遗传修饰动物模型课件.ppt

1、遗传修饰动物模型第一节转基因动物的概念及其发展简史转基因动物(transgenic animal)：是指基因组中整合有外源基因、外源基因能够表达并按孟德尔定律遗传的一类动物。转基因(transgene)：将外源基因整合入动物基因组中的操作。嵌合体动物(chimera)：部分组织中整合有外源基因的动物。第一节转基因动物的概念及其发展简史转基因的三个层次：转基因的三个层次：细菌转基因细菌转基因离体真核细胞转基因离体真核细胞转基因生物转基因生物转基因第一节转基因动物的概念及其发展简史 人类疾病动物模型(Animal models of human diseases)是指在医学研究中，在动物身上建立，

2、或形成类似人类疾病动物。通过动物模型直接，或间接反映疾病的发生和发展过程，在了解疾病的基础上开创和改进、优化疾病的治疗。第一节转基因动物的概念及其发展简史 转基因技术是在基因工程和胚胎工程的基础上发展起来的 1961年，Tarkowski等将小鼠卵裂期不同品系的胚胎细胞融合后，形成了嵌合体小鼠；1974年，Jaenisch和Mintz将SV40DNA注射入小鼠囊胚中，在小鼠的体细胞检测到病毒DNA序列；1980年，Gordon首次将重组的DNA注射到小鼠体细胞中；第一节转基因动物的概念及其发展简史1982年，Palmiter将金属巯基(MTI)基因启动子控制的大鼠生长激素基因转入侏儒小鼠的受精

3、卵，得到的7只转基因鼠中，有6只生长明显加快，体重远大于正常对照，被称为“超级小鼠”(Supermice)。82年以后，转基因技术得到了大力的推广和研究，至今已制备出小鼠、大鼠、鸡、兔、猪、羊、鱼等转基因品系。1、第一例嵌合体小鼠 19741974年最早把猿猴病毒年最早把猿猴病毒40(SV40)40(SV40)注入小鼠囊胚腔中得到部分组注入小鼠囊胚腔中得到部分组织中含有织中含有SV40DNASV40DNA的嵌合体小鼠。但无任何表型改变。的嵌合体小鼠。但无任何表型改变。2、第一个转基因小鼠系 19761976年建立了世界上第一个转基因小鼠系，这些小鼠基因年建立了世界上第一个转基因小鼠系，这些小鼠

4、基因组中插人了莫氏白血病病毒基因。他们是运用反转录病毒与小组中插人了莫氏白血病病毒基因。他们是运用反转录病毒与小鼠卵裂球共培养把外源鼠卵裂球共培养把外源DNADNA插入到小鼠的基因组中。插入到小鼠的基因组中。3、第一例显微注射法产生转基因小鼠 19801980年，年，GordnGordn等把等把SV40DNASV40DNA显微注射到小鼠受精卵的原核显微注射到小鼠受精卵的原核中，获得了两只转基因小鼠，创建了显微注射转基因方法。中，获得了两只转基因小鼠，创建了显微注射转基因方法。4 4、“超级鼠超级鼠”19821982年，年，PalmiterPalmiter和和BrinsterBrinster用此

5、方法把大鼠的生长激素基因用此方法把大鼠的生长激素基因导入小鼠受精卵，获得了成年体重是对照导入小鼠受精卵，获得了成年体重是对照组小鼠组小鼠2 2倍的倍的“超级鼠超级鼠”，首先证明外源基，首先证明外源基因可在受体中表达，并且表达产物具有生因可在受体中表达，并且表达产物具有生物活性。物活性。5 5、转基因家畜的产生转基因家兔、绵羊和、转基因家畜的产生转基因家兔、绵羊和猪猪(Hammer(Hammer等，等，1985)1985)、牛、牛(Bondioli(Bondioli等，等，1988)1988)和山羊和山羊(Ebert(Ebert等，等，1991)1991)等相继出世。等相继出世。6 6、利用转基

6、因生产重组蛋白、利用转基因生产重组蛋白 19871987年，年，SimonsSimons等在转基因小鼠的乳汁中得到绵羊的等在转基因小鼠的乳汁中得到绵羊的-球蛋白，球蛋白，19881988年，该研究小组又从转基因绵羊的乳汁年，该研究小组又从转基因绵羊的乳汁中得到了中得到了-抗胰蛋白酶。目前，已有数十种蛋白实现了抗胰蛋白酶。目前，已有数十种蛋白实现了转基因生产。转基因生产。7 7、转、转YACYAC的转基因小鼠的转基因小鼠 近近1010年内，陆续出现用全长酵母人工染色体（年内，陆续出现用全长酵母人工染色体（YACYAC）DNADNA来产生转基因小鼠。来产生转基因小鼠。东北农业大学国内首例绿色荧光蛋

