗原（complete antigen）抗原与相应抗体在浓度合适时，则形成清晰的沉淀环，其直径大小与所加抗原量成正比。可发生于体内（in vivo），也可发生于体外（in vitro）。体内反应可介导吞噬、溶菌、杀菌、中和毒素等作用；效价测定的方法常用的是单向扩
27、散免疫法，此法对所有的抗体均适用。将通过PAGE分离的蛋白质转移到NC膜或PVDF膜上；人们用类似的方法，对RNA和蛋白质进行印迹分析，对RNA的印迹分析称为Northern印迹法，对单向电泳后的蛋白质分子的印迹分析称为Western印迹法，对双向电泳后蛋白质分子的印迹分析称为Eastern印迹法免疫监视 清除突变或畸变细胞（一）固有性免疫应答（innate immune response)免疫学的研究范围很广，与很多相关学科交织在一起，并且发展成了很多学科，如免疫生物学、免疫遗传学、血液免疫学、肿瘤免疫学等。由多个抗原决定簇刺激机体，相应地就产生各种各样的单克隆抗体，这些单克隆抗体混杂在一起
28、就是多克隆抗体。因此，进行动物免疫时，必须选择对该抗原敏感的、年轻的健康动物。n福氏佐剂（福氏佐剂（Freund adjuvantFreund adjuvant）,通常是由羊通常是由羊毛脂毛脂1 1份、石腊油份、石腊油5 5份。这是不完全福氏佐剂。份。这是不完全福氏佐剂。n在每毫升不完全佐剂加入在每毫升不完全佐剂加入1 120mg20mg卡介苗就成卡介苗就成为完全佐剂。为完全佐剂。硝酸纤维素膜：80g/cm2）半抗原：只具有免疫反应性而无免疫原性的抗原称为半抗原（hapten），也称为不完全抗原(incomplete antigen)。半抗原：只具有免疫反应性而无免疫原性的抗原称为半抗原（ha
29、pten），也称为不完全抗原(incomplete antigen)。抗原（antigens，Ag）是指能够刺激机体免疫活性细胞产生抗体或致敏淋巴细胞，并在体内或体外发生特异性反应的物质。抗原（antigens，Ag）是指能够刺激机体免疫活性细胞产生抗体或致敏淋巴细胞，并在体内或体外发生特异性反应的物质。二抗杂交：第二抗体或配体试剂对于初级抗体是特异性结合并作为指示物。如果难以获得的抗原，且抗体的需要量少，则可以采用纯系小鼠制备。如要获得大量的抗体，多采用大动物；人体血清中IgG含量最多，IgA次之，IgM较少，IgD和IgE微量。免疫学的研究范围很广，与很多相关学科交织在一起，并且发展成了很
30、多学科，如免疫生物学、免疫遗传学、血液免疫学、肿瘤免疫学等。制备含有一定浓度抗血清的琼脂凝胶板（抗体固定不变）。第一部分 动物的常规免疫及抗血清的制备由于动物的遗传性不同，同一抗原对不同动物或同种不同品系动物、或不同个体，产生特异免疫应答的强弱是不同的。置的缓冲液中，电转45min或过夜。固定：蛋白质进行聚丙烯酰胺凝胶电泳（PAGE）并从胶上转移到硝酸纤维素膜上。是检测蛋白质特性、表达与分布的一种最常用的方法。如某抗血清的结合率为50%时的稀释度为1：15000,则该血清的效价就是1：15000Westernblotting 检测抗血清免疫监视 清除突变或畸变细胞防止肿瘤发生 肿瘤或病毒持续性
