1、骨髓细胞化学染色骨髓细胞化学染色n细胞化学染色是以细胞形态学为基细胞化学染色是以细胞形态学为基础，利用化学反应原理，对细胞中础，利用化学反应原理，对细胞中的酶类、脂类、糖类及蛋白质等化的酶类、脂类、糖类及蛋白质等化学物质进行定性、定位或半定量分学物质进行定性、定位或半定量分析的方法。析的方法。n用于血液系统疾病的诊断、鉴别诊用于血液系统疾病的诊断、鉴别诊断及疗效判断；用于白血病细胞类断及疗效判断；用于白血病细胞类型的判断。型的判断。基本步骤基本步骤n1.固定固定:目的是保持细胞固有结构和化学目的是保持细胞固有结构和化学成份不变，分蒸汽固定和液体固定。成份不变，分蒸汽固定和液体固定。n2.显示显
2、示:通过化学反应显示被测物质，有通过化学反应显示被测物质，有偶氮偶联法，联苯胺法，金属沉淀法等。偶氮偶联法，联苯胺法，金属沉淀法等。n3.复染：作为背景染色，使反应的细胞复染：作为背景染色，使反应的细胞结构能更清楚显示出来。结构能更清楚显示出来。原理原理机体多余的铁以铁蛋白及含机体多余的铁以铁蛋白及含铁血黄素的形式储存。这些铁与铁血黄素的形式储存。这些铁与低铁氰化钾在酸性溶液中发生反低铁氰化钾在酸性溶液中发生反应而呈蓝色。应而呈蓝色。铁染色铁染色试剂试剂n40g/l亚铁氰化钾溶液。亚铁氰化钾溶液。n4%盐酸（盐酸（38%浓盐酸浓盐酸40ml，小，小心倒入心倒入340ml冷蒸馏水中，混匀）冷蒸馏
3、水中，混匀）n20g/l伊红溶液。伊红溶液。n甲醛溶液。甲醛溶液。细胞外铁阳性（+）（2）细胞细胞内铁：内铁：油油镜下计数镜下计数100个有核红个有核红细胞，记录阳细胞，记录阳性性细胞细胞（胞浆中有蓝色颗粒即（胞浆中有蓝色颗粒即铁铁粒幼细粒幼细胞）的百分率。同时注意有无环胞）的百分率。同时注意有无环形形铁铁粒幼细胞（粒幼细胞（6颗以上，并绕核颗以上，并绕核1/2以上者）。以上者）。环形铁粒幼红细胞1.细胞内铁：计算细胞内铁：计算100个中幼红细胞、个中幼红细胞、晚幼红细胞，计数阳性率，正常值晚幼红细胞，计数阳性率，正常值20-45%；铁颗粒；铁颗粒1-5粒，一般不超过粒，一般不超过10粒。粒。
4、2.细胞外铁：观察骨髓小粒中巨噬细细胞外铁：观察骨髓小粒中巨噬细胞胞浆内蓝色颗粒。正常为（胞胞浆内蓝色颗粒。正常为（+）或）或（+）。）。参考值参考值 临床意义临床意义铁染色主要用于缺铁性贫血与铁染色主要用于缺铁性贫血与铁粒幼细胞性贫血的诊断，也是铁粒幼细胞性贫血的诊断，也是指导铁剂治疗的一个灵敏而可靠指导铁剂治疗的一个灵敏而可靠的指标。特别是铁粒幼细胞贫血的指标。特别是铁粒幼细胞贫血形成特有的环形铁粒幼细胞，也形成特有的环形铁粒幼细胞，也易与其他类型贫血区别。易与其他类型贫血区别。中性粒细胞碱性磷酸酶中性粒细胞碱性磷酸酶(NAP)染色染色(钙钙-钴法钴法）n 原理原理当细胞内的当细胞内的NA
5、P活性存在时，在活性存在时，在pH为为9.29.5的碱性条件下，它可将作用的碱性条件下，它可将作用液中的基质液中的基质-甘油磷酸钠水解，释出磷甘油磷酸钠水解，释出磷酸，进而与作用液中的钙离子结合，成酸，进而与作用液中的钙离子结合，成为磷酸钙沉淀，再经过硝酸钴和硫化胺为磷酸钙沉淀，再经过硝酸钴和硫化胺的作用，生成不溶性硫化钴，呈黑色沉的作用，生成不溶性硫化钴，呈黑色沉淀定位于胞浆。淀定位于胞浆。NAP染色测定染色测定(偶氮偶联法）偶氮偶联法）n检测原理检测原理血细胞内的碱性磷酸酶（血细胞内的碱性磷酸酶（NAP）在碱性环境下，）在碱性环境下，水解水解-磷酸萘酚钠，产生磷酸萘酚钠，产生-萘酚。后者与
