1、2023-1-232023-1-23第第三三章章高效液相色谱高效液相色谱分析法分析法一、一、高效液相色谱法特点高效液相色谱法特点Characteristic of HPLC二、二、影响色谱峰扩展及分离的因素影响色谱峰扩展及分离的因素The factors that influence peak expansion and seprationhigh performance liquid chromatograph3-13-1概述概述2023-1-232023-1-232023-1-232023-1-23经典经典LC与与HPLC比较比较2023-1-23HPLC:HPLC特点：高压、高速、高效、
2、高灵敏度、样品回收方便特点：高压、高速、高效、高灵敏度、样品回收方便2023-1-23GC与HPLC的比较2023-1-23与与GC比较，比较，HPLC的的优点优点1.分析对象广分析对象广 气相色谱只限于分析气体和沸点较低的化合物；气相色谱只限于分析气体和沸点较低的化合物；HPLC不受样品挥发性和热稳定性的限制，适用于高沸点、热稳不受样品挥发性和热稳定性的限制，适用于高沸点、热稳定性差、摩尔质量大的物质。原则上讲，几乎可以分析除永久气定性差、摩尔质量大的物质。原则上讲，几乎可以分析除永久气体外所有的有机和无机化合物。体外所有的有机和无机化合物。2.流动相对分离起作用流动相对分离起作用 气相色谱
3、的流动相仅起运载作用，对组分气相色谱的流动相仅起运载作用，对组分不产生相互作用力；不产生相互作用力；HPLC的流动相对组分产生相互作用力，相的流动相对组分产生相互作用力，相当于增加了一个控制和改进分离条件的参数。当于增加了一个控制和改进分离条件的参数。3.经常在室温条件下操作经常在室温条件下操作气相色谱法一般在较高温度下进行气相色谱法一般在较高温度下进行2023-1-23缺点缺点：仪器设备费用昂贵，操作严格。仪器设备费用昂贵，操作严格。与与GC相比，流动相差别相比，流动相差别vGC：流动相为惰性气体 组分与流动相无亲合作用力，只与固定相作用 vHPLC：流动相为液体 流动相与组分间有亲合作用力
4、，为提高柱的选择性、改善分离度增加了因素，对分离起很大作用 流动相种类较多，选择余地广 流动相极性和pH值的选择也对分离起到重要作用 选用不同比例的两种或两种以上液体作为流动相 可以增大分离选择性2023-1-232023-1-23影响色谱峰扩展及分离的因素影响色谱峰扩展及分离的因素 基本概念及基础理论同气相色谱：保留值、分配系数、分配比、分离度、选择性因子(分离因子)、塔板理论及速率理论。由于流动相的差别，对色谱过程必然产生影响。2023-1-23速率理论速率理论(与与GC对比对比)GC:HPLC:2023-1-23TDDdfCCCCCCCtBDDBdpdpLllllgsmRgm MTD或T
5、DDB ,22 A 2A)(u CB/uAH )(u CB/uAH2ggg 毛细管柱填充柱相忽略大低，流动相柱温BTTDBuCAHmmD 2速率理论速率理论(与与GC对比对比)讨论：讨论：1）流动相流速对HPLC板高的影响(与GC对比)next 2）涡流扩散项及其影响 next2023-1-23min/1/1mlutnHuuHscmuR选择兼顾柱效和分析时间，但柱效，时，柱效，nHAdpdpAdpA 2速率理论速率理论(与与GC对比对比)2023-1-23速率理论速率理论(与与GC对比对比)3）传质阻抗项及其影响 2023-1-23，柱阻，但易产生气泡柱效，柱效，：忽略固定相传质阻抗态流动相的
6、传质阻抗注：只考虑流动相和静）（忽略固定相传质阻抗mmmmmmsmmsmmsmmssmmDTCDTnHDnHCdpTDDdpCDdpCCuCuCAHHPLCCCCCCC 22检测特性-有否紫外吸收?荧光?选择流动相时应注意的几个问题分子量-在样品预处理或GPC分析时有用柱 温：50 C降低对不稳定样品的影响环境中有机氯农药残留量分析当使用紫外检测器时，流动相不应有紫外吸收。流动相：对于亲水性固定液，采用疏水性流动相，即流动相的极性小于固定液的极性（正相 normal phase），反之，流动相的极性大于固定液的极性（反相 reverse phase）。application of HPLC酸性