7、白东北农业大学国内首例绿色荧光蛋白“转基因转基因”克隆猪克隆猪 绿色荧光蛋白猪胎儿成纤维细胞克隆绿色荧光蛋白猪胎儿成纤维细胞克隆 1987年，世界上第一只商业化转基因绵羊年，世界上第一只商业化转基因绵羊在英国著名的罗斯林研究所诞生。转基因在英国著名的罗斯林研究所诞生。转基因母羊的乳汁中可以分泌母羊的乳汁中可以分泌-抗胰蛋白酶。抗胰蛋白酶。2010年，FDA批准转基因鲑鱼绝缘子元件阻断邻近增强子的活性2）打靶载体的筛选标志超排卵与取卵 选择46周龄母鼠，注射孕马血清促性腺激素（PMSG）后，隔4248h再注射人绒毛膜促性腺激素（HCG），注射HCG后1013h剖腹取卵，用培养液保存，置CO2培养

8、箱备用。是一种编码可被检测的蛋白质或酶的基因，也就是说，是一个其表达产物非常容易被鉴定的基因。同源重组分解特定基因的定向基因要考虑特定基因产物的精确分析外源DNA导入精细胞的方法有DNA与精子共育法、电穿孔导入法、脂质体转染法。2、留下的选择标记及其启动子、增强子可能会影响邻近基因的表达第三节 用基因打靶建立动物模型近10年内，陆续出现用全长酵母人工染色体（YAC）DNA来产生转基因小鼠。第二节研制转基因动物的基本步骤2)整合转基因拷贝数有很高的差异.剪下子宫、输卵管，并置于平皿中；7、筛选的-/-、+/-子二代小鼠。拔出显微注射针解除固定管的负压，操作完成。Southern印迹杂交和FISH

9、(荧光原位杂交)：确定整合位置；转基因动物的意义：基因的整体功能的阐明只有在活体内通过整体动物的研究才能达到；转基因动物是生物医学研究、新药开发、毒理学、安全性评价的重要工具。转基因动物用途：（l）疾病型转基因动物；（2）利用转基因动物制药；（3）动物改良型；（4）基础生物学研究第一节转基因动物的概念及其发展简史（l l）疾病型转基因动物）疾病型转基因动物 替代：替代：避免了人体实验造成的风险和伦理问题避免了人体实验造成的风险和伦理问题。潜伏期长，病程长和发病率低的疾病潜伏期长，病程长和发病率低的疾病 可控：可控：品系，感染病原体品系，感染病原体 实验环境实验环境 方便：方便：样品收集样品收集

10、 结果分析容易（统计）；结果分析容易（统计）；人畜共患病比较，研究疾病机理人畜共患病比较，研究疾病机理（2 2）利用转基因动物制药：）利用转基因动物制药：生物反应器重组蛋白药物生物反应器重组蛋白药物 欧洲医药评价署人用医药产品委员会欧洲医药评价署人用医药产品委员会 2006年年6月月2日首次日首次批准了用转基因山羊奶研制而成的抗血栓药物批准了用转基因山羊奶研制而成的抗血栓药物Atryn（抗（抗凝血酶）上市凝血酶）上市 目前世界上还有利用转基因绵羊、牛和兔乳腺生物反应器目前世界上还有利用转基因绵羊、牛和兔乳腺生物反应器生产的人生产的人-抗胰蛋白酶（抗蛋白酶缺乏性肺气肿药物）、抗胰蛋白酶（抗蛋白酶

11、缺乏性肺气肿药物）、重组组织血纤维蛋白溶酶原激活剂（抗栓药）和人重组组织血纤维蛋白溶酶原激活剂（抗栓药）和人C1抑抑制剂（治疗血管神经性水肿的药物）等重组蛋白药物也已制剂（治疗血管神经性水肿的药物）等重组蛋白药物也已经完成或进入临床经完成或进入临床期试验，特别是治疗性抗体药物，发期试验，特别是治疗性抗体药物，发展潜力更大。展潜力更大。目前已在下列动物的乳汁中生产出一些人类蛋白质药物：牛：抗凝血酶、纤维蛋白原、人血清白蛋白、胶原蛋白、乳铁蛋白、糖基转移酶、蛋白C等；山羊：抗凝血酶原、抗胰蛋白酶、血清白蛋白、组织纤溶原激活因子、单克隆抗体等；绵羊：抗胰蛋白酶、凝血因子、蛋白C；猪：凝血因子、蛋白C

12、、纤维蛋白原、血红蛋白。第二节研制转基因动物的基本步骤1.转基因载体的构建2.将外源基因引入受体胚胎3.通过胚胎移植和基因型鉴定获得携带外源基因的转基因动物4.通过转基因动物的表型分析研究外源基因的功能第二节研制转基因动物的基本步骤基本原理 将改建后的目的基因用显微注射等方法注入实验动物的受精卵，然后将此受精卵再植入受体动物的输卵管中，使其发育成携带有外源基因的转基因动物，人们可以通过转入外源基因培育优良品种的工程动物等。目的基因的分离与克隆目的基因的分离与克隆表达载体构建表达载体构建卵母细胞的收集卵母细胞的收集体外成熟培养体外成熟培养基因导入基因导入转基因胚胎的获得转基因胚胎的获得获得子代动

