1、第三节基因工程简介知识目标：知识目标：1简述基因工程的概念简述基因工程的概念2简述基因操作的三种基本工具的作用简述基因操作的三种基本工具的作用3简述基因工程的原理和基本操作程序简述基因工程的原理和基本操作程序4举例说出基因工程所取得的成果和发展前景举例说出基因工程所取得的成果和发展前景 基因工程的基本内容基因工程的基本内容 基因操作的工具基因操作的工具 基因操作的基本步骤基因操作的基本步骤 基因工程的成果与发展前景基因工程的成果与发展前景 基因工程与医药卫生基因工程与医药卫生 基因工程与农牧业、食品工业基因工程与农牧业、食品工业 基因工程与环境保护基因工程与环境保护精品资料 你怎么称呼老师？如
2、果老师最后没有总结一节课的重点的难点，你是否会认为老师的教学方法需要改进？你所经历的课堂，是讲座式还是讨论式？教师的教鞭“不怕太阳晒，也不怕那风雨狂，只怕先生骂我笨，没有学问无颜见爹娘”“太阳当空照，花儿对我笑，小鸟说早早早”新课标：普通高中课程标准实验教科书新课标：普通高中课程标准实验教科书科技探索之路科技探索之路 基础理论和技术的发展催生了基因工程基础理论和技术的发展催生了基因工程1.1DNA重组技术的基本工具重组技术的基本工具1.2基因工程的基本操作程序基因工程的基本操作程序 拓展视野拓展视野 历史不能忘记中国科学家对历史不能忘记中国科学家对PCRPCR的贡献的贡献1.3基因工程的应用基
3、因工程的应用 拓展视野拓展视野 神奇的基因芯片神奇的基因芯片1.4蛋白质工程的崛起蛋白质工程的崛起选修选修3现代生物科技专题现代生物科技专题专题专题1基因工程基因工程基础理论和技术的发展催生了基因工程基础理论和技术的发展催生了基因工程基因工程理论上三大突破：基因工程理论上三大突破：（1）DNA是遗传物质是遗传物质1943 美 Avery 肺炎双球菌的转化实验等。（2）DNA双螺旋结构双螺旋结构1953 美 Watson 英Crick DNA双螺旋模型；1958M.Meselson&F.Stahl用实验证明了半保留复制，不同基因具有相同不同基因具有相同的物质基础。的物质基础。（3）64个密码子破
4、译和中心法则的确立个密码子破译和中心法则的确立1958 Watson and Crick 提出中心法则，阐明了遗传信息的流动方向，多肽与基因之间存在对应多肽与基因之间存在对应关系。关系。密码形式使遗传学在分子水平上得到解释，密码子是通用的密码子是通用的技术上三大发明：技术上三大发明：（1）基因转移载体的发现基因转移载体的发现1967，T.F.Roth&D.R.Helinski，发现质粒的自我复制能力，并能够在细菌之间转移。基因是可以转移的。基因是可以转移的。（2）工具酶的发明工具酶的发明1972 H.C.Smith、W.Arber&D.Nathans从流感嗜血杆菌中分离得到限制性内切酶；197
5、0年，逆转录酶的发现使真核细胞的 基因制备成为可能；此后，多种限制酶和连接酶发现。基因是可切割基因是可切割的。的。（3）DNA体外重组的实现体外重组的实现1972年，美 Berg 第一次构建出了体外重组DNA分子。重组重组DNA表达实验的成功表达实验的成功1973，H.Boyer&S.Cohen选用仅含单一EcoRI酶切位点的载体质粒pSC101，使之与非洲爪蟾核糖体蛋白基因的DNA片段重组。重组的DNA转入大肠杆菌DNA中，转录出相应的mRNA。基因基因工程诞生元年工程诞生元年H.Boyer&S.Cohen技术进一步推动基因工程的发展：技术进一步推动基因工程的发展：（1）第一例转基因动物和转