7、溶剂破坏氧化铝固定相等。离子色谱可分析阴离子和阳离子。（1）尽量使用高纯度试剂作流动相，防止微量杂质长期累积损坏色谱柱和使检测器噪声增加。组分在两种类型分离柱上的出峰顺序相反。一次性使用的膜“Cartridge”存在着双重分离机制：粒度：510 m；可用于梯度洗脱。缺点：仪器设备费用昂贵，操作严格。水(最大)甲酰胺 乙腈 甲醇 乙醇 丙醇 丙酮 二氧六环 四氢呋喃 甲乙酮 正丁醇 乙酸乙酯 乙醚 异丙醚 二氯甲烷氯仿溴乙烷苯四氯化碳二硫化碳环己烷己烷煤油(最小)GC：流动相为惰性气体HPLC法中分离条件的选择法中分离条件的选择1.固定相与装柱方法的选择：选粒径小的、分布均匀的球形固定相（dp1
8、0m）首选化学键合相，匀浆法装柱2.流动相及其流速的选择：选粘度小、低流速的流动相甲醇，1ml/min 3.柱温的选择：选室温250C左右2023-1-232023-1-23第第三三章章高效液相色谱高效液相色谱分析法分析法一、液一、液-液分配色谱液分配色谱liquid-liquid partition chromatograph二、液二、液-固吸附色谱固吸附色谱liquid-solid adsorption chromatograph三、离子交换色谱三、离子交换色谱ion-exchange chromatograph五、离子对色谱五、离子对色谱ion-pair chromatograph四、离
9、子色谱四、离子色谱ion chromatograph六、排阻色谱六、排阻色谱size-exclusion chromatograph3-23-2主要分离类型与原理主要分离类型与原理high performance liquid chromatographbasic principle and main separating types2023-1-23一、一、液液-液分配色谱液分配色谱liquid-liquid partition chromatography 固定相与流动相均为液体（互不相溶）；基本原理基本原理：组分在固定相和流动相上的分配；流动相流动相：对于亲水性固定液，采用疏水性流动相，
10、即流动相的极性小于固定液的极性（正相正相 normal phase），反之，流动相的极性大于固定液的极性（反相反相 reverse phase）。正相与反相的出峰顺序相反；固定相固定相：早期涂渍固定液，固定液流失，较少采用；化学键合固定相化学键合固定相：（将各种不同基团通过化学反应键合到硅胶（担体）表面的游离羟基上。C-18柱（反相柱）。2023-1-23二、二、液液-固吸附色谱固吸附色谱liquid-solid adsorption chromatography 固定相固定相：固体吸附剂为，如硅胶、氧化铝等，较常使用的是510m的硅胶吸附剂；流动相流动相：各种不同极性的一元或多元溶剂。基本原
11、理基本原理：组分在固定相吸附剂上的吸附与解吸；适用于分离相对分子质量中等的油溶性试样，对具有官能团的化合物和异构体有较高选择性；缺点缺点：非线形等温吸附常引起峰的拖尾；2023-1-23三、三、离子交换色谱离子交换色谱ion-exchange chromatography 固定相固定相：阴离子离子交换树脂或阳离子离子交换树脂；流动相流动相：阴离子离子交换树脂作固定相，采用酸性水溶液；阳离子离子交换树脂作固定相，采用碱性水溶液；基本原理基本原理：组分在固定相上发生的反复离子交换反应；组分与离子交换剂之间亲和力的大小与离子半径、电荷、存在形式等有关。亲和力大，保留时间长；阳离子交换：RSO3-Na
12、+M+=RSO3-M+Na+阴离子交换：RNR4+Cl-+X-=RNR4+X-+Cl-应用应用：离子及可离解的化合物，氨基酸、核酸等。2023-1-23四、四、离子对色谱离子对色谱ion pair chromatography 原理原理：将一种（或多种）与溶质离子电荷相反的离子（对离子或反离子）加到流动相中使其与溶质离子结合形成疏水性离子对化合物，使其能够在两相之间进行分配；阴离子分离阴离子分离：常采用烷基铵类，如氢氧化四丁基铵或氢氧化十六烷基三甲铵作为对离子；阳离子分离阳离子分离：常采用烷基磺酸类，如己烷磺酸钠作为对离子；反相离子对色谱反相离子对色谱：非极性的疏水固定相(C-18柱)，含有对
13、离子Y+的甲醇-水或乙腈-水作为流动相，试样离子X-进入流动相后，生成疏水性离子对Y+X-后；在两相间分配。2023-1-23五、五、离子色谱离子色谱ion chromatography离子色谱是在离子色谱是在20世纪世纪70年代中期发展起来的一项技术，其年代中期发展起来的一项技术，其与离子交换色谱的区别是其采用了特制的、具有极低交换与离子交换色谱的区别是其采用了特制的、具有极低交换容量的离子交换树脂作为柱填料，并采用淋洗液抑制技术容量的离子交换树脂作为柱填料，并采用淋洗液抑制技术和电导检测器，是测定混合阴离子的有效方法。和电导检测器，是测定混合阴离子的有效方法。传统离子交换色谱存在着两个难于