13、物获得子代动物转基因胚胎的移植转基因胚胎的移植转基因整合表达的检测转基因整合表达的检测获得转基因动物获得转基因动物受体动物的选择受体动物的选择构建转基因载体构建转基因载体含有外源目的基因的重组载含有外源目的基因的重组载体导入受体胚胎体导入受体胚胎转基因胚胎的发育及鉴定转基因胚胎的发育及鉴定通过转基因动物表型分析研究外源基因的功能通过转基因动物表型分析研究外源基因的功能 转基因动物的技术路线转基因动物的技术路线 经典的技术路线 目的基因 显微注射显微注射 已交配的 受体动物 供体动物 输卵管 转基因动物 取出取出 移植移植 妊娠妊娠 缺点：注入目的基因的命中率低，目的基因的整合率低，受精卵移植的

14、受孕率低。受精卵转基因动物的技术路线转基因动物的技术路线(续续)整合胚胎移植的技术路线 转基因动物 受体动物子宫 目的基因 非手术非手术 胚胎移植胚胎移植 体外受精体外受精 体外培养体外培养 检测检测 卵子 受精卵 多细胞胚胎 整合外源基因精子 或囊胚 的胚胎优点：优点：受精卵的成活率高达受精卵的成活率高达90以上，外源基因整合率高，以上，外源基因整合率高，提高受孕率。提高受孕率。为什么有转基因技术还要开展基因打靶技术？第二节研制转基因动物的基本步骤逆转录病毒可用于动植物细胞的插入；5、子代嵌合体的鉴定，杂交生成纯合子显微注射法 显微注射法是在显微注射仪上，一侧用吸管固定受精卵，另一侧将注射针

15、插入受精卵原核（一般是雄原核）。HPRT-ES cell+：半合子 X 半合子6、利用转基因生产重组蛋白绝缘子元件阻断邻近增强子的活性第三节 用基因打靶建立动物模型（ES细胞，Embryostemcell）是指囊胚期的内细胞团中尚未进行分化的细胞，这种细胞具有类似癌细胞无限繁殖和高度分化的潜能。受精卵雄原核显微注射法：（l）疾病型转基因动物；整合卵受精的技术路线：目的基因 转基因动物 导入 逆转录病毒 妊娠 精子 感染 体外受精 胚胎移植 卵母细胞 成熟卵细胞 囊胚 受体动物子宫 特点：卵母细胞导入目的基因后再与精子受精。基因敲除载体策略：插入型和置换型 转基因动物的技术路线（续）转基因动物的

16、技术路线（续）整合卵受精的技术路线：目的基因 转基因动物 导入导入 逆转录病毒 妊娠妊娠 精子 感染感染 体外受精体外受精 胚胎移植胚胎移植 卵母细胞 成熟卵细胞 囊胚 受体动物子宫 特点：卵母细胞导入目的基因后再与精子受精。转基因动物的技术路线（续）转基因动物的技术路线（续）核移植（克隆）的技术路线 目的基因 转基因动物 导入导入 动物胚胎成纤维细胞 妊娠妊娠 取核取核 动物 重组的 囊胚期 受体动物卵细胞 受精卵 胚胎 子宫 去核去核 体外培养体外培养 胚胎移植胚胎移植 特点：体细胞核移植；核移植前导入目的基因。特点：体细胞核移植；核移植前导入目的基因。表达调控元件目的基因 报告基因 如果

17、观察外源基因表达所引起的生物学效应，可选择表达水平高而无组织特异性的强启动子，如CMV、pGK等；如果希望观察外源基因在特定组织器官中的功能，应选用组织特异性启动子，如肝蛋白启动子、胰岛素启动子等；可诱导型启动子调控外源基因的表达。1.外源目的基因的分离外源目的基因的分离 2.外源目的基因与转性基因表达启动子、增外源目的基因与转性基因表达启动子、增强子、报告基因等构件的拼接重组强子、报告基因等构件的拼接重组 3.重组重组DNA导入生殖细胞或胚胎干细胞导入生殖细胞或胚胎干细胞 4.胚胎移植技术胚胎移植技术 5.鉴定及筛选鉴定及筛选 6.目的基因整合率及表达效率的检测目的基因整合率及表达效率的检测

18、转基因动物的关键技术包括转基因动物的关键技术包括第二节研制转基因动物的基本步骤转基因载体的构建及制备转基因载体的要求：启动子启动子目的基因目的基因报告基因报告基因多聚腺苷酸化信号多聚腺苷酸化信号绝缘子绝缘子第二节研制转基因动物的基本步骤启动子：启动子：组成型启动子组织特异型启动子诱导型启动子诱导型组织特异型启动子第二节研制转基因动物的基本步骤Kozak序列（ACCAUGG）：核糖体能够识别mRNA上的这段序列，并把它作为翻译起始位点。注意这段序列并不是ribosomal binding site(RBS)核糖体结合位点，而是帽子结构。真核生物基因中起始密码子上下游的最佳序列为，-3位为嘌呤碱基