6、基因植物问世第一例转基因动物和转基因植物问世1980 科学家通过显微注射培育出世界第一个转基因小鼠。1983，科学家采用农杆菌转化法，培育出世界上第一例转基因烟草。（2）PCR技术的发明技术的发明1988年，美 K.Mullis发明PCR技术，使基因工程进一步发展。The Nobel Prize in Chemistry 1993for his invention of the polymerase chain reaction(PCR)methodKary B.Mullis La Jolla,CA,USA 4基因工程的发展历史基因工程的发展历史1）1972年美国年美国Berg,Jackson
7、等人将等人将基因工程的发展历史基因工程的发展历史1）1972年美国年美国Berg,Jackson等人将猿猴病基因组等人将猿猴病基因组SV40DNA,噬菌体基因噬菌体基因，大肠杆菌半乳糖操纵子，大肠杆菌半乳糖操纵子，体外重组获得成功。体外重组获得成功。2）1973年美国斯坦福大学年美国斯坦福大学Cohen,Boyer等，在体外构建含有四环素，链霉等，在体外构建含有四环素，链霉素两个抗性基因的重组质粒分子素两个抗性基因的重组质粒分子,导入大肠杆菌后稳定复制，赋予受体导入大肠杆菌后稳定复制，赋予受体细细胞相应抗生素抗性。胞相应抗生素抗性。-（宣告基因工程诞生）（宣告基因工程诞生）3）1978年美国年
8、美国Genentech公司利用重组大肠杆菌合成人胰島素的先进生产公司利用重组大肠杆菌合成人胰島素的先进生产工艺工艺-（揭开基因工程产业化的序幕）（揭开基因工程产业化的序幕）4）1983年，携带有细菌新霉素抗性基因的重组年，携带有细菌新霉素抗性基因的重组Ti质粒转化植物细胞获得成质粒转化植物细胞获得成功功-（高等植物转基因技术问世）（高等植物转基因技术问世）5）1990年，美国科学家对一名因腺苷脱氨酶基因缺陷患有重度联合免疫缺年，美国科学家对一名因腺苷脱氨酶基因缺陷患有重度联合免疫缺陷症的儿童进行基因治疗获陷症的儿童进行基因治疗获得成功。得成功。-（分子医学新纪元）（分子医学新纪元）6）1991
9、年，美国倡导在全球实施人类基因组计划，用年，美国倡导在全球实施人类基因组计划，用15年时间斥资年时间斥资30亿美亿美元，完成元，完成12万万5000个人类基因的全部测序工作。个人类基因的全部测序工作。7）1997年，英国科学家利用体细胞克隆技术复制出年，英国科学家利用体细胞克隆技术复制出“多利多利”绵绵羊。羊。-（人类可以在实验室进行复制自身的尝试）（人类可以在实验室进行复制自身的尝试）2005年，邓宏魁，丁明孝教授克隆小白鼠在中国属首例。年，邓宏魁，丁明孝教授克隆小白鼠在中国属首例。遗传工程（基因工程）研究的意义遗传工程（基因工程）研究的意义（1）说明两种能力）说明两种能力A.基因工程，它超
10、越生物种属界限基因工程，它超越生物种属界限,具有跨越天然物种屏具有跨越天然物种屏障的能力障的能力.B.把来自任何一种生物的基因，放置在与其毫无亲缘关系把来自任何一种生物的基因，放置在与其毫无亲缘关系的新的寄主生物细胞中的能力。的新的寄主生物细胞中的能力。（2）表明一种创造性）表明一种创造性应用这一技术，有可能按照人们的主观愿望，创造出应用这一技术，有可能按照人们的主观愿望，创造出自然界中原先并不存在的新的生物类型。自然界中原先并不存在的新的生物类型。（3）简化生物物种进化程序，加快生物物种进化速度）简化生物物种进化程序，加快生物物种进化速度.（4）强调了一种事实：确定的）强调了一种事实：确定的