14、解决的问题：传统离子交换色谱存在着两个难于解决的问题：(1)(1)需要高浓度淋洗液洗脱且洗脱时间很长；需要高浓度淋洗液洗脱且洗脱时间很长；(2)(2)洗脱后的组分缺乏灵敏、快速的在线检测方法。洗脱后的组分缺乏灵敏、快速的在线检测方法。2023-1-231 1、离子色谱法原理、离子色谱法原理 离子交换原理，与传统离子交离子交换原理，与传统离子交换的不同点：换的不同点：采用交换容量非常低的特制离子交换树脂为固定相；细颗粒柱填料，高柱效；采用高压输液泵；低浓度淋洗液或本底电导抑制（在分离柱后，采用抑制柱来消除淋洗液的高本底电导）；可采用电导检测器，快速分离分析微量无机离子混合物；各种抑制装置及无抑制
15、方法的出现，发展迅速。2023-1-232 2、离子色谱优点、离子色谱优点（1 1）分析速度快）分析速度快 可在数分钟内完成一个试样的分析；（2 2）分离能力高）分离能力高 在适宜的条件下，可使常见的各种阴离子混合物分离；例：使用双柱法，在十几分钟内，可使七种阴离子完全分离。（3）分离混合阴离子的最有效方法）分离混合阴离子的最有效方法（4）耐腐蚀，仪器流路采用全塑件，玻璃柱）耐腐蚀，仪器流路采用全塑件，玻璃柱2023-1-233 3、离子色谱装置类型、离子色谱装置类型 suppressed apparatus of IC抑制型：抑制柱型、连续抑制型抑制型：抑制柱型、连续抑制型 分离柱中离子交换
16、树脂的交换容量通常在0.010.05毫摩尔/克干树脂。非抑制型非抑制型:当进一步降低分离柱中树脂的交换容量(0.0070.07毫摩尔/克干树脂),使用低浓度、低电离度的有机弱酸及弱酸盐作淋洗液，如苯甲酸、苯甲酸盐等。检测器可直接与分离柱相连，不需抑制柱。（2）寿命长，化学键合，无固定液流失，耐流动相冲击；Symmetry C181917灵敏度低、对温度敏感、不能用于梯度洗脱；对HPLC柱的了解（一）五、离子色谱ion chromatography除色谱柱对流动相对的要求外，还有原理：将一种（或多种）与溶质离子电荷相反的离子（对离子或反离子）加到流动相中使其与溶质离子结合形成疏水性离子对化合物，
17、使其能够在两相之间进行分配；包括Silica/Florisil/NH2/Diol/CN/Alumina分析气相色谱和液相色谱的异同点H=A+C u由于流动相的差别，对色谱过程必然产生影响。传统离子交换色谱存在着两个难于解决的问题：Partisil ODS-31112.使用制备柱，超载提高效率；水(最大)甲酰胺 乙腈 甲醇 乙醇 丙醇 丙酮 二氧六环 四氢呋喃 甲乙酮 正丁醇 乙酸乙酯 乙醚 异丙醚 二氯甲烷氯仿溴乙烷苯四氯化碳二硫化碳环己烷己烷煤油(最小)0 min,死时间为1.除去小分子样品中的大分子蛋白(键合基团的覆盖率决定分离机理)结构类型：全多孔型和薄壳型；非极性有机溶剂为流动相，不能
18、用丙酮、乙醇等极性溶剂2023-1-23离子色谱连续抑制装置图离子色谱连续抑制装置图2023-1-23离子色谱连续抑制原理图离子色谱连续抑制原理图2023-1-234 4、离子色谱的应用、离子色谱的应用 application of IC阴离子分析阴离子分析:双柱；薄壳型阴离子交换树脂分离柱(3250mm),流动相：0.003molL-1 NaHCO3/0.0024 molL-1 Na2CO3，流量138 mL/hr。七种阴离子在20分钟内基本上得到完全分离，各组分含量在350 ppm。2023-1-23六、六、排阻色谱色谱排阻色谱色谱size-exclusion chromatography
19、 固定相固定相：凝胶(具有一定大小孔隙分布)；原理原理：按分子大小分离。小分子可以扩散到凝胶空隙，由其中通过，出峰最慢；中等分子只能通过部分凝胶空隙，中速通过；而大分子被排斥在外，出峰最快；溶剂分子小，故在最后出峰。全部在死体积前出峰；可对相对分子质量在100-105范围内的化合物按质量分离 2023-1-23第第三三章章高效液相色谱高效液相色谱分析法分析法一、一、液相色谱固定相液相色谱固定相stationary phase of HPLC二、液相色谱流动相二、液相色谱流动相 mobile phase of HPLC三、分离条件的选择三、分离条件的选择3-3 3-3 3-4 3-4 液相色谱的