19、；+4位为G，起始密码子AUG中的A处于+1位。A/GCCAUGG被称为kozak序列或扫描序列。第二节研制转基因动物的基本步骤KOZAK是一个女科学家，她研究过起始密码子AUG周边碱基定点突变后对转录和翻译所造成的影响，并总结出在真核生物中，起始密码子两端序列为：G/N-C/N-C/N-ANNAUGG，如GCCACCAUGG、GCCAUGAUGG时，转录和翻译效率最高，特别是-3位的A对翻译效率非常重要。该序列被后人称为Kozak序列，并被应用于表达载体的构建中。第二节研制转基因动物的基本步骤Kozak规则，即第一个AUG侧翼序列的碱基分布所满足的统计规律，若将第一个AUG中的碱基A，U，G

20、分别标为1，2，3位，则Kozak规则可描述如下：(1)第4位的偏好碱基为G；(2)AUG的5端约15bp范围的侧翼序列内不含碱基T；(3)在-3，-6和-9位置，G是偏好碱基；(4)除-3，-6和-9位，在整个侧翼序列区，C是偏好碱基。动物转基因技术面临着一些问题Southern印迹杂交和FISH(荧光原位杂交)：确定整合位置；在内源性基因的顺式调控元件启动子、增强子的转录活性作用下,通过mRNA 前体的剪接,上游编码基因与报道基因产生融合转录,内源性基因表达受阻,报道基因以内源基因模式进行表达。第三节 用基因打靶建立动物模型感染胚胎细胞，使细胞转化Vpr,-R蛋白能使HIV在巨噬细胞中增殖

21、7、转YAC的转基因小鼠第三节 用基因打靶建立动物模型同源重组分解特定基因的定向基因要考虑特定基因产物的精确分析人类疾病动物模型(Animal models of human diseases)是指在医学研究中，在动物身上建立，或形成类似人类疾病动物。只有hprt细胞能在6-TG培养基中生存，此为负向选择从小鼠尾尖提取基因组DNA为模版进行如下鉴定利用一个基因载体进行两次同源重组2、留下的选择标记及其启动子、增强子可能会影响邻近基因的表达HSV-TK基因插入外源基因外侧的载体序列中。第二节研制转基因动物的基本步骤绝缘子：在基因组内建立独立的转录活性结构域的边界DNA序列称为绝缘子/隔离子（in

22、sulator）。绝缘子能够阻止邻近的增强子或沉默子对其界定的基因的启动子发挥调控作用。绝缘子元件阻断邻近增强子的活性第二节研制转基因动物的基本步骤目的基因以往构件目的基因时一般使用基因文库中的cDNA序列，实践证明仅有cDNA序列往往难以得到有效表达，至少一个内含子与cDNA序列结合会使基因得到更好的表达，常使用基因组DNA。第二节研制转基因动物的基本步骤报告基因是一种编码可被检测的蛋白质或酶的基因，也就是说，是一个其表达产物非常容易被鉴定的基因。常用LacZ、EGFP等便于观察多聚腺苷酸化信号多聚腺苷酸化信号第二节研制转基因动物的基本步骤转基因的方法:1、受精卵雄原核显微注射法（最常用）2

23、、胚胎干细胞（ES）法3、逆转录病毒法4、体细胞核移植法5、精子载体法6、YAC法第二节研制转基因动物的基本步骤转基因常用细胞：1）受精卵：受精卵基因操作注射假孕动物子宫胚胎个体。2）胚胎干细胞：从着床前的动物胚胎中分离多功能胚胎干细胞 基因操作注射入动物囊胚形成嵌合体胚胎嵌合个体。第二节研制转基因动物的基本步骤受精卵雄原核显微注射法：受精卵雄原核显微注射法：以单细胞受精卵为靶细胞，利用显微注射技术将构建好的载体DNA直接注射入受精卵的雄原核，再将接受注射的受精卵移入假孕母体输卵管继续发育获得转基因动物个体。绝缘子元件阻断邻近增强子的活性绵羊：抗胰蛋白酶、凝血因子、蛋白C；ES cell Cu

24、lture正向选择打靶基因进入细胞后的命运Targeted ES携带有外源基因的慢病毒载体在慢病毒包装质粒、细胞系的辅助下，经过病毒包装成为有感染力的病毒颗粒，通过感染细胞或活体组织，实现外源基因在细胞或活体组织中表达。5kb，被删除的目的片段长度不宜大于10kb。如何获得剔除小鼠?胚胎工程用基因捕获法在单次实验中可以获得数以百计的带有单基因剔除的ES克隆。常用LacZ、EGFP等便于观察如何获得剔除小鼠?胚胎工程标记和置换法（Tag and exchange）Mouse genome library（129 strain）第二节研制转基因动物的基本步骤用基因捕获法在单次实验中可以获得数以百计

