1、甜瓜种质资源果实质构评价及甜瓜种质资源果实质构评价及其相关酶基因的表达分析其相关酶基因的表达分析Author：徐伟欣Supervisor:刘 莉2012-10-30主要内容 1.甜瓜简介 2.甜瓜果实硬度、脆性评价方法 3.甜瓜果实硬度、脆性研究进展 4.关于试验 5.其他1.甜瓜简介 甜瓜（Cucumis melo L.）是葫芦科(Cucurbitaceae)在全球种植地域最为广泛的重要经济作物，也是人类驯化利用最早的植物之一。其果实营养丰富、风味独特、香气浓郁，一直以来都深受广大消费者的欢迎，居国际市场畅销的十大果品之一。随着人们生活水平的大幅提高，市场对于果实品质的要求也在逐步提高，甜瓜
2、作为一种重要的水果，其商品性状不再仅局限于果实外观漂亮、品质好、货架期长，具有怡人的香气以及脆酥的口感也已成为果品吸引消费者和增强市场竞争力的重要因素之一（Beaulieu&Lea,2006；Kourkoutas et al,2006；Javier et al.2010；刘圆等，2008；马永昆等，2004）。据FAO（世界粮农组织）2010数据：1.甜瓜简介 果实质构是既风味之后影响消费者对质量认知的第一标准（Franc-Christophe Baurens et al.2003;Antonio Raffo et al.2006）。引人注意的是，哈密瓜类型、部分Honeydew类型，以及薄皮
3、甜瓜类型的部分品种，在果实成熟的不同时期都能保持其特有的脆酥口感，深受各地消费者的青睐，其消费市场也在逐年扩大，被认为是改进甜瓜货架期和扩大市场的一个重要资源（刘莉2004；2005）。目前的甜瓜育种项目多注重于果实颜色、大小、抗病性、产量及其它性状的选择，对果实硬度和脆酥口感的生理学及分子生物学机制却研究较少。因此，从目前的市场情况来看，以芳香物质和果实口感为主打的品质育种将是二十一世纪最重要的育种目标，越来越受育种学家的重视。2.甜瓜果实硬度、脆性评价方法 果实硬度和脆性一直以来都是反映水果品质和成熟状态的重要指标。目前检测水果硬度和脆性常用的方法大体分为两种：一种是有伤检测，包含果实硬度
4、计（马之胜等2009；刘军2011；罗静2011；R.Aurand 2012）、质构仪（陆秋君2002；潘秀娟2005）等；另一种是无伤检测，包含感官评价（樊勇2009）和近红外光谱无损检测（赵志磊2011）等方法。不同的检测方法侧重点不一样，且不同水果适宜不同的检测方法。甜瓜上目前的硬度及脆性检测方法较倾向于感官检测和果实硬度计两种。运用科学统一的方法对果实硬度及脆性进行测定，可以更为准确地描述这一性状，并为甜瓜育种提供科学有力的工具。综上，建立科学的果实硬度及脆性评价体系至关重要。2.甜瓜果实硬度、脆性评价方法 本试验拟采用感官评价、质构仪、高光谱仪以及电镜切片观察4种检测方法，对果实硬度
5、差异较大的两个亲本，及其杂交回交分离后代果实进行测定，比较4种方法的异同，建立科学高效的果实硬度、脆性评价体系。并将所得数据，采用盖钧镒（2003）数量性状混合遗传模型主基因+多基因多世代联合分析方法进行分析，该方法能够解决孟德尔经典遗传学不能说明的数量性状的遗传规律，在生物的多个数量性状遗传研究中，可以较好地解释数量性状的遗传方式和表达效果。3.甜瓜果实硬度、脆性研究进展 3.1甜瓜硬度、脆性在成熟过程中的变化甜瓜硬度、脆性在成熟过程中的变化 甜瓜是cucumis属中变异性最为丰富的一个种，不仅在形态学上表现出极大的差异，在生长发育、呼吸跃变等生理生化性状上也表现出丰富的多样性，被称作“多态
6、性种”。尤其是厚皮甜瓜类型如cantalupensis、inodorus、recticulatus 与薄皮甜瓜类型conomon、chinensis在呼吸跃变类型、果实成熟软化上的显著差异，跃变特性对成熟速度和贮藏性起了相当重要的作用。细胞壁成分的解离是果实硬度下降的直接原因（Fischer&Bennett，1991）。果实成熟是一个由基因和环境同时调控的生理学和生物化学级联效应的结果。在成熟的过程中，果实的硬度、颜色、香气以及质构都会渐渐发生变化，直到它们产生了其特有的风味和外观。果实硬度下降的过程是决定果实质量和货架期的一个关键因素。果实采后老化的分子机制到目前为止仍不清楚，并且预防果实采
7、后硬度和质量的快速下降是很困难的，这就导致运输、贮藏和销售过程中的大量损失。3.1甜瓜硬度、脆性在成熟过程中的变化甜瓜硬度、脆性在成熟过程中的变化 不同甜瓜果实表现出不同的跃变模式，甜瓜成熟过程中的多数生理学过程都可以被分为跃变型和非跃变型。比如果皮的黄化、果肉的软化以及离区的形成等都是与乙烯相关的（Flores and others 2001;Nunz-Palenius and others 2007;Pech and others 2008）.香气物质的产生被认为是部分依赖于乙烯的。并且从以往采用转基因技术来部分抑制与乙烯合成相关基因的研究结果来看，转基因甜瓜果实表现出对乙烯产量、呼吸峰形