31、（六）免疫方法（六）免疫方法n抗原剂量，首次剂量为抗原剂量，首次剂量为101050g50g，加强免疫的剂量，加强免疫的剂量约为首次剂量的约为首次剂量的1/41/4。n首次免疫时抗原与完全佐剂等体积混合。加强免疫首次免疫时抗原与完全佐剂等体积混合。加强免疫时用不完全佐剂。时用不完全佐剂。n每每2 23 3周加强免疫一次。周加强免疫一次。n在第在第2 2次加强免疫后次加强免疫后2 2周，从耳缘静脉取周，从耳缘静脉取2 23mL3mL血，血，制备血清，检测抗体效价。如未达到预期效价，需制备血清，检测抗体效价。如未达到预期效价，需再进行加强免疫，直到满意时为止。当抗体效价达再进行加强免疫，直到满意时为
32、止。当抗体效价达到预期水平时，即可放血制备抗血清。到预期水平时，即可放血制备抗血清。n抗体的产生顺序与丰度抗体的产生顺序与丰度（七）抗血清的采集与保存（七）抗血清的采集与保存n取兔血有两种方法，一是耳缘静脉或耳动脉放血，取兔血有两种方法，一是耳缘静脉或耳动脉放血，一是颈动脉放血，也可心脏采血。一是颈动脉放血，也可心脏采血。n小鼠取血。小鼠取血。n收集的血液置于室温下收集的血液置于室温下1h1h左右，凝固后，置左右，凝固后，置44下下，过夜（切勿冰冻）析出血清，离心，过夜（切勿冰冻）析出血清，离心，4000rpm,10min4000rpm,10min。在无菌条件，吸出血清，分装（。在无菌条件，吸
33、出血清，分装（0.050.050.2mL0.2mL），贮于），贮于-80-80以下冰箱，或冻干后贮以下冰箱，或冻干后贮存于存于4 4冰箱保存。冰箱保存。（八）抗血清质量的评价（八）抗血清质量的评价n在免疫期间，不仅各个不同的动物，而且同一动物在在免疫期间，不仅各个不同的动物，而且同一动物在不同的时间内抗血清效价、特异性、亲合力等都可能不同的时间内抗血清效价、特异性、亲合力等都可能发生变化，因而必须经常地采血测试。只有在对抗血发生变化，因而必须经常地采血测试。只有在对抗血清的效价、特异性、亲合力等方面作彻底的评价后，清的效价、特异性、亲合力等方面作彻底的评价后，才可使用所取得的抗血清。才可使用所
34、取得的抗血清。n效价效价 抗血清的效价，就是指血清中所含抗血清的效价，就是指血清中所含抗体的浓度或含量。效价测定的方法常用抗体的浓度或含量。效价测定的方法常用的是单向扩散免疫法，此法对所有的抗体的是单向扩散免疫法，此法对所有的抗体均适用。均适用。n某些由大分子（如蛋白类）抗原所产生的某些由大分子（如蛋白类）抗原所产生的抗体，可用双扩散等方法测定。抗体，可用双扩散等方法测定。二抗杂交：第二抗体或配体试剂对于初级抗体是特异性结合并作为指示物。抗原剂量，首次剂量为1050g，加强免疫的剂量约为首次剂量的1/4。只有在对抗血清的效价、特异性、亲合力等方面作彻底的评价后，才可使用所取得的抗血清。（2）皮
35、下多点注射，每点注射量应小于0.印迹法是指将样品转移到固相载体上，而后利用相应的探测反应来检测样品的一种方法。（1）抗原与佐剂的混合：取1.又称获得性免疫应答，特异性免疫应答，是机体出生后通过与抗原物质接触后所产生的一系列防御功能。将通过PAGE分离的蛋白质转移到NC膜或PVDF膜上；为了获得较好的抗血清，最好是选用蛋白质抗原。应用佐剂的目的是为了提高抗原对机体的免疫原性，从而提高抗体的效价。免疫监视 清除突变或畸变细胞体内反应可介导吞噬、溶菌、杀菌、中和毒素等作用；功能名称 生理功能 病理表现人体血清中IgG含量最多，IgA次之，IgM较少，IgD和IgE微量。（二）适应性免疫应答（adap