25、的带有单基因剔除的ES克隆。第二节研制转基因动物的基本步骤载体载体DNADNA制备制备胚胎操作过程胚胎操作过程受精卵准备显微注射假孕母鼠准备(养母)胚胎移植对幼鼠鉴定对幼鼠鉴定第二节研制转基因动物的基本步骤目的基因可以来源于：通过限制性内切酶预先分离的某一基因。逆转录法得到的cDNA。人工合成的DNA片段。聚合酶链式反应（PCR）扩增的特定基因片段。第二节研制转基因动物的基本步骤目的基因的克隆可以通过载体方式进行，通常选择质粒作为载体。将目的基因与质粒结合形成重组因子，然后转化至大肠杆菌，扩增质粒，再分离纯化重组质粒DNA，用适当的限制性内切酶消化，制备成线状基因片段备用。第二节研制转基因动物

26、的基本步骤胚胎操作过程卵供体母鼠和假孕母鼠的准备 定期准备相当数量的卵供体母鼠和假孕母鼠以及一批相对稳定的正常公鼠与结扎公鼠。这些鼠的有关要求如下表第二节研制转基因动物的基本步骤超排卵与取卵 选择46周龄母鼠，注射孕马血清促性腺激素（PMSG）后，隔4248h再注射人绒毛膜促性腺激素（HCG），注射HCG后1013h剖腹取卵，用培养液保存，置CO2培养箱备用。第二节研制转基因动物的基本步骤基因显微注射 用专门的持卵管和注射针，在显微注射仪上操作，将纯化的目的基因（DNA）注射到受精卵的雄性原核内。operation panel holding pipette microneedle.eye l

27、ens 显微注射法 显微注射法是在显微注射仪上，一侧用吸管固定受精卵，另一侧将注射针插入受精卵原核（一般是雄原核）。拔出显微注射针解除固定管的负压，操作完成。第二节研制转基因动物的基本步骤受精卵移植 转基因受精卵在单细胞至桑椹胚阶段移植到受孕后0.5d的假孕母鼠的输卵管，在囊胚期则移植到受孕后2.5d的假孕母鼠子宫。每只假孕母鼠移植2030个转基因卵为宜。X1-cell pronuclear stagemouse embryo.PMS+HCGto superovulate Pregnant Foster MotherOviduct Transfer+2-cell stage embryoHol

28、ding PipetteInjection PipetteEvents During TransgenesisDAYFertilization12 AM12 AM12 AM12 AM12 AM12 AM12 AMReimplantationMatingMicroinjectionCell DivisionGestationBirthEmbryoRecoveryE1E2E2112345hCGPMS 1.结扎公鼠的制备 为了获得同步发情的假孕母鼠，要准备结扎公鼠，通常选用5周龄公鼠做手术，分笼饲养，每笼一只。术后23周即完全康复，可用其生产假孕母鼠。目的：为了产生同期发情的母鼠第二节研制转基因动物

29、的基本步骤 2.超数排卵 供体母鼠（不动情的25g母鼠）腹腔注射PMSG 10U（马血清促性腺激素），一般选择在中午注射，间隔48小时后注射HCG（人绒毛膜促性腺激素），光照周期保持1214h；第二节研制转基因动物的基本步骤 3.同期发情 将注射HCG后的母鼠与正常公鼠合笼，并于第二天早上检查阴道栓，如果见栓说明已经配上种了，计做怀孕0天。受体母鼠(普通发情母鼠)与结扎公鼠合笼，第二天早上检查阴道栓，有栓的母鼠可用于胚胎移植（假孕母鼠）。第二节研制转基因动物的基本步骤计算时间与结扎公鼠 4.胚胎收集和预处理（1）受精卵的收集和处理 见栓当日的胚胎处于1细胞期。以脱颈椎法杀死母鼠，暴露子宫、输卵

30、管；剪下子宫、输卵管，并置于平皿中；在灭菌平皿中剪下输卵管置入盛有冲卵液的集卵杯中，在体视显微镜下撕开壶腹部，释放受精卵并用新鲜的培养液洗12次。第二节研制转基因动物的基本步骤 用透明质酸酶处理受精卵细胞团（2）28细胞胚胎的收集 交配后2060小时，输卵管中存在有28细胞期胚胎。此时卵丘细胞已经脱掉，可用1ml的注射器自输卵管伞口冲得胚胎。其基本步骤如下：取输卵管，在体视显微镜下找到输卵管伞口，伞口呈平截状，周边略显粗糙。然后，用镊子轻轻夹住伞口下部位，慢慢将冲卵针插入伞口，再用镊子轻轻夹住针头，推压注射器，胚胎从另一端冲出。洗涤胚胎：收集冲得的胚胎，用新鲜的培养液洗12次，转入培养过程。第

31、二节研制转基因动物的基本步骤冲卵 5.胚胎移植（1）输卵管移植 根据胚胎数，确定供胚胎移植的受体母鼠数，并做好手术准备。手术切口位于两侧腰部距背正中线1 cm处，左右各一个相互平行的切口。第二节研制转基因动物的基本步骤小鼠麻醉、剪毛、消毒后，用手术剪切开小鼠的皮肤、肌肉、打开腹腔，暴露卵巢、卵巢脂肪垫，并用镊子夹住脂肪组织，把卵巢、输卵管和一部分子宫角慢慢拉出，通过用纱布保护的切口置于纱布上。第二节研制转基因动物的基本步骤 在体视显微镜下观察输卵管伞，并用移卵管吸取胚胎，次序为石蜡油、空气泡1、培养液、空气泡2、胚胎(尽可能少带入培养液)。空气泡3、培养液。第二节研制转基因动物的基本步骤用显微