6、重氮萘酚。后者与重氮试剂偶联形成有色沉淀物，沉淀物的显色深浅试剂偶联形成有色沉淀物，沉淀物的显色深浅 与与NAP活性成正比。活性成正比。n试剂盒组成试剂盒组成n1.NAP固定液：固定液：1瓶瓶5n2.NAPI液液(-磷酸萘酚钠磷酸萘酚钠)：1瓶瓶 5n3.NAPII(坚牢蓝坚牢蓝B+tris-HCl)液液:1瓶瓶 5n4.苏木素复染液苏木素复染液:1瓶瓶 5方法n1.新鲜涂片滴加固定液新鲜涂片滴加固定液(4 C)30秒秒,水洗待干。水洗待干。n2.将将I液置入液置入II液混合成为基质液。将涂片置液混合成为基质液。将涂片置入后，入后，37C放置放置30分钟，流水冲洗数分钟，分钟，流水冲洗数分钟，
7、取出待干。取出待干。n3.苏木素复染苏木素复染1-2分钟，水洗，待干，镜检。分钟，水洗，待干，镜检。n4.结果显示：结果显示：n阳性阳性细胞内出现暗红色沉淀物，定位于胞细胞内出现暗红色沉淀物，定位于胞质。质。n阴性阴性细胞内无红色沉淀物。细胞内无红色沉淀物。(-)(+)(+)(+)(+)(+)、（+）、（+）积分计算积分计算n在油镜下计数在油镜下计数100个成熟中性粒细胞，个成熟中性粒细胞，包括杆状核和分叶核粒细胞，结果分级包括杆状核和分叶核粒细胞，结果分级为（为（-）、（）、（+）、（）、（+）、（）、（+）、）、（+），分别为），分别为0-4分，所有细胞分，所有细胞分值之和即为积分值，阳性
8、细胞之和为分值之和即为积分值，阳性细胞之和为阳性率。正常范围：阳性率。正常范围：10-100分，阳性率分，阳性率10-50%注意事项注意事项n1.标本宜新鲜，若不能及时测定可先用标本宜新鲜，若不能及时测定可先用固定液处理后，可保存数天。固定液处理后，可保存数天。n2.基质液配制后要及时应用，以免失效基质液配制后要及时应用，以免失效或降低阳性强度。或降低阳性强度。n3.基质液为一次性使用，配制后不能反基质液为一次性使用，配制后不能反复应用。复应用。临床意义临床意义n1.各种急、慢性粒细胞性白血病，其各种急、慢性粒细胞性白血病，其NAP积分积分可降低甚至为零。可降低甚至为零。n2.各种炎症（细菌性
9、），手术后，灼伤等各种炎症（细菌性），手术后，灼伤等NAP积分均可升高。积分均可升高。n3.NAP活性对下列疾病有鉴别诊断价值：活性对下列疾病有鉴别诊断价值：n1）.慢性粒细胞白血病与类白血病反应的鉴别慢性粒细胞白血病与类白血病反应的鉴别2）.慢性粒细胞白血病与其他骨髓增生性疾病慢性粒细胞白血病与其他骨髓增生性疾病 的鉴别的鉴别n3）PNH与再生障碍性贫血的鉴别与再生障碍性贫血的鉴别n4）恶性组织细胞病与反应性组织细胞增恶性组织细胞病与反应性组织细胞增生症的鉴别生症的鉴别n5）真性红细胞增多症与继发性红细胞增真性红细胞增多症与继发性红细胞增多症的鉴别多症的鉴别n6）区别细菌性感染和病毒性感染区