36、tive immune response）因此，进行动物免疫时，必须选择对该抗原敏感的、年轻的健康动物。应用佐剂的目的是为了提高抗原对机体的免疫原性，从而提高抗体的效价。（尼龙膜：480g/cm2；蛋白质免疫印迹技术Ppt 固定：蛋白质进行聚丙烯酰胺凝胶电泳（PAGE）并从胶上转移到硝酸纤维素膜上。n单向扩射免疫法：单向扩射免疫法：以不同稀释度的抗血清与优质标记抗原混合，以不同稀释度的抗血清与优质标记抗原混合，孵育孵育24h24h后，测定其结合率。通常以结合率为后，测定其结合率。通常以结合率为50%50%的血清稀度和为的血清稀度和为效价。效价。q如某抗血清的结合率为如某抗血清的结合率为50%时
37、的稀释度为时的稀释度为1：15000,则该血清的效则该血清的效价就是价就是1：15000 n制备含有一定浓度抗血清的琼脂凝胶板（抗体固定不变）。打孔制备含有一定浓度抗血清的琼脂凝胶板（抗体固定不变）。打孔，加入不同稀释度的抗原量，进行免疫扩散。抗原与相应抗体在，加入不同稀释度的抗原量，进行免疫扩散。抗原与相应抗体在浓度合适时，则形成清晰的沉淀环，其直径大小与所加抗原量成浓度合适时，则形成清晰的沉淀环，其直径大小与所加抗原量成正比。将已知正比。将已知参考抗原形成的沉淀环绘成曲线，然后以待测标本参考抗原形成的沉淀环绘成曲线，然后以待测标本的沉淀环直径查标准曲线，计算出待测抗原的含量。的沉淀环直径查
38、标准曲线，计算出待测抗原的含量。n双向扩散法：利用大分子抗原和抗体在琼脂平板上扩双向扩散法：利用大分子抗原和抗体在琼脂平板上扩散，两者在相交处产生沉淀线，以观察和判断抗血清散，两者在相交处产生沉淀线，以观察和判断抗血清中是否有抗体及其浓度。中是否有抗体及其浓度。双向免疫扩散 免疫扩散试验免疫扩散试验 1 1抗原；抗原；2 27 7为不同稀释倍数的抗体为不同稀释倍数的抗体分分 子子 杂杂 交交 原原 理理 及及 流流 程程 图图样样 品品 制制 备备电电 泳泳杂杂 交交转转 膜膜结果显示结果显示探探 针针 制制 备备第二部分第二部分 WesternWesternblotting blotting
39、 检测抗血清检测抗血清 Western BlotWestern Blot原理原理n将通过将通过PAGEPAGE分离的蛋白质转移到分离的蛋白质转移到NCNC膜或膜或PVDFPVDF膜上膜上；n然后与能特异性识别待检蛋白的抗体进行反应；然后与能特异性识别待检蛋白的抗体进行反应；n洗涤去除没有结合的特异性抗体后；洗涤去除没有结合的特异性抗体后；n加入标记的、能识别特异性抗体的种属特异性抗加入标记的、能识别特异性抗体的种属特异性抗体，反应一段时间后再次洗涤去除非特异性结合体，反应一段时间后再次洗涤去除非特异性结合的标记抗体；的标记抗体；n加入适合标记物的检测试剂进行显色或发光等，加入适合标记物的检测试
40、剂进行显色或发光等，观察有无特异性蛋白条带的出现。观察有无特异性蛋白条带的出现。n免疫印迹的实验包括五个步骤：免疫印迹的实验包括五个步骤：n 固定：蛋白质进行聚丙烯酰胺凝胶电泳（固定：蛋白质进行聚丙烯酰胺凝胶电泳（PAGEPAGE）并从胶上转移到硝酸纤维素膜上。并从胶上转移到硝酸纤维素膜上。n 封闭：保持膜上没有抗体的结合场所，使场所处封闭：保持膜上没有抗体的结合场所，使场所处于饱和状态，用以避免特殊性抗体单独结合到膜上。于饱和状态，用以避免特殊性抗体单独结合到膜上。l一抗杂交：初级抗体（第一抗体）是特异性一抗杂交：初级抗体（第一抗体）是特异性的。的。n二抗杂交：第二抗体或配体试剂对于初级抗二