20、固定相液相色谱的固定相液相色谱的流动相液相色谱的流动相high performance liquid chromatographstationary phase and mobile phase of HPLC2023-1-23一、液相色谱固定相一、液相色谱固定相 stationary phases of LC 1.1.液液-液分配及离子对色谱法固定相液分配及离子对色谱法固定相 （1）全多孔型担体）全多孔型担体 由氧化硅、氧化铝、硅藻土等制成的多孔球体；早期采用100m的大颗粒，表面涂渍固定液，性能不佳已不多见；现采用10m以下的小颗粒，化学键合制备柱填料；（2）表面多孔型担体）表面多孔型担体
21、 （薄壳型微珠担体）3040m的玻璃微球，表面附着一层厚度为1 2m的多孔硅胶。表面积小，柱容量底；2023-1-23（3）化学键合固定相）化学键合固定相 化学键合固定相:目前应用最广、性能最佳的固定相；a.硅氧碳键型：硅氧碳键型：SiOC b.硅氧硅碳键型：硅氧硅碳键型：SiOSi C 稳定，耐水、耐光、耐有机溶剂，应用最广稳定，耐水、耐光、耐有机溶剂，应用最广；c.硅碳键型：硅碳键型：SiC d.硅氮键型：硅氮键型：SiN2023-1-23化学键合固定相的特点化学键合固定相的特点（1）传质快传质快，表面无深凹陷，比一般液体固定相传质快；（2）寿命长寿命长，化学键合，无固定液流失，耐流动相冲
22、击；耐水、耐光、耐有机溶剂，稳定；（4）选择性好选择性好，可键合不同官能团，提高选择性；（5）有利于梯度洗脱；有利于梯度洗脱；存在着存在着双重分离机制双重分离机制：(键合基团的覆盖率决定分离机理)高覆盖率：分配为主；低覆盖率：吸附为主；2023-1-23 2.2.液液-固吸附分离固定相固吸附分离固定相 种类：硅胶、氧化铝、分子筛、聚酰胺等；种类：硅胶、氧化铝、分子筛、聚酰胺等；结构类型：全多孔型和薄壳型；结构类型：全多孔型和薄壳型；粒度：粒度：510 m；2023-1-233.3.离子交换色谱离子交换色谱分离固定相分离固定相 结构类别：结构类别：（1）薄壳型离子交换树脂）薄壳型离子交换树脂 薄
23、壳玻璃珠为担体，表面涂约1%的离子交换树脂；（2）离子交换键合固定相）离子交换键合固定相 薄壳键合型；微粒硅胶键合型（键合离子交换基团）树脂类别：树脂类别：（1）阳离子交换树脂（强酸阳离子交换树脂（强酸性、弱酸性）性、弱酸性）（2）阴离子交换树脂（强碱阴离子交换树脂（强碱性、弱碱性）性、弱碱性）用非极性溶剂洗脱不想要的组份速率理论(与GC对比)不同键合相对不同种类的化合物分离不同常用溶剂：己烷、四氯化碳、甲苯、乙酸乙酯、乙醇、乙腈、水。流动相：20%甲醇-水 100%甲醇各种Sep-Pek小柱（二）AccQ-Tag 衍生法（1）液相色谱的流动相又称为：淋洗液，洗脱剂。high performa
24、nce liquid chromatograph小柱及其非极性杂质丢弃水为流动相。适用于分离相对分子质量中等的油溶性试样，对具有官能团的化合物和异构体有较高选择性；增加荧光基团使样品用高灵敏度荧光检测器样品是一种叫作“Kool-Aid”葡萄饮料的混合物速率理论(与GC对比)液固抽提/Sep-Pak小柱光电二极管阵列检测器在不同条件下，有些填料可以用于反相或离子交换，如NH2/CN检测器：差示折光检测器把样品分成不同极性的组分析2023-1-23 4.4.空间排阻分离固定相空间排阻分离固定相（1）软质凝胶）软质凝胶 葡聚糖凝胶、琼脂凝胶等。多孔网状结构；水为流动相。适用于常压排阻分离。（2）半硬
25、质凝胶）半硬质凝胶 苯乙烯-二乙烯基苯交联共聚物，有机凝胶；非极性有机溶剂为流动相，不能用丙酮、乙醇等极性溶剂（3）硬质凝胶）硬质凝胶 多孔硅胶、多孔玻珠等；化学稳定性、热稳定性好、机械强度大，流动相性质影响小，可在较高流速下使用。可控孔径玻璃微球，具有恒定孔径和窄粒度分布。2023-1-23二、液相色谱的流动相二、液相色谱的流动相 mobile phases of LC 1.1.流动相特性流动相特性 （1）液相色谱的流动相又称为：淋洗液，洗脱剂。流动相组成改变，极性改变，可显著改变组分分离状况；（2）亲水性固定液常采用疏水性流动相，即流动相的极性小于固定相的极性，称为正相液液色谱法，极性柱也