10、别细菌性感染和病毒性感染 粒细胞和部分单核细胞胞浆中粒细胞和部分单核细胞胞浆中存在过氧化酶，它可将底物存在过氧化酶，它可将底物(H2O2)分解产生出新生态氧，分解产生出新生态氧，进而使无色的联苯胺氧化为蓝进而使无色的联苯胺氧化为蓝色的联苯胺蓝，后者与亚硝基色的联苯胺蓝，后者与亚硝基铁氰化钠结合，形成稳定的蓝铁氰化钠结合，形成稳定的蓝色物质。色物质。过氧化物酶过氧化物酶(POX)染色染色原理原理阳性的中性粒细胞阳性的原始粒细胞和阴性的淋巴细胞阳性的粒细胞和阴性的巨核细胞临床意义临床意义用于鉴别急性粒细胞白血病、急性用于鉴别急性粒细胞白血病、急性单核细胞白血病、急性淋巴细胞白单核细胞白血病、急性淋
11、巴细胞白血病。血病。POX主要存在于粒系细胞中，主要存在于粒系细胞中，细胞越成熟，其反应越强。原始单细胞越成熟，其反应越强。原始单核细胞呈阴性，幼稚单核细胞和成核细胞呈阴性，幼稚单核细胞和成熟单核细胞呈弱阳性反应。淋巴系、熟单核细胞呈弱阳性反应。淋巴系、巨核系、红细胞系各阶段细胞均呈巨核系、红细胞系各阶段细胞均呈阴性反应。阴性反应。酸性磷酸酶酸性磷酸酶(ACP)染色染色n 原理原理在酸性条件下在酸性条件下(pH值值4.9)，磷酸，磷酸酶将作用液中的基质酶将作用液中的基质(甘油磷酸钠甘油磷酸钠)水解，产生磷酸，进而与铅作用生水解，产生磷酸，进而与铅作用生成磷酸铅沉淀于细胞酶活性存在处，成磷酸铅沉
12、淀于细胞酶活性存在处，然后与硫化铵作用，生成黑色硫化然后与硫化铵作用，生成黑色硫化铅沉淀。铅沉淀。临床意义临床意义n1.网状细胞、吞噬细胞、组织细胞、粒网状细胞、吞噬细胞、组织细胞、粒细胞和单核细胞此酶呈阳性反应。细胞和单核细胞此酶呈阳性反应。n2.毛细胞白血病时，毛细胞呈阳性反应，毛细胞白血病时，毛细胞呈阳性反应，且不为且不为L-酒石酸所抑制。酒石酸所抑制。n3.戈谢细胞戈谢细胞ACP染色阳性，而尼曼染色阳性，而尼曼-匹克匹克细胞呈阴性。细胞呈阴性。特异性酯酶特异性酯酶(SE)染色染色 原理原理氯醋酸氯醋酸AS-D萘酚酯酶萘酚酯酶为粒细胞所为粒细胞所特有，故称特异性酯酶，可将基质中特有，故称
13、特异性酯酶，可将基质中的氯醋酸的氯醋酸AS-D萘酚水解而产生萘酚萘酚水解而产生萘酚AS-D，后者与重氮盐偶联生成不溶性，后者与重氮盐偶联生成不溶性有色沉淀定位于胞浆中。有色沉淀定位于胞浆中。临床意义临床意义1.正常血细胞反应：正常血细胞反应：SE在分化在分化好的原始粒细胞可呈弱阳性反应，好的原始粒细胞可呈弱阳性反应，早幼粒细胞呈强阳性反应，早幼粒细胞呈强阳性反应，SE活活性不随粒细胞的成熟而增强。单性不随粒细胞的成熟而增强。单核细胞呈阴性或弱阳性反应，其核细胞呈阴性或弱阳性反应，其他细胞均呈阴性反应。他细胞均呈阴性反应。2.急性白血病类型的鉴别：急性急性白血病类型的鉴别：急性粒细胞白血病时，原
14、始粒细胞和粒细胞白血病时，原始粒细胞和早幼粒细胞的早幼粒细胞的SE活性显著增强；活性显著增强；急性单核细胞白血病、急性淋巴急性单核细胞白血病、急性淋巴细胞白血病、急性巨核细胞白血细胞白血病、急性巨核细胞白血病时，其原始、幼稚细胞均呈阴病时，其原始、幼稚细胞均呈阴性反应。性反应。非特异性酯酶非特异性酯酶(NSE)染色染色 原理原理-醋酸萘酚酯醋酸萘酚酯酶存在于单核细酶存在于单核细胞粒细胞及淋巴细胞中，故称为非胞粒细胞及淋巴细胞中，故称为非特异性酯酶。特异性酯酶。NSE水解基质液中水解基质液中-醋酸萘酯而产生醋酸萘酯而产生-萘酚，后者萘酚，后者与重氮盐偶联生成不溶性有色沉淀与重氮盐偶联生成不溶性有