32、注射方法制备转基因动物，操作技术性很强，即使是受过严格训练的专业人员操作，发育成转基因动物的受精卵也只占注射卵的5。因此人们往往来用增大微注射受精卵的数目的办法来弥补这一缺陷。第二节研制转基因动物的基本步骤优点：外源外源DNADNA大小基本不受限制（大小基本不受限制（1-1-50kb50kb）；导入过程直观；整合率高；）；导入过程直观；整合率高；不依赖载体不依赖载体缺点：仪器贵重，技术要求高，效率低，随机仪器贵重，技术要求高，效率低，随机整合，卵细胞伤害大，胚胎易损伤整合，卵细胞伤害大，胚胎易损伤第二节研制转基因动物的基本步骤胚胎干细胞（胚胎干细胞（ESES）法：）法：（ES细胞，Embryo

33、stemcell）是指囊胚期的内细胞团中尚未进行分化的细胞，这种细胞具有类似癌细胞无限繁殖无限繁殖和高度分化高度分化的潜能。将携带有外源基因的ES细胞注入到动物的早期胚胎内，可产生嵌合体及转基因动物。第二节研制转基因动物的基本步骤胚胎干细胞的特点：它本身是二倍体，能在体外培养，具有高度的全能性，可以形成包括生殖细胞在内的所有组织，并且在不同的培养条件下表现出不同的功能状态。第二节研制转基因动物的基本步骤步骤：步骤：1 1、分离、分离ESES细胞细胞2 2、将包含目的基因载体转染进入、将包含目的基因载体转染进入ESES细胞细胞3 3、体外培养筛选阳性克隆、体外培养筛选阳性克隆4 4、阳性克隆转入

34、受体囊胚并移植入假孕养、阳性克隆转入受体囊胚并移植入假孕养母子宫母子宫5 5、子代嵌合体的鉴定，杂交生成纯合子、子代嵌合体的鉴定，杂交生成纯合子ES cell CultureTargeted ES CellsPure Population ofTargeted ES CellsTargeted ES Cells Injected into Blastocyst Pregnant Foster MotherXChimeraBlastocyst derivedfrom mouse with white coat.Breed to WT white mouseGermline transmissio

35、nof ES cell-derivedgenome.Uterine Transfer第二节研制转基因动物的基本步骤利用胚胎干细胞生产转基因动物的主要策略利用胚胎干细胞生产转基因动物的主要策略及方法及方法1.1.胚胎嵌合法胚胎嵌合法2.2.细胞核移植法：移植到卵母细胞核中细胞核移植法：移植到卵母细胞核中3.3.体外诱导体外诱导ESES细胞分化为卵母细胞和精子细胞分化为卵母细胞和精子4.4.利用成体干细胞中的精原干细胞生成利用成体干细胞中的精原干细胞生成”转转基因精子基因精子“：迁移入精巢的原始生殖细胞，：迁移入精巢的原始生殖细胞，是一种干细胞，通过减数分裂可形成精子。是一种干细胞，通过减数分裂可

36、形成精子。第二节研制转基因动物的基本步骤步骤：步骤：1 1、分离、分离ESES细胞细胞2 2、将包含目的基因载体转染进入、将包含目的基因载体转染进入ESES细胞细胞3 3、体外培养筛选阳性克隆、体外培养筛选阳性克隆4 4、阳性克隆转入受体囊胚并移植入假孕养、阳性克隆转入受体囊胚并移植入假孕养母子宫母子宫5 5、子代嵌合体的鉴定，杂交生成纯合子、子代嵌合体的鉴定，杂交生成纯合子囊胚固定囊胚固定 细胞注入内细胞团细胞注入内细胞团 第二节研制转基因动物的基本步骤优点：优点：外源基因整合情况的可控性高可预先在细胞水平检测外源基因的拷贝数、定位、表达的水平及插入的稳定性外源基因导入ES细胞的方法多样，细

37、胞鉴定及筛选方便第二节研制转基因动物的基本步骤缺点：缺点：ES细胞系建立及培养困难维持ES细胞的未分化及多向分化潜能不易所得个体为嵌合体第二节研制转基因动物的基本步骤生殖细胞载体法 有体外和体内转染生殖细胞的两种方法，前者又包括精子载体法、卵子载体法、受精卵载体法、胞浆内精子注射法等。精子载体法是将成熟的精子与外源DNA的载体共同孵育，使精子携带外源DNA，受精后外源DNA整合至染色体中。此法理论上是可行的、也有成功的先例，但成功率不高、效果不稳定，有待继续探索、完善。第二节研制转基因动物的基本步骤逆转录和慢病毒转染法将目的基因重组到逆转录病毒（或慢病毒）载体上，制成高滴度病毒颗粒，人为感染着