26、称正相柱。（3）若流动相的极性大于固定液的极性，则称为反相液液色谱，非极性柱也称为反相柱。组分在两种类型分离柱上的出峰顺序相反。2023-1-232.2.流动相类别流动相类别 按流动相组成分按流动相组成分：单组分和多组分；按极性分按极性分：极性、弱极性、非极性；按使用方式分按使用方式分：固定组成淋洗和梯度淋洗。常用溶剂常用溶剂：己烷、四氯化碳、甲苯、乙酸乙酯、乙醇、乙腈、水。采用二元或多元组合溶剂作为流动相可以灵活调节流动相的极性或增加选择性，以改进分离或调整出峰时间。2023-1-233.3.流动相选择流动相选择 在选择溶剂时，溶剂的极性是选择的重要依据。在选择溶剂时，溶剂的极性是选择的重要
27、依据。采用正相液-液分配分离时：首先选择中等极性溶剂，若组分的保留时间太短，降低溶剂极性，反之增加。也可在低极性溶剂中，逐渐增加其中的极性溶剂，使保留时间缩短。常用溶剂的极性顺序常用溶剂的极性顺序：水(最大)甲酰胺 乙腈 甲醇 乙醇 丙醇 丙酮 二氧六环 四氢呋喃 甲乙酮 正丁醇 乙酸乙酯 乙醚 异丙醚 二氯甲烷氯仿溴乙烷苯四氯化碳二硫化碳环己烷己烷煤油(最小)2023-1-234.4.选择流动相时应注意的几个问题选择流动相时应注意的几个问题（1）尽量使用高纯度试剂作流动相，防止微量杂质长期累积损坏色谱柱和使检测器噪声增加。（2）避免流动相与固定相发生作用而使柱效下降或损坏柱子。如使固定液溶解
28、流失；酸性溶剂破坏氧化铝固定相等。（3）试样在流动相中应有适宜的溶解度，防止产生沉淀并在柱中沉积。（4）流动相同时还应满足检测器的要求。当使用紫外检测器时，流动相不应有紫外吸收。2023-1-232023-1-232023-1-232023-1-232023-1-23阳离子离子交换树脂作固定相，采用碱性水溶液；包括Accell Plus CM/Accell Plus QMA/NH2速率理论(与GC对比)有更小内径，可用于微量样品的处理可在数分钟内完成一个试样的分析；分析气相色谱和液相色谱的异同点二、影响色谱峰扩展及分离的因素除色谱柱对流动相对的要求外，还有新一代硅胶基质的色谱柱颗粒度越小：柱效
29、越高(传质好，涡流扩散小)柱压越高(渗透性差)D分配比变化范围宽的试样。由氧化硅、氧化铝、硅藻土等制成的多孔球体；一次性使用的膜“Cartridge”1）流动相流速对HPLC板高的影响(与GC对比)next气相色谱中的固定液原则上都可以用于液相色谱，其选用原则与气相色谱一样。在高效液相色谱中,液体的扩散系数仅为气体的万分之一，则速率方程中的分子扩散项B/U较小，可以忽略不计，即：流动相组成改变，极性改变，可显著改变组分分离状况；采用二元或多元组合溶剂作为流动相可以灵活调节流动相的极性或增加选择性，以改进分离或调整出峰时间。流动相种类较多，选择余地广柱 压：70 104 Pa2023-1-232
30、023-1-232023-1-232023-1-232023-1-232023-1-232023-1-23第第三三章章高效液相色谱分析法高效液相色谱分析法一、一、高效液相色谱高效液相色谱仪仪HPLC二、流程及主要部件二、流程及主要部件general process and main assembly of HPLC3-53-5高效液相色谱的高效液相色谱的特点与仪器特点与仪器high performance liquid chromatographfeature and instrument of HPLC2023-1-23一、液相色谱仪器一、液相色谱仪器 high performance li
31、quid chromatograph2023-1-23液相色谱仪（液相色谱仪（2）2023-1-23液相色谱仪（液相色谱仪（3）（2）离子交换键合固定相The factors that influence peak expansion and seprationbasic principle and main separating types分析对象广 气相色谱只限于分析气体和沸点较低的化合物；分析气相色谱和液相色谱的异同点（2）避免流动相与固定相发生作用而使柱效下降或损坏柱子。糖、有机酸等极性物质先流出。一、高效液相色谱法特点四、制备型液相色谱 preparative liquid chro