41、抗杂交：第二抗体或配体试剂对于初级抗体是特异性结合并作为指示物。体是特异性结合并作为指示物。n底物显色：被适当保温后的酶标记蛋白质区底物显色：被适当保温后的酶标记蛋白质区带，产生可见的、不溶解状态的颜色反应。带，产生可见的、不溶解状态的颜色反应。三、实验仪器三、实验仪器n动物的常规免疫动物的常规免疫n WesternWesternblotting blotting 检测抗血清检测抗血清 将通过PAGE分离的蛋白质转移到NC膜或PVDF膜上；将已知参考抗原形成的沉淀环绘成曲线，然后以待测标本的沉淀环直径查标准曲线，计算出待测抗原的含量。将适当的抗原物质注入动物体内，经过一定时间，动物血清中可出现
42、大量特异性抗体，这种含抗体的血清称为免疫血清。（1）抗原与佐剂的混合：取1.可发生于体内（in vivo），也可发生于体外（in vitro）。熟悉Westernblotting的实验操作2mL），贮于-80以下冰箱，或冻干后贮存于4冰箱保存。固定：蛋白质进行聚丙烯酰胺凝胶电泳（PAGE）并从胶上转移到硝酸纤维素膜上。某些由大分子（如蛋白类）抗原所产生的抗体，可用双扩散等方法测定。1ml/cm2的量加入加入一抗溶液与滤膜温育。加入适合标记物的检测试剂进行显色或发光等，观察有无特异性蛋白条带的出现。学习掌握动物抗血清的制备原理及技术加强免疫：初级免疫后两周进行。机体的这一特异免疫应答功能的细胞基
43、础是淋巴细胞。目前实践中常应用的佐剂福氏佐剂。免疫防御 清除病原微生物及其它抗原性异物 超敏反应（强）制备含有一定浓度抗血清的琼脂凝胶板（抗体固定不变）。杀伤病毒感染细胞 感染封闭非特异性抗体结合麻烦制备含有一定浓度抗血清的琼脂凝胶板（抗体固定不变）。动物的常规免疫动物的常规免疫n注射器注射器n蜗旋混合器蜗旋混合器四、操作步骤四、操作步骤n动物的常规免疫动物的常规免疫n WesternWesternblotting blotting 检测抗血清检测抗血清 n抗原的提取与制备抗原的提取与制备 1 1）0.5mg/mL0.5mg/mL菠萝蛋白酶以菠萝蛋白酶以0.9%0.9%生理盐水溶生理盐水溶解配
44、置（加少量解配置（加少量NaOHNaOH促溶）（周二上、周五促溶）（周二上、周五上）。上）。2 2）纯化的鸡卵类粘蛋白（周四上午）。）纯化的鸡卵类粘蛋白（周四上午）。3 3）1mg/mL1mg/mL酪蛋白以酪蛋白以0.9%0.9%生理盐水溶解配置生理盐水溶解配置（加少量（加少量NaOHNaOH促溶）促溶）（周四下午）。（周四下午）。动物的常规免疫动物的常规免疫苦味酸（以苦味酸（以75%75%乙醇配置）标记小鼠乙醇配置）标记小鼠标记部位标记部位组号组号头头1左前肢左前肢2左后肢左后肢3背背4右前肢右前肢5右后肢右后肢6左耳朵左耳朵7右耳朵右耳朵8n初级免疫：小鼠背部多点皮下注射，初级免疫：小鼠背
45、部多点皮下注射，0.2mL/0.2mL/只小只小鼠鼠 （1 1）抗原与佐剂的混合：取）抗原与佐剂的混合：取1.5mL1.5mL蛋白与蛋白与1.5mL1.5mL完全佐剂混合，震荡混匀，制成油包水的形态完全佐剂混合，震荡混匀，制成油包水的形态 （2 2）用酒精棉球消毒待注射部位）用酒精棉球消毒待注射部位 （3 3）皮下多点注射，每点注射量应小于）皮下多点注射，每点注射量应小于0.1mL0.1mL 初级免疫后仔细观察小鼠对外源抗原的反应，两初级免疫后仔细观察小鼠对外源抗原的反应，两周后进行加强免疫周后进行加强免疫n加强免疫：初级免疫后两周进行。加强免疫：初级免疫后两周进行。n取取1.5mL1.5mL