38、床前后的胚胎（也可直接将胚胎与能释放逆转录病毒的单层培养细胞共同培养以达到感染目的),获得转基因动物的方法。第二节研制转基因动物的基本步骤慢病毒（慢病毒（LentivirusesLentiviruses）属于逆转录病）属于逆转录病毒科。慢病毒核蛋白质前整合复合物毒科。慢病毒核蛋白质前整合复合物具有噬核特性，病毒基因组运输至细具有噬核特性，病毒基因组运输至细胞核，从而使慢病毒可以感染和在非胞核，从而使慢病毒可以感染和在非有丝分裂细胞中复制。这一特性使慢有丝分裂细胞中复制。这一特性使慢病毒成为基因治疗的转移载体。病毒成为基因治疗的转移载体。慢病毒载体是指以人类免疫缺陷病毒-1(H IV-1)来源的

39、一种病毒载体，慢病毒载体包含了包装、转染、稳定整合所需要的遗传信息，是慢病毒载体系统的主要组成部分。携带有外源基因的慢病毒载体在慢病毒包装质粒、细胞系的辅助下，经过病毒包装成为有感染力的病毒颗粒，通过感染细胞或活体组织，实现外源基因在细胞或活体组织中表达。第二节研制转基因动物的基本步骤第二节研制转基因动物的基本步骤HIV（Human immunodeficiency virus）EIAV（Equine infectious anemia virus）FIV（Feline immunodeficiency virus）SIV（Simian immunodeficiency virus）其中研究最

40、多最为透彻的是其中研究最多最为透彻的是HIV。gag,-群抗原基因，编码核心蛋白群抗原基因，编码核心蛋白p24 pol-多聚酶基因，编码多聚酶；多聚酶基因，编码多聚酶；env-包膜蛋白基因，编码包膜蛋白包膜蛋白基因，编码包膜蛋白gp120 及及gp41；tat-基因反式激活因子对基因反式激活因子对HIV-1基因其正调控作用基因其正调控作用 rev,-病毒蛋白表达调节因子，能增加病毒蛋白表达调节因子，能增加gag和和env基因对结构蛋白的表达基因对结构蛋白的表达 vif,-病毒感染因子病毒感染因子,其作用是在一些细胞因子的协下促进其作用是在一些细胞因子的协下促进HIV-1在细胞内在细胞内复复 V

41、pr,-R蛋白能使蛋白能使HIV在巨噬细胞中增殖在巨噬细胞中增殖 vpu,-U蛋白，能促进蛋白，能促进HIV从细胞膜上释放从细胞膜上释放 nef,-负因子，具有抑制负因子，具有抑制HIV-1增殖作用增殖作用慢病毒载体的发展经历了慢病毒载体的发展经历了3 3个阶段个阶段第一代慢病毒载体系统是以三质粒系统为代表。在构建时把HIV-1基因组中进行包装、逆转录和整合所需的顺式作用元件与编码反式作用蛋白的序列分离，分别构建在三个独立的质粒表达系统上，即包装质粒（一个强启动子如CMV作用下，控制除env以外所有病毒结构基因的表达）、包膜质粒（包含VSV-G基因）和载体质粒（包含目的基因），仅去除包膜蛋白慢

42、病毒载体的发展经历了慢病毒载体的发展经历了3 3个阶段个阶段第二代慢病毒载体系统从安全性角度又删去了HIV的所有附属基因，仅包含gag、pol、tat、rev基因。第三代慢病毒载体又进一步做了些安全方面的改进，如删除了U3区的3LTR和tat基因，将rev基因分离称为四质粒系统病毒载体系统中，病毒感染目的细胞后不会再感染其他细胞，也不会利用宿主细胞产生新的病毒颗粒，也就是假型病毒。pHelper负责编码病毒主要的结构蛋白，特异性的酶，基因表达的调节因子，提供病毒包装所需要的包膜蛋白等。通常分为两质粒和三质粒系统两种。第二节研制转基因动物的基本步骤包装质粒包装质粒包膜质粒包膜质粒第二节研制转基因

43、动物的基本步骤优点：受精卵携带外源基因的阳性率高；外源基因多单拷贝整合；操作简单，避免注射法对卵子的损害；宿主范围广；可同时感染大量胚胎，感染率及胚胎存活率高第二节研制转基因动物的基本步骤缺点：容纳大小有限（10kb）；潜在致癌性,载体复杂；整合率不高,胚胎自我保护机制对其有抗性第二节研制转基因动物的基本步骤存在问题：存在问题：1 1、重组病毒的滴度还不够高，均在、重组病毒的滴度还不够高，均在101TU/ml101TU/ml103TU/ml103TU/ml之间，难以达到体内应用的需要；之间，难以达到体内应用的需要；2 2、建立稳定的、建立稳定的HIVHIV载体包装细胞十分困载体包装细胞十分困