32、matography液相色谱对流动相的要求流动相及样品的预处理general process and main assembly of HPLC阳离子交换：RSO3-Na+M+=RSO3-M+Na+荧光检测器（fluorescence detector）（3）分离混合阴离子的最有效方法用强极性溶剂洗脱不想要的组份（4）选择性好，可键合不同官能团，提高选择性；各种Sep-Pek小柱（二）有利于极性化合物的拖尾改善而大分子被排斥在外，出峰最快；2023-1-23液相色谱仪（液相色谱仪（4）2023-1-23二、二、流程及主要部件流程及主要部件 process and main assembly o
33、f HPLC1.1.流程流程2023-1-232.主要部件主要部件(1)高压输液泵高压输液泵主要部件之一，压力：150350105 Pa。为了获得高柱效而使用粒度很小的固定相（10m），液体的流动相高速通过时，将产生很高的压力，因此高压、高速是高效液相色谱的特点之一。应具有压力平稳、脉冲小、流量稳定可调、耐腐蚀等特性2023-1-232023-1-232023-1-232023-1-232023-1-232023-1-23(2)梯度淋洗装置梯度淋洗装置外梯度外梯度:利用两台高压输液泵，将两种不同极性的溶剂按一定的比例送入梯度混合室，混合后进入色谱柱。内梯度内梯度:一台高压泵,通过比例调节阀,将
34、两种或多种不同极性的溶剂按一定的比例抽入高压泵中混合。2023-1-23(3)进样装置进样装置 流路中为高压力工作状态，通常使用耐高压的六通阀进样装置，其结构如图所示：2023-1-232023-1-232023-1-232023-1-232023-1-232023-1-232023-1-23(4)高效分离柱高效分离柱2023-1-232023-1-232023-1-23中等极性样品流出，保留并分析第三章高效液相色谱分析法07毫摩尔/克干树脂),使用低浓度、低电离度的有机弱酸及弱酸盐作淋洗液，如苯甲酸、苯甲酸盐等。由氧化硅、氧化铝、硅藻土等制成的多孔球体；1）流动相流速对HPLC板高的影响(与
35、GC对比)next偏转式、反射式和干涉型三种；3-5高效液相色谱的特点与仪器0024 molL-1 Na2CO3，流量138 mL/hr。液-液分配及离子对色谱法固定相（4）流动相同时还应满足检测器的要求。一台高压泵,通过比例调节阀,将两种或多种不同极性的溶剂按一定的比例抽入高压泵中混合。我国水中优先控制污染物黑名单中68种有毒污染物中6种为酚类。降低流速，柱效提高不是很大。检测特性-有否紫外吸收?荧光?采用ODS柱为固定相,甲醇-水为流动相,用HPLC分离两种弱碱性药物(pKa=89),但分离效果不理想;主要表现为柱效能低,保留时间过短.Symmetry C81212.薄壳玻璃珠为担体，表面
36、涂约1%的离子交换树脂；首选化学键合相，匀浆法装柱检测器：差示折光检测器固定相：凝胶(具有一定大小孔隙分布)；2023-1-232023-1-232023-1-232023-1-232023-1-23 平均颗粒度，颗粒度分布 颗粒度(dp)颗粒度越小：柱效越高(传质好，涡流扩散小)柱压越高(渗透性差)颗粒分布 颗粒分布越宽 柱效低(渗透性差)颗粒形状 球型 柱效高、重现性好、柱床结构均匀 无定型：柱床结构不均匀 流动相线性速度不均匀 谱带扩展对HPLC柱的了解（一）平均孔径/孔体积 孔径/孔体积分布 大的孔径可分析高分子量的分子 键合相化学 影响化合物的分离度：a 不同键合相对不同种类的化合物
37、分离不同 可能导致色谱的分离机理不同 如：C18、C8、CN对HPLC柱的了解（二）含碳量 含碳量越高，k值越大（固定相传质效应增加）高含碳量 有利于不易保留的化合物的分离 水解稳定性好，重现性好 有利于极性化合物的拖尾改善 低含碳量 有利于分析中性及碱性化合物 降低溶剂损耗不同色谱柱的含碳量 Symmetry C181917Zorbax ODS1715.7LiChrosorb RP-181510.3Symmetry C81212.5Resolve C-181212.4Ultrasphere ODS1111.3Partisil ODS-31112.0mBondpak C-1810 7.9Nov
38、a-Pak C-18 7 5.5对HPLC柱的了解(三)填料的端基封口 封口残余硅羟基 减少不可逆吸附或拖尾 增加碳含量（0.1%-1%）残基处理的效果NovaPak C18未封口未封口 C18 抗坏血酸抗坏血酸 烟酰胺烟酰胺 对氨基苯甲酸对氨基苯甲酸 哌咯西叮哌咯西叮 核黄素核黄素 苯酚苯酚 盐酸硫胺盐酸硫胺对HPLC柱的了解（四）硅胶的活性 主要影响碱性化合物的保留行为：k 生产硅胶时处理温度不同，硅胶活性也不同 是选择性差异的主要来源 硅胶的杂质含量 重金属含量低，硅羟基活性小，拖尾减小 是色谱柱质量好坏的重要标志对HPLC柱的了解（五）填料的稳定性 硅胶填料 pH：2-8 聚合物填料