46、蛋白与蛋白与1.5mL1.5mL不完全佐剂混合震荡混匀，制成油包水不完全佐剂混合震荡混匀，制成油包水的形态。的形态。n加强免疫：小鼠背部多点皮下注射，加强免疫：小鼠背部多点皮下注射，0.15mL/0.15mL/只小鼠只小鼠 （1 1）用酒精棉球消毒待注射部位）用酒精棉球消毒待注射部位 （2 2）皮下多点注射，每点注射量应小于）皮下多点注射，每点注射量应小于0.1mL0.1mL。n第二次加强免疫：加强免疫一周后进行。操作相同。第二次加强免疫：加强免疫一周后进行。操作相同。n第二次加强免疫后一周，即可采血，收集抗血清。第二次加强免疫后一周，即可采血，收集抗血清。n小鼠取血。收集的血液置于室温下小鼠
47、取血。收集的血液置于室温下1h1h左右，凝固后，置左右，凝固后，置44下，析出血清，离心，下，析出血清，离心，3000rpm,10min3000rpm,10min。吸出血清，分装（。吸出血清，分装（0.050.050.2mL0.2mL），贮于），贮于-20-20以下冰箱保存。以下冰箱保存。Western BlotWestern Blot一般流程一般流程n蛋白样品的制备蛋白样品的制备nSDSSDSPAGEPAGEl转膜转膜l封闭封闭l一抗杂交一抗杂交l二抗杂交二抗杂交l底物显色底物显色转移电泳设备 Western Westernblotting blotting 检测抗血清检测抗血清 转膜转膜膜
48、的选择膜的选择尼龙膜尼龙膜硝酸纤硝酸纤维素膜维素膜封闭非特异性抗体结合麻烦封闭非特异性抗体结合麻烦简单快速封闭非特异性抗体结合简单快速封闭非特异性抗体结合价格昂贵价格昂贵价格便宜价格便宜特殊要求下的选择特殊要求下的选择需要更高的蛋白结合率需要更高的蛋白结合率（尼龙膜：（尼龙膜：480g/cm2；硝酸纤维素膜：；硝酸纤维素膜：80g/cm2）目的蛋白与硝酸纤维膜的结合能力弱目的蛋白与硝酸纤维膜的结合能力弱需要更大的机械强度需要更大的机械强度转膜转膜半干法半干法将凝胶和固相基质象三明治一样加在用缓冲液湿将凝胶和固相基质象三明治一样加在用缓冲液湿润滤纸之间，电转润滤纸之间，电转101030min30
49、min。湿法湿法将凝胶和固相基质夹在滤纸中间，浸泡在转移装将凝胶和固相基质夹在滤纸中间，浸泡在转移装置的缓冲液中，电转置的缓冲液中，电转45min45min或过夜。或过夜。免疫防御 清除病原微生物及其它抗原性异物 超敏反应（强）半抗原：只具有免疫反应性而无免疫原性的抗原称为半抗原（hapten），也称为不完全抗原(incomplete antigen)。为了获得较好的抗血清，最好是选用蛋白质抗原。某些由大分子（如蛋白类）抗原所产生的抗体，可用双扩散等方法测定。（1）抗原与佐剂的混合：取1.（1）抗原与佐剂的混合：取1.二抗杂交：第二抗体或配体试剂对于初级抗体是特异性结合并作为指示物。（2）用酒
50、精棉球消毒待注射部位二抗杂交：第二抗体或配体试剂对于初级抗体是特异性结合并作为指示物。倒掉一抗溶液，用PBS漂洗液滤膜3次，每次10min。2mL），贮于-20以下冰箱保存。它以铁卟啉为辅基，在过氧化氢存在时能催化苯酚、苯胺及其取代物聚合。人体血清中IgG含量最多，IgA次之，IgM较少，IgD和IgE微量。与蛋白质结合后成为完全抗原。1975年，Southern建立了将DNA转移到硝酸纤维素膜（NC膜）上，并利用DNARNA杂交检测特定的DNA片段的方法，称为Southern 印迹法。封闭：保持膜上没有抗体的结合场所，使场所处于饱和状态，用以避免特殊性抗体单独结合到膜上。免疫反应性（immu