11、DNA小片段在新寄主细胞中小片段在新寄主细胞中进行扩增的事实进行扩增的事实可以制备到大量纯化的可以制备到大量纯化的DNA片段片段.（5）从而拓宽了分子生物学的研究领域。）从而拓宽了分子生物学的研究领域。“工欲善其事，必先利其器”DNA重组技术的基本工具限制性内切酶基因的剪刀DNA连接酶基因的针线运载体基因的运输工具1.限制性内切酶限制性内切酶(Restriction Endonuclease)(Restriction Endonuclease)概念概念 l 存在于任何一种原核细菌中存在于任何一种原核细菌中.l l识别双链识别双链DNA中特殊核苷酸序列，并在合适的反中特殊核苷酸序列，并在合适的反
12、应条件下，使应条件下，使位点上催化双链位点上催化双链DNADNA分子的磷酸二酯键分子的磷酸二酯键断裂断裂,切割产生切割产生5-P、3-OH分子分子,切割成两种末端：切割成两种末端：平端和粘端平端和粘端 l l各种生物呈现特征性的限制性内切酶酶切图谱各种生物呈现特征性的限制性内切酶酶切图谱.识别特定序列识别特定序列 l l在生物分类在生物分类,基因定位基因定位,基因重组基因重组,疾病诊断疾病诊断,刑事刑事侦察领域极为重要侦察领域极为重要HamiltonSmith,DanielNathans(USA)andWernerArber(Switzerland)1978Nobelprize The Nob
13、el Prize in Physiology or Medicine 1978for the discovery of restriction enzymes and their application to problems of molecular genetics限制性内切酶的发现：限制性内切酶的发现：(宿主细胞的限制和修饰作用宿主细胞的限制和修饰作用)限制：限制：细菌的自我保护系统病毒的侵染细菌的自我保护系统病毒的侵染修饰：修饰：修饰系统防止自杀修饰系统防止自杀（1 1）两种不同来源的入）两种不同来源的入-噬菌体噬菌体入入K K，入，入B B；（2 2）能高频感染各自大肠杆菌宿）能高频
14、感染各自大肠杆菌宿主细胞主细胞 K K株，株，B B株株（3 3）当它们分别与其它宿主菌交）当它们分别与其它宿主菌交叉混合培养时，感染下降数千倍。叉混合培养时，感染下降数千倍。（4 4）一但）一但 入入K K 噬菌体在噬菌体在B B株成功，株成功，由由 B B 株繁殖出株繁殖出 入入K K 后代，能感染后代，能感染 B B 株株,不能感染原来不能感染原来 K K株株.限制性内切酶对抗外来限制性内切酶对抗外来DNA细菌细胞细菌细胞病毒病毒病毒病毒DNA限制性内限制性内切酶切酶病毒注入病毒注入DNA分子分子限制性内切酶切割入限制性内切酶切割入侵的侵的DNA切切割割修饰酶修饰酶EcoRI修饰酶修饰酶
15、加甲基加甲基特点特点1 1）识别序列：）识别序列：4 4，5 5 或或 6 6个碱基对个碱基对 EcoR IEcoR I识别识别 5-G/AATTC-3 5-G/AATTC-3 序列序列 3-CTTAA/G-53-CTTAA/G-52 2）180180度旋转对称回文结构，对称轴在第三，四碱基之间。度旋转对称回文结构，对称轴在第三，四碱基之间。3 3）任何一个）任何一个DNADNA分子，每分子，每9 9对碱基出现一个对碱基出现一个IIII类酶切口。类酶切口。限制性内切酶及其缓冲液限制性内切酶及其缓冲液2.DNA连接酶连接酶（DNA ligase）DNADNA双链分子上相邻双链分子上相邻33羟基和