8、成、果皮着色、果肉软化和果实成熟的抑制（Flores and others 2001;Silva and others 2004）。这些研究同样指出调控甜瓜果实成熟的路径既有与乙烯相关的，也有不相关的。3.2果实硬度、脆性相关分子机制研究进展果实硬度、脆性相关分子机制研究进展 薄壁细胞通过细胞壁、半渗透膜和胞汁所具有的负水势吸收水分形成细胞的膨压，这种膨压和细胞壁的机械特性在咀嚼的机械压力下发生改变，从而使人对食品产生脆、硬、软、绵等质地上的印象（陆盛民 2001）。刘春香（2003）研究了黄瓜风味品质的构成因素及部分因素遗传参数，通过对质地品质差异较大的4个品种果实的解剖结构，纤维素、果胶含
9、量等的测定分析发现，黄瓜质地品质与解剖结构、纤维素和果胶含量等关系密切。果皮细胞厚度对质地品质影响较大，果皮厚，皮层细胞排列紧密则果实不脆；导管粗，细胞形状不规则不利于脆性提高。纤维素含量高，果实不脆；果胶含量高，果实较脆，果胶性质对脆性也有影响。张广英（2009）在对比4个黄光品种时发现水分是影响黄瓜脆性的主要原因，水分多，则黄瓜的脆性强，而余记柱等（1994）的报告却认为果实的硬度和脆性是呈正相关的。3.2果实硬度、脆性相关分子机制研究进展果实硬度、脆性相关分子机制研究进展 果实质构的机制极其复杂，并且有一部分物种特异性（Goulao and Oliveira2008）。科学家为研究果实成
10、熟过程中的软化的分子和生物化学机制已做了大量的研究，特别是果实软化与细胞壁修饰酶高表达的关系（Toivonen and Brummell 2008;Goulao and Oliveira2008）。然而，果实质构或许在果实发育阶段就已经被决定了（Chaib et al.2007），并且很可能包含多种机制。截止目前，已有多篇关于果实硬度与果实各种结构学、组织学等性状相关性的研究。番茄（Vrebalov and others 2002;Sun and others 2012）和葡萄(Chervin and others 2004;Zhang and others 2009b;Sun and oth
11、ers 2010)果实的成熟以及软化机制目前研究得相对较好，一些较为广泛基础的机制目前也已发现。3.2果实硬度、脆性相关分子机制研究进展果实硬度、脆性相关分子机制研究进展 万赛罗等（2008）以以色列硬果型番茄为试材，研究发现番茄果实成熟过程中，原果胶、纤维素含量降低，可溶性果胶含量上升；PG、纤维素酶在硬度下降过程中起主要作用，与硬度呈显著负相关关系；而中PME活性高峰均在PG活性高峰之前出现，而且PME活性与可溶性果胶含量间无显著的相关关系。程杰山（2006）选择了5个果实硬度有明显差异的辣椒品系为试验材料，研究发现与果实硬度密切相关的生理生化指标有：果实组织结构，可溶性果胶含量，纤维素含
12、量，细胞壁水解酶特别是PG活性。刘军等（2011）以辣椒软果和硬果自交系为亲本，构建P1、F1、P2、B1、B2和F2共6个家系世代群体，应用植物数量性状主基因+多基因混合遗传模型对该6个世代群体进行多世代联合分析，结果表明：辣椒果实硬度遗传符合1对加性主基因+加一显性多基因遗传模型。3.3甜瓜果实硬度、脆性研究现状甜瓜果实硬度、脆性研究现状 目前对于甜瓜果实成熟软化的研究多集中于与乙烯相关的酶或基因，Sun等（2012）研究了甜瓜果实发育及成熟过程中ABA代谢途径中的关键酶基因的转录调控，并通过外施ABA及NDGA等研究了对乙烯合成酶基因CmACS1和CmACO1，以及细胞壁裂解酶基因CmP
13、G1表达量的影响。Sun等（2012）以Elizabeth为试材，研究了甜瓜果实发育和成熟过程中ABA代谢途径关键酶的转录调控，外施ABA、NDGA上调了甜瓜ACS、ACO以及细胞壁分解酶PG活性。部分育种家认为甜瓜果实中许多影响果实重量、大小、含糖量、种子数量、果肉颜色以及有机酸代谢的过程都是与乙烯无关的（Nunz-Palenius and others 2007）。Obando等（2008）着重研究了甜瓜果实成熟和软化的相关基因和QTLs定位，通过试验检测到一些与果肉硬度相关的QTLs位点，并对有可能与乙烯调控、合成和细胞壁降解相关基因作图，发现其与QTLs有重叠位点。4.关于试验Char