39、pH：2-12 pH值小于2时键合相水解1 2 3 4 5 6 7 8 9 pH硅胶的溶解曲线新一代硅胶基质的色谱柱 Symmetry 高纯度硅胶：Fe，Al，Mg等均10ppm 孔径100A，5m球形颗粒，端基封口 超高含碳量：C18/19%，C8/12%表面积：300 m2/g 孔体积：1mL/g 特点 好峰形，好重现性，不同的选择性，使用寿命长Waters聚合物基质的反相柱 特殊设计的多孔聚合物胶 有很宽的 pH 适应范围（2-12）可用离子抑制方法分析碱性化合物 有非常不同的选择性 柱效及韧性比相应的硅胶柱低 色谱机理不太清楚 文献背景低，用户少色谱柱的规格 内径 检测的灵敏度 样品的
40、容量 长度 分离度，理论塔板数 速度 样品的容量 检测的灵敏度2023-1-23采用采用ODS柱为固定相柱为固定相,甲醇甲醇-水为流动相水为流动相,用用HPLC分离两种弱碱性药物分离两种弱碱性药物(pKa=89),但分离效果不但分离效果不理想理想;主要表现为柱效能低主要表现为柱效能低,保留时间过短保留时间过短.试设计试设计通过改变流动相提高分离效能的方案通过改变流动相提高分离效能的方案.(10分分)2023-1-23(5)液相色谱检测器液相色谱检测器 a.紫外检测器紫外检测器 应用最广，对大部分有机化合物有响应。应用最广，对大部分有机化合物有响应。特点：特点：灵敏度高；线形范围高；流通池可做的
41、很小（1mm 10mm，容积 8L）；对流动相的流速和温度变化不敏感；波长可选，易于操作；可用于梯度洗脱。2023-1-23b.b.光电二极管阵列检测器光电二极管阵列检测器 紫外检测器的重要进展；紫外检测器的重要进展；光电二极管阵列检测器：光电二极管阵列检测器：1024个二极管阵列，各检测特定波长，计算机快速处理，三维立体谱图，如图所示。2023-1-232023-1-23光电二极管阵列检测器光电二极管阵列检测器2023-1-23c.荧光检测器荧光检测器（fluorescence detector）高灵敏度、高选择性；对多环芳烃，维生素B、黄曲霉素、卟啉类化合物、农药、药物、氨基酸、甾类化合物
42、等有响应；2023-1-23d.示差折光检测器示差折光检测器（differential refractive index detector）除紫外检测器之外应用最多的检测器；可连续检测参比池和样品池中流动相之间的折光指数差值。差值与浓度呈正比；通用型检测器（每种物质具有不同的折光指数）；灵敏度低、对温度敏感、不能用于梯度洗脱；偏转式、反射式和干涉型三种；2023-1-23示差折光检测器示差折光检测器2023-1-23液相色谱常用检测器的一般性质检测器检测器选择性选择性梯度洗梯度洗脱脱线性范线性范围围检测限检测限(g/ml)敏感性敏感性 对流速对流速对温度对温度紫外紫外紫外吸紫外吸收收可以可以1
43、0521010不敏感不敏感低低示差示差通用型通用型不可以不可以1042107不敏感不敏感104荧光荧光荧光物荧光物质质可以可以1031011不敏感不敏感低低电化学电化学电活性电活性不可以不可以1061012敏感敏感1.5%电导电导离子离子不可以不可以2104108敏感敏感2%2023-1-23一、一、影响分离的因素影响分离的因素factors influenced separation二、分离类型的选择二、分离类型的选择choice of separation types三、液相色谱的应用三、液相色谱的应用application of HPLC四、液相制备色谱四、液相制备色谱preparati
44、ve liquid chromatography五、实际应用过程注意事项五、实际应用过程注意事项3-6 3-7 3-83-6 3-7 3-8影响分离的因素与操影响分离的因素与操作条件的选择作条件的选择high performance liquid chromatograph factors influenced separation and choice of operation condition第三章第三章高效液相色谱分析法高效液相色谱分析法2023-1-23一、一、影响分离的因素影响分离的因素 factors influenced separation1.1.影响分离的因素与提高柱效的途