16、羟基和55磷酸基团共价结合，磷酸基团共价结合，形成形成3-53-5磷酸二酯键，使原来断开的缺口重新连接磷酸二酯键，使原来断开的缺口重新连接起来。起来。DNA片断怎么连起来？片断怎么连起来？3.运载体运载体载体的三大功能：载体的三大功能：1 1）为外源基因提供进入受体细胞的转移能力。）为外源基因提供进入受体细胞的转移能力。2 2）为外源基因提供在受体细胞的的复制能力或整合力。）为外源基因提供在受体细胞的的复制能力或整合力。3 3）为外源基因提供在受体细胞的的扩增和表达能力。）为外源基因提供在受体细胞的的扩增和表达能力。用什么方法将目的基因送入细胞？用什么方法将目的基因送入细胞？假如目的基因导入受
17、体细胞后不能复制将怎样假如目的基因导入受体细胞后不能复制将怎样“分子运输车分子运输车”应该具备什么特点？应该具备什么特点？理想载体具备四个条件：理想载体具备四个条件：1)1)具有对受体细胞的可转移具有对受体细胞的可转移性，提 高 导 入 细 胞 的 效性，提 高 导 入 细 胞 的 效率。率。对受体细胞无害、对受体细胞无害、易分离。易分离。2)2)具有与特定受体细胞相适具有与特定受体细胞相适应的复制位点或整合位点，应的复制位点或整合位点，使外源基因在受体细胞中稳使外源基因在受体细胞中稳定遗传。定遗传。能自我复制能自我复制3)3)具有多种单一的限制性内具有多种单一的限制性内切酶识别切割位点，有利
18、于切酶识别切割位点，有利于外源基因的拼接插入外源基因的拼接插入有切割位点有切割位点4)4)具有合适的选择标记（报具有合适的选择标记（报告基因），便于告基因），便于DNADNA重组分重组分子的检测。子的检测。有遗传标记有遗传标记基因基因4.364.36(kb)(kb)大肠杆菌源质粒；含复制起始位点，能在大肠杆菌源质粒；含复制起始位点，能在大肠杆菌中高拷贝复制；含氨卞青霉素抗性基因大肠杆菌中高拷贝复制；含氨卞青霉素抗性基因（Ampr）和四环素抗性基因（）和四环素抗性基因（Tetr）选择标记基因，）选择标记基因，对重组子进行筛选；含多个限制性内切酶酶切位点；对重组子进行筛选；含多个限制性内切酶酶切位
19、点；克隆载体；克隆载体；载体有两个抗药载体有两个抗药性基因，插入失性基因，插入失活一个抗药性基活一个抗药性基因，而在另一个因，而在另一个基因筛选标记存基因筛选标记存活的是转化子，活的是转化子，在插入失活的基在插入失活的基因筛选标记中不因筛选标记中不存活的是转化子。存活的是转化子。质粒的构建与改造质粒的构建与改造1)1)删除不必要的删除不必要的DNADNA区域，缩小分子量，提高外源区域，缩小分子量，提高外源DNADNA片段装载量。片段装载量。2)2)灭活某些质粒的编码基因。灭活某些质粒的编码基因。3)3)加入易于识别的选择标记基因。加入易于识别的选择标记基因。4 4）选择标记基因内引入内切酶的识