14、entaisQueen4.1试验材料选择试验材料选择 本试验根据2012年6月质构仪测得果实硬度和脆性数据，选择差异较大的两种试验材料，分别是Charentais 和Queen，详见表1.以两者为亲本，构建P1、P2、F1、F2、BC1P1及BC1P2等不同世代。表1.两种材料的平均果实硬度和脆性田间代号品种名成熟期平均果实硬度成熟期果实脆性444Charentais33.37128.006484Queen182.961284.1424.2试验研究内容试验研究内容（1）材料筛选：材料筛选：对不同类型、不同成熟时期的甜瓜果实采用质构仪进行果实质构分析，鉴定具有较大硬度、脆性差异的甜瓜品种；（2）
15、果实硬度、脆性研究果实硬度、脆性研究：采用质构仪、高光谱仪、电镜等较为科学的方法测定各甜瓜类型的果实硬度、脆性和结构等相关性状，取代以往较易产生人为误差的感官评价方法，并对数据进行处理，以期建立科学的甜瓜果实质构特性评价体系，并分析甜瓜果实硬度、脆性的种质资源多样性。（3）果实硬度遗传规律研究：果实硬度遗传规律研究：选配Var.inodorusVar.cantalupensis组合，得到P1、P2、F1、F2、BC1P1及BC1P2等不同世代，将不同世代的质构等数据，以盖钧镒（2003）数量性状混合遗传模型主基因+多基因多世代联合分析方法进行分析，研究果实质构的遗传规律；（4）果实硬度和脆性的
16、遗传研究：果实硬度和脆性的遗传研究：在以上研究基础上，以Var.inodorusVar.cantalupensis组合得到的不同世代为试验材料，克隆果实中与果实硬度和脆性相关基因，本试验拟研究与细胞壁分解相关的纤维素酶、多聚半乳糖醛酸酶、果胶酶、甘露聚糖酶等，并测定其时空表达差异，分析其遗传规律。4.3技术路线技术路线总体分为三部分：总体分为三部分：1.建立科学合理的甜瓜果实硬度、脆性评价体系，2.根据不同甜瓜世代质构数据，分析试验材料的遗传规律；3.分析甜瓜果实硬度、脆性相关基因在不同品种、同一品种不同时期的表达差异。参考文献参考文献1 Beaulieu,J.,2006.Volatile c
17、hanges in cantaloupe during growth,maturation,and in stored fresh-cuts prepared from fruit harvested at various maturities.J.Am.Soc.Hort.Sci.131,127139.2 Kourkoutas,D.,Elmore,J.S.,Mottram,D.S.,2006.Comparison of volatile compositions and flavour properties of cantaloupe,Galia and honeydew muskmelons
18、.Food Chem.97,95102.3 Javier，M.,Obando-Ulloa,Jorge Ruiz,Antonio J.Monforte,J.Pablo Fernndez-Trujillo,2010.Aroma profile of a collection of near-isogenic lines of melon(Cucumis melo L.).Food Chemistry.118:815-822.4 刘圆，齐红岩，王宝驹，郭 亮，苏 欣,2008.不同品种甜瓜果实成熟过程中香气物质动态分析.华北农学报,23(2)：49-54.5 马永昆，周珊，陈计峦等,2004.用SP
19、ME方法分析不同成熟度哈密瓜香气的研究食品科学，25(7)：136-1396 Franc-Christophe Baurens et al.Using SD-AFLP and MSAP to assess CCGG methylation in the banana genome.Plant Molecular Biology Reporter,2003,Volume 21,Number 4,Pages 339-348.7 Antonio Raffo et al.Internal quality of fresh and cold stored celery petioles describe
20、d by sensory profile,chemical and instrumental measurements.Eur Food Res Technol(2006)222:590599.8刘莉,柿原文香,加藤正弘，2004.来自甜瓜属(Cucumis melo L.)6个变种部分品种货架期差异比较.园艺学报,31(6)：817-819.9 刘莉，柿原文香，加藤正弘，2005.甜瓜(Cucumis melo L.)果实中乙烯生产量及一些相关性状的遗传分析.华北农学报 20（3）：72-76.10 Fischer R L，Bennett A B1991Role of cell wall h
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