1、编辑课件1Total DNA extraction from eukaryotic tissue组员：肖淑娟 刘娟娟 张小琴 主讲人：杨丽苹 2编辑课件3编辑课件4编辑课件5编辑课件6编辑课件n药品试剂：动物组织药品试剂：动物组织 生理盐水生理盐水 SDS 三羟三羟甲基氨基甲烷（甲基氨基甲烷（Tris或或三羟甲基甲氨基乙三羟甲基甲氨基乙磺酸磺酸）EDTA 饱和酚饱和酚 氯仿氯仿 异戊醇异戊醇 预冷无预冷无水乙醇水乙醇 75%乙醇乙醇 蛋白酶蛋白酶Kn仪器设备：高速离心机仪器设备：高速离心机 冰箱冰箱 水浴锅水浴锅 微量微量移液器移液器 手术剪刀手术剪刀 镊子镊子 吸水纸吸水纸 研钵研钵 离心管
2、离心管7编辑课件n取新鲜小鼠肌肉组织取新鲜小鼠肌肉组织3g，尽量剪碎，放入离心管中。，尽量剪碎，放入离心管中。n加入加入0.45mlTES混匀，再加入混匀，再加入50ulSDS，5.0ul蛋白蛋白酶酶K，充分混匀后，充分混匀后,60水浴保温水浴保温30-60min，不时颠，不时颠倒混匀。倒混匀。n放置到室温，加入饱和酚放置到室温，加入饱和酚500ul颠倒混匀颠倒混匀,3000r/m离离心心10min.吸取上清液到另一个离心管中。吸取上清液到另一个离心管中。n加入酚：氯仿加入酚：氯仿:异戊醇（异戊醇（25:24:1）500ul,颠倒混匀。颠倒混匀。3000r/m离心离心10min.吸取上清液到另
3、一个离心管中。吸取上清液到另一个离心管中。8编辑课件5.加入加入2.5倍体积的倍体积的-20预冷的无水乙醇沉淀预冷的无水乙醇沉淀 DNA,观察现象。观察现象。6.3000r/m离心离心10min，弃乙醇。弃乙醇。7.-20预冷的预冷的75%乙醇乙醇洗涤，洗涤，3000r/m离心离心5min，弃乙醇，弃乙醇，55干燥干燥DNA.9编辑课件DNA纯化纯化n将已提取的DNA粗品加入生理盐水中，再加入固体NaCl使沉淀最少，即DNA溶解度最大。n3000r/m离心5min，吸取上清液加入乙醇析出。n3000r/m离心5min，弃乙醇得到较纯净的DNA.10编辑课件注意事项注意事项n选择的实验材料要新鲜
4、，处理时间不易过长。n在加入细胞裂解缓冲液前，细胞必须均匀分散，以减少DNA团块形成，取上清液时注意不要吸起中间的蛋白质。n 提取的DNA不易溶解：不纯，含杂质较多；加溶解液太少或沉淀物太干燥，都将使溶解变得很困难。n 酚/氯仿/异戊醇抽提后，其上清液太黏不易吸取含高浓度的DNA，可加大抽提前 缓冲液的量或减 少所取组织的量。11编辑课件琼脂糖凝胶电泳检测琼脂糖凝胶电泳检测实验目的 通过实验掌握琼脂糖凝胶电泳 鉴定DNA的原理与方法 12编辑课件实验原理实验原理n琼脂糖凝胶电泳是分离、鉴定和纯化DNA片段最为常用的方法之一，这种方法简便易行。而且琼脂糖可以灌制成各种形状、大小和孔径，在不同的装
5、置中进行电泳，如果有必要，还能够从凝胶中回收DNA谱带。琼脂糖凝胶的分离范围较广，选择不同凝胶浓度和装置，从50个碱基对到几兆不同长度的DNA都可以实现分离。DNA在琼脂糖凝胶中的迁移率受多种因素影响。例如DNA分子的大小；琼脂糖的浓度；所加电压等等。DNA片段越长，泳动速度越慢，而且泳动速度与电场强度成正比。一个给定大小的线性DNA片段，在不同浓度的琼脂糖凝胶中迁移率不同，DNA电泳迁移率的对数与凝胶浓度成线性关系。用低浓度的荧光染料如溴化乙啶染色后，凝胶中的DNA可以直接被检测出来。紫外灯下可以直接检测到20pg的双链DNA。13编辑课件实验材料实验材料 实验器材 水平板电泳槽；灌胶模具及
6、梳齿；电泳仪；55水浴；沸水浴；微量移液器 实验试剂（1）DNA样品；DNA标准分子量标记物；琼脂糖；1x电泳缓冲液TBE；6x样品缓冲液（2）溴化乙锭：水中加入溴化乙啶，搅拌数小时至溶解。将配好的10 mg/ml溴化乙啶溶液装在棕色瓶中，室温保存，使用时稀释至0.5g/ml。缓冲溶液配制表 缓冲溶液工作溶液 储存溶液（每升）TBE0.5x5x0.045mol/L Tris-硼酸54 g Tris 碱0.001mol/L EDTA27.5g 硼酸20ml 0.5mol/L EDTA(pH8.0)6x样品缓冲液0.2%溴酚蓝储存温度450%(w/v)蔗糖水液14编辑课件实验操作实验操作 1.照厂
7、家说明准备好灌胶模具，置于水平面上（实验操作示意图如下）。2.配制1%琼脂糖凝胶。取250ml三角瓶，加入100ml TBE缓冲液，称取1克琼脂糖加入缓冲液中，沸水浴加热至完全溶解，然后在55水浴中保温。在灌胶模具中插入梳齿，将稍微冷却的凝胶倒入灌胶模具。凝胶厚度35mm，避免气泡产生。3.室温放置3045分钟，待凝胶完全凝固后，按照厂家说明将凝胶放入水平板电泳槽。4.在电泳槽中加入电泳缓冲液，电泳缓冲液没过胶面1mm，拔下梳齿形成样品池。5.取样品与6X样品缓冲液按照比例混合后，用微量移液器缓慢加入样品池中。6.盖上电泳槽并且通电，注意电源正负极，确保样品向阳极移动。恒压15V/cm（按照两极之间距离计算），至示踪染料溴酚蓝前沿距离凝胶前端1cm时，切断电源。7.从电泳槽中取出凝胶，将凝胶置于0.5ug/ml溴化乙啶水溶液中，室温下振摇染色3045分钟。8.回收染色液，自来水冲洗凝胶后，于紫外灯下观察。15编辑课件16编辑课件注意事项注意事项 1.溴化乙啶是一种强诱变剂，并有中度毒性，取用含有这一染料的溶液时务必戴手套。2.紫外线对人体，尤其是眼睛有危害性。为减少紫外线照射，必须确保紫外线光源受到遮蔽。思考影响琼脂糖凝胶DNA迁移率的因素有那些，分别有怎样的影响？