20、别及酶切位点）选择标记基因内引入内切酶的识别及酶切位点的序列的序列多克隆接头多克隆接头(Polylinker)(Polylinker)。5)5)加入特殊的基因表达调控元件。加入特殊的基因表达调控元件。实验：模拟重组实验：模拟重组DNA入入-双链噬菌体双链噬菌体 由 头 部 外 壳 蛋 白 和由 头 部 外 壳 蛋 白 和 48.5 kb 48.5 kb 双链双链DNA DNA 组成，组成，入入-DNA-DNA两端各有一个两端各有一个1212碱基组成互补单链碱基组成互补单链,称称coscos末端，末端，cos cos 末端将末端将DNADNA引入头引入头部，部，噬菌体的头部空壳蛋白噬菌体的头部空
21、壳蛋白对对 入入DNA DNA 的包装与其序列的包装与其序列无关无关,只识别只识别COSCOS位点位点。固体平板培养基出现透明斑固体平板培养基出现透明斑点（噬菌斑）点（噬菌斑）.液体液体培养液由培养液由 混浊变澄清混浊变澄清，说明大肠杆菌，说明大肠杆菌完全被裂解。完全被裂解。噬菌斑是经过若干裂解周期噬菌斑是经过若干裂解周期形成宿主菌死亡区域。形成宿主菌死亡区域。提取目的基因提取目的基因目的基因与运载体结合目的基因与运载体结合将目的基因导入受体细将目的基因导入受体细胞胞目的基因的检测和表达目的基因的检测和表达基因工程的基基因工程的基本操作程序本操作程序基因工程的基本过程基因工程的基本过程1)切切
22、用限制性内切酶切开外源基因和载体分子。用限制性内切酶切开外源基因和载体分子。2）接）接用连接酶将外源基因连接到载体分子上。用连接酶将外源基因连接到载体分子上。3）转）转借助细胞转化将借助细胞转化将DNA重组分子导入细胞。重组分子导入细胞。4）增）增培养转化细胞，扩增培养转化细胞，扩增DNA重组分子。重组分子。5）检）检筛选和鉴定转化细胞及目的基因。筛选和鉴定转化细胞及目的基因。鸟枪法鸟枪法(Shotgun)将某种生物体的全基因组或单一染色体切成大小适宜的片段，分别连接到载将某种生物体的全基因组或单一染色体切成大小适宜的片段，分别连接到载体上，转化受体细胞，形成一套重组克隆，筛选出含有目的基因期
23、望重组子。体上，转化受体细胞，形成一套重组克隆，筛选出含有目的基因期望重组子。鸟枪法局限性：鸟枪法局限性：如同盲人打鸟而得名，工作量很大，克隆含有目的基因的片段。如同盲人打鸟而得名，工作量很大，克隆含有目的基因的片段。90%90%真核生物真核生物中目的基因中含有内含子，真核生物中目的基因不能在原核细菌中表达。中目的基因中含有内含子，真核生物中目的基因不能在原核细菌中表达。（1）目的基因组）目的基因组DNA片段的制备。片段的制备。如：机械切割，用超声波处理，采用合适强度和时间。切割的如：机械切割，用超声波处理，采用合适强度和时间。切割的DNA片段控制一片段控制一定大小范围内，上限是载体最大装载量
24、，下限应大于目的基因长度。定大小范围内，上限是载体最大装载量，下限应大于目的基因长度。（2）外源）外源DNA片段的全克隆。片段的全克隆。选质粒或选质粒或DNA作为载体。受体细胞选大肠杆菌。作为载体。受体细胞选大肠杆菌。（3）期望重组子的筛选。）期望重组子的筛选。菌落，菌斑原位杂交法，外源基因产物功能检测法。菌落，菌斑原位杂交法，外源基因产物功能检测法。（4）目的基因的定位。）目的基因的定位。在已知克隆的在已知克隆的DNA片段上准确定位目的基因后，进行序列测定。片段上准确定位目的基因后，进行序列测定。提取目的基因提取目的基因cDNAcDNA法：法：cDNAcDNA文库（文库（cDNA Bankc