15、色沉淀定位于胞质中。定位于胞质中。阳性的原始单核细胞被NaF抑制被NaF抑制的原单细胞和不抑制的中幼粒细胞临床意义临床意义1.正常血细胞反应：正常血细胞反应：NSE主主要存在于单核细胞系，从原单要存在于单核细胞系，从原单细胞到成熟单核细胞逐渐增强。细胞到成熟单核细胞逐渐增强。阳性反应能被阳性反应能被NaF抑制，粒细抑制，粒细胞一般呈阴性反应。胞一般呈阴性反应。2.急性白血病类型的鉴别：急急性白血病类型的鉴别：急性单核细胞白血病时，性单核细胞白血病时，NSE呈呈强阳性或阳性反应，但强阳性或阳性反应，但NSE活活性能被氟化钠所抑制，称为氟性能被氟化钠所抑制，称为氟化钠抑制试验阳性。化钠抑制试验阳性
16、。急性粒细胞白血病时，有部分病例是弱阳性或阳性反应，但其酶活性不被氟化钠抑制，即氟化钠抑制试验阴性。故本试验可以用于急性单核细胞白血病的诊断及其与急性粒细胞白血病的鉴别。糖原染色（又称过碘酸糖原染色（又称过碘酸-雪夫反雪夫反应，应，PAS反应）反应）原理原理含有乙二醇基的糖类，在过碘酸的含有乙二醇基的糖类，在过碘酸的作用下，经氧化而产生双醛基，醛基作用下，经氧化而产生双醛基，醛基进而与碱性复红液进而与碱性复红液(Schiff液液)结合，结合，使无色液体变成紫红色染料，并沉着使无色液体变成紫红色染料，并沉着于含有糖原的细胞或组织结构上。于含有糖原的细胞或组织结构上。正常血细胞中中性粒细胞、单正常
17、血细胞中中性粒细胞、单核细胞、巨核细胞及少数淋巴细胞呈核细胞、巨核细胞及少数淋巴细胞呈阳性反应。阳性反应。1.红细胞系列的糖原反应及其诊断意红细胞系列的糖原反应及其诊断意义：正常人、再生障碍性贫血、巨幼义：正常人、再生障碍性贫血、巨幼红细胞贫血的幼稚红细胞均无阳性反红细胞贫血的幼稚红细胞均无阳性反应应临床意义临床意义巨幼贫的PAS染色幼红细胞呈阴性AML-M6 PAS 染色染色（幼红细胞呈颗粒状阳性）（幼红细胞呈颗粒状阳性）溶血性贫血及溶血性贫血及MDS偶而有弱阳偶而有弱阳性反应。红白血病、缺铁性贫性反应。红白血病、缺铁性贫血、地中海贫血的幼稚红细胞血、地中海贫血的幼稚红细胞呈阳性反应。呈阳性
18、反应。2.急性粒细胞白血病的原始及急性粒细胞白血病的原始及早幼粒细胞的糖原一般呈阳性早幼粒细胞的糖原一般呈阳性反应，但早幼粒胞浆内多呈弥反应，但早幼粒胞浆内多呈弥漫性着色颗粒；急性淋巴细胞漫性着色颗粒；急性淋巴细胞白血病有白血病有l/51/2呈阳性反应，呈阳性反应，并可见红色粗大颗粒，形成环并可见红色粗大颗粒，形成环状。状。ALLPAS染色阳性（杆状核粒细胞也阳性）原始淋巴细胞淋巴瘤细胞白血病及慢性淋巴淋巴瘤细胞白血病及慢性淋巴细胞白血病，巨核细胞白血病细胞白血病，巨核细胞白血病的原始巨核细胞、幼稚巨核细的原始巨核细胞、幼稚巨核细胞，特别是小巨核细胞的糖原胞，特别是小巨核细胞的糖原呈强阳性反应，弥漫于胞浆内。呈强阳性反应，弥漫于胞浆内。