45、径影响分离的因素与提高柱效的途径 在高效液相色谱中,液体的扩散系数仅为气体的万分之一，则速率方程中的分子扩散项B/U较小，可以忽略不计，即：H=A+C u 故液相色谱H-u曲线与气相色谱的形状不同，如图所示。2023-1-23 液体的黏度比气体大一百倍，密度为气体的一千倍，故降低传质阻力是提高柱效主要途径。由速率方程，降低固定相粒度可提高柱效。液相色谱中，不可能通过增加柱温来改善传质。恒温 改变淋洗液组成、极性是改善分离的最直接的因素。2023-1-23 2.2.流速流速 流速大于0.5 cm/s时,Hu曲线是一段斜率不大的直线。降低流速，柱效提高不是很大。但在实际操作中，流量仍是一个调整分离
46、度和出峰时间的重要可选择参数。3.3.固定相及分离柱固定相及分离柱 气相色谱中的固定液原则上都可以用于液相色谱，其选用原则与气相色谱一样。但在高效液相色谱中，分离柱的制备是一项技术要求非常高的工作，一般很少自行制备。2023-1-23二、分离类型选择二、分离类型选择 choice of separation types2023-1-232023-1-232023-1-232023-1-232023-1-23三、三、HPLC的的应用应用 application of HPLC 1.1.环境中有机氯农药残留量分析环境中有机氯农药残留量分析 固定相：薄壳型硅胶(37 50mm)流动相：正己烷 流 速
47、：1.5 mL/min 色谱柱：50cm2.5mm(内径)检测器：差示折光检测器 可对水果、蔬菜中的农药残留量进行分析。2023-1-23有机氯农药毒性大、有机氯农药毒性大、具持久性具持久性，正被特异性更高、更易降解，正被特异性更高、更易降解的的有机磷农药和有机氮农药有机磷农药和有机氮农药取代取代，但其但其热稳定性差，易在柱热稳定性差，易在柱上降解。上降解。可用可用高效液相色谱高效液相色谱检测检测。例如，氨基甲酸酯农药是。例如，氨基甲酸酯农药是一类应用范围宽，药效高，而对哺乳动物毒性低的农药，随一类应用范围宽，药效高，而对哺乳动物毒性低的农药，随着大量生产和应用，对水环境造成了污染。由于它们热
48、稳定着大量生产和应用，对水环境造成了污染。由于它们热稳定性差，性差，不适于用气相色谱法不适于用气相色谱法测定，测定，Anderson等在测定河水等在测定河水中的氨基甲酸酯时，先将样品经过填有反相中的氨基甲酸酯时，先将样品经过填有反相 C18薄壳型填料薄壳型填料的预柱，再进人的预柱，再进人Altex Ultrasil ODS分析柱，以磷酸一乙分析柱，以磷酸一乙酸缓冲溶液和甲醇的混合液为流动相，用高灵敏度的电化学酸缓冲溶液和甲醇的混合液为流动相，用高灵敏度的电化学检测器测定，对灭害威、多菌灵等氨基甲酸酯的最低检测质检测器测定，对灭害威、多菌灵等氨基甲酸酯的最低检测质量可达量可达50430pg。20
49、23-1-232.2.稠环芳烃的分析稠环芳烃的分析 稠环芳烃多为致癌物质。固定相：十八烷基硅烷化键合相 流动相：20%甲醇-水 100%甲醇 线性梯度淋洗，2%/min 流 速：1mL/min 柱 温：50 C 柱 压：70 104 Pa 检测器：紫外检测器2023-1-23多环芳烃类不易气化，而在紫外或荧光检测器上有灵敏的响多环芳烃类不易气化，而在紫外或荧光检测器上有灵敏的响应，应，可可消除或减少无紫外吸收或无荧光信号化合物的干扰，消除或减少无紫外吸收或无荧光信号化合物的干扰，且在反相色谱柱中很好且在反相色谱柱中很好地地分离，分离，常用常用高效液相色谱法测定饮高效液相色谱法测定饮用水、地下水
50、和江、河、湖水中的多环芳烃，用二氯甲烷或用水、地下水和江、河、湖水中的多环芳烃，用二氯甲烷或环己烷进行萃取，将萃取液环己烷进行萃取，将萃取液经经佛罗里硅土或硅胶色谱柱预分佛罗里硅土或硅胶色谱柱预分离，浓缩后注离，浓缩后注入入ODS柱柱，用甲醇水或乙睛，水为流动相，用甲醇水或乙睛，水为流动相，分离各种多环芳烃，荧光或紫外分光光度检测器检测。也可分离各种多环芳烃，荧光或紫外分光光度检测器检测。也可将水样将水样经经高分子多孔材料如高分子多孔材料如 AmberliteXAD 2、XAD 4、GDX等富集，再适当的溶剂洗脱，浓缩后注等富集，再适当的溶剂洗脱，浓缩后注入入高效液相色谱高效液相色谱分析。美国