25、DNA Bank）cDNAcDNA是与是与mRNAmRNA互补的互补的DNA(Complementary DNA)DNA(Complementary DNA)，将，将供体生物细胞的供体生物细胞的mRNAmRNA分离出来，利用逆转录酶在体外合成分离出来，利用逆转录酶在体外合成cDNAcDNA，克隆在受体细胞内，筛选获得含有目的基因编码序，克隆在受体细胞内，筛选获得含有目的基因编码序列的重组克隆。列的重组克隆。优点：优点：（1 1）能选择性克隆蛋白编码基因，由）能选择性克隆蛋白编码基因，由mRNAmRNA反转录合成反转录合成cDNAcDNA对特的基因而言只有一种可能性。对特的基因而言只有一种可能性
26、。（2 2）cDNAcDNA法克隆基因相当法克隆基因相当“纯净纯净”，不含，不含55端调控区，端调控区，剔除内含子结构，有利于原核细胞的表达。剔除内含子结构，有利于原核细胞的表达。（3 3）比相应的基因组拷贝要小数十倍，）比相应的基因组拷贝要小数十倍，2-3 Kb2-3 Kb或更小，或更小，便于稳定地克隆在表达型质粒上便于稳定地克隆在表达型质粒上。发明发明PCR，公司奖励，公司奖励10,000美元奖金美元奖金 专利卖给专利卖给Hoffmann-LaRoche公司卖公司卖了了3亿美元亿美元 Mullis得了得了1993年诺贝尔化学奖年诺贝尔化学奖利用利用PCRPCR技术扩增目的基因技术扩增目的基
27、因PCR扩增上亿个扩增上亿个拷贝（几个小时），拷贝（几个小时），而癌症细胞以高复而癌症细胞以高复制能力而著称，完制能力而著称，完成同样的多制工作成同样的多制工作一个癌症细胞需要一个癌症细胞需要整整一个月。整整一个月。化学合成法：化学合成法：前提前提a.a.如果目的基因的全序列是已知的，用化学合成法直接合成。如果目的基因的全序列是已知的，用化学合成法直接合成。b.DNAb.DNA自动合成仪可合成不超过自动合成仪可合成不超过5050个碱基寡聚核苷酸单链。个碱基寡聚核苷酸单链。c.c.用于核酸杂交的探针，分子克隆的人工接头，用于核酸杂交的探针，分子克隆的人工接头，PCRPCR扩增的扩增的引物。引物。
28、d.d.由单链寡聚核苷酸通过退火直接装备双链由单链寡聚核苷酸通过退火直接装备双链DNADNA片段或基因。片段或基因。基因文库，理论上它含有某一生物染色体的所有基因文库，理论上它含有某一生物染色体的所有DNADNA片段，包括基片段，包括基因编码区和间隔区因编码区和间隔区DNADNA。由鸟枪法和。由鸟枪法和cDNAcDNA法构建。鸟枪法构建的为法构建。鸟枪法构建的为基因组文库基因组文库 (Genomic Bank)(Genomic Bank)。cDNAcDNA文库文库,含有生物体的全套蛋白质编码序列含有生物体的全套蛋白质编码序列,不含不含DNADNA调控序列从调控序列从cDNAcDNA文库筛选蛋白
29、质编码基因，比从基因文库筛选要简捷。文库筛选蛋白质编码基因，比从基因文库筛选要简捷。目的基因与运载体的结目的基因与运载体的结合合表达载体的构建表达载体的构建 目的基因目的基因 启动子和终止子启动子和终止子 标记基因标记基因 核糖体结合位点核糖体结合位点的强弱的强弱 克隆基因的拷贝数克隆基因的拷贝数 所表达的蛋白质的最终细胞定位所表达的蛋白质的最终细胞定位 翻译的效率翻译的效率 所表达的蛋白质的稳定性所表达的蛋白质的稳定性目的是使目的基因在受体细目的是使目的基因在受体细胞中稳定存在，遗传到下一胞中稳定存在，遗传到下一代，同时使目的基因表达发代，同时使目的基因表达发挥作用。挥作用。什么是强启动子？
30、什么是强启动子？与与RNA聚合酶结合能力强聚合酶结合能力强,因此，其介导的基因转因此，其介导的基因转录水平高、频繁录水平高、频繁持续强启动子表达的弱点持续强启动子表达的弱点 能量枯竭导致宿主细胞生长受阻能量枯竭导致宿主细胞生长受阻 质粒容易丢失质粒容易丢失将目的基因导入受体细胞将目的基因导入受体细胞目的基因导入微生物细胞：细菌转化五个步骤目的基因导入微生物细胞：细菌转化五个步骤1 1）感受态的形成）感受态的形成 感受态细胞能分泌一种小分子量的激活蛋白，感受因子，诱导特征性蛋白感受态细胞能分泌一种小分子量的激活蛋白，感受因子，诱导特征性蛋白（细胞溶素）合成，使细胞壁部分溶解（细胞溶素）合成，使细
31、胞壁部分溶解,暴露膜上暴露膜上DNADNA结合的蛋白。结合的蛋白。2 2）转化因子结合）转化因子结合 受体菌膜上的结合蛋白与转化因子的双链受体菌膜上的结合蛋白与转化因子的双链DNADNA结构特异结合。单链结构特异结合。单链DNA,RNA,DNA-RNADNA,RNA,DNA-RNA杂合双链都不能结合在膜上。杂合双链都不能结合在膜上。3 3）转化因子吸收）转化因子吸收 双链双链DNADNA结构与蛋白特异结合后，激活核酸酶，一条链被降解，另一条被吸结构与蛋白特异结合后，激活核酸酶，一条链被降解，另一条被吸受到受体菌中。受到受体菌中。4 4）整合复合物前体形成）整合复合物前体形成 整合复合物前体：进
32、入受体细胞单链整合复合物前体：进入受体细胞单链DNADNA与蛋白特异结合。保护单链与蛋白特异结合。保护单链DNADNA不被不被酶降解。酶降解。5 5）转化因子单链）转化因子单链DNADNA整合整合 单链单链DNADNA通过同源重组，置换受体染色体同源区域，形成异源杂合双链通过同源重组，置换受体染色体同源区域，形成异源杂合双链DNADNA结结构。构。将目的基因导入植物细胞将目的基因导入植物细胞 土壤农杆菌法土壤农杆菌法 基因枪法基因枪法 花粉管通道法花粉管通道法1987年，周年，周光宇中国的光宇中国的转基因棉花转基因棉花原理不明原理不明土壤农杆菌法土壤农杆菌法冠瘿病冠瘿病侵染双子叶植物基基因因枪
33、枪法法 打一枪即可打一枪即可10000个整合细胞个整合细胞/枪枪 火药、气压等火药、气压等300-600米米/秒秒 DNA随机插入，原理不明随机插入，原理不明目的基因导入动物细胞目的基因导入动物细胞如：显微注射法如：显微注射法 DNA损失少损失少 无需选择标记基因整合效率高无需选择标记基因整合效率高目的基因的检测和表达目的基因的检测和表达基因克隆基因克隆用于在选定的用于在选定的host中表达中表达但是但是克隆的基因不一定能表达克隆的基因不一定能表达克隆载体不一定是好的表达载体克隆载体不一定是好的表达载体目的基因是否进入受体细胞，你如何去察觉？目的基因是否进入受体细胞，你如何去察觉？1 1。抗药
34、性筛选法。抗药性筛选法2.2.营养缺陷性筛选法营养缺陷性筛选法载体分子携带营养成分（氨基酸，核苷酸）的生物合成基载体分子携带营养成分（氨基酸，核苷酸）的生物合成基因，受体细胞基因突变，不能合成营养物质。两者构成营因，受体细胞基因突变，不能合成营养物质。两者构成营养缺陷。养缺陷。在缺少营养物质的培养基上受体细胞不存活，存活的是转在缺少营养物质的培养基上受体细胞不存活，存活的是转化子。化子。3.3.显色模型筛选法显色模型筛选法LacZ,-LacZ,-半乳糖苷酶基因，用于筛选重组子。半乳糖苷酶基因，用于筛选重组子。4.4.植物细胞中的报告基因：颜色、发光、抗生素、除草剂植物细胞中的报告基因：颜色、发光、抗生素、除草剂等等