44、难，已建难，已建立的包装细胞均不理想。立的包装细胞均不理想。据报道，据报道，VprVpr是一种使细胞进入静止期的强诱导剂，是一种使细胞进入静止期的强诱导剂，也是建立包装细胞的主要障碍之一。也是建立包装细胞的主要障碍之一。第二节研制转基因动物的基本步骤步骤：步骤：1.逆转录病毒载体的构建2.选择和培养包装细胞系3.重组病毒DNA导入包装细胞4.收集重组病毒颗粒5.感染胚胎细胞，使细胞转化第二节研制转基因动物的基本步骤第二节研制转基因动物的基本步骤优点：优点：对体细胞进行基因改造后，用于核移植可以提高转基因的效率，不仅具有“ES细胞途径”的全部优点，且物种适用面广。无需经过嵌合体育种就可获得纯合个

45、体，周期短，效率高。第二节研制转基因动物的基本步骤缺点：缺点：技术上难度大，成功率极低，胚胎死亡率高，非一般实验室可以开展。第二节研制转基因动物的基本步骤精子载体法直接以精子为载体的转基因方法：将成熟精子与外源DNA共培养，成熟精子与外源DNA预培养之后，使精子有能力携带外源DNA进入卵子中，使之受精，并使外源DNA 整合到染色体中。外源DNA导入精细胞的方法有DNA与精子共育法、电穿孔导入法、脂质体转染法。第二节研制转基因动物的基本步骤受体介导法：受体介导法：是将外源是将外源DNADNA与受体分子连接后与胚与受体分子连接后与胚胎细胞共培养，受体可以介导外源胎细胞共培养，受体可以介导外源DNA

46、DNA进入受体细胞，从而实现基因转进入受体细胞，从而实现基因转移。移。第二节研制转基因动物的基本步骤YACYAC和和BACBAC介导的基因转移介导的基因转移酵母人工染色体（YAC）载体是近年来发展起来的新型载体,能克隆百万对碱基的大片段DNA。优点：保证大片段DNA的完整性保证较长外源片段在转基因动物研究中的整合率高 保证了目的基因上下游的侧翼序列的完整性因而可以消除或减弱基因整合后的位置效应。第二节研制转基因动物的基本步骤YAC：基于ARS、CEN、TEL是线性染色体稳定的功能序列,人们利用这些序列构建载体,重组后的DNA以线性状态存在,这样不仅稳定,而且大大提高了插入外源基因的能力,并且可

47、以像天然染色体一样在寄主细胞中稳定复制和遗传，称为人工染色体。如利用从酵母染色体上分离的ARS、CEN、TEL序列构建载体，然后用这种载体构建的染色体即称为酵母人工染色体。YAC载体的装载量为350-400 kb第二节研制转基因动物的基本步骤YAC 的主要功能成份有三：1）着丝粒：mitosis姊妹染色单体和减I同源染色体分离之必需。2）端粒：保护染色体末端免受核酸酶的侵袭，防止粘附到其他断裂端，保证了染色体的稳定存在。3）自主复制序列（ARS）元件：是染色体自主复制的复制起点。构建YAC需要4个短序列：2个端粒，着丝粒，ARS元件，与外源DNA连接成线性DNA分子，导入酵母细胞克隆。第二节研

48、制转基因动物的基本步骤YACYAC的缺点：的缺点：1 1、内部存在嵌合及重组等现象，即在一个、内部存在嵌合及重组等现象，即在一个YACYAC克隆里含有两个本来不相连的独立片段；克隆里含有两个本来不相连的独立片段；2 2、某些克隆不稳定，在转代培养时可能会缺、某些克隆不稳定，在转代培养时可能会缺失或重排其中的片段失或重排其中的片段 ；3 3、此外，由于、此外，由于YACYAC与酵母染色体具有相似的与酵母染色体具有相似的结构，因此结构，因此YACYAC很难与酵母染色体区分开，很难与酵母染色体区分开，并且在转基因操作时必须特别小心并且在转基因操作时必须特别小心,以防染色以防染色体机械切割。体机械切割

49、。第二节研制转基因动物的基本步骤BAC为环形质粒，其复制子来源于单拷贝质粒F因子，故BAC在宿主菌内只有极少数拷贝数，可稳定遗传，无缺失，重组和嵌合现象，能容纳300kb的DNA分子。第二节研制转基因动物的基本步骤BAC以E.coli为宿主，转化效率较高，常规方法(碱裂解)即可分离BAC：蓝白斑，抗生素，菌落原位杂交等均可用于目的基因筛选；可对克隆在BAC的DNA直接测序第二节研制转基因动物的基本步骤转入基因的整合、表达及转基因动物的鉴定转入基因的整合、表达及转基因动物的鉴定外源基因导入后的存在方式外源基因导入后的存在方式1.1.整合到染色体内整合到染色体内随机整合（非同源重组）定点整合（同源

50、重随机整合（非同源重组）定点整合（同源重组）组）2.2.游离在细胞浆内暂态表达游离在细胞浆内暂态表达3.3.在核酸酶的作用下降解在核酸酶的作用下降解。外源基因导入后的表达外源基因导入后的表达表达影响因素表达影响因素1.1.外源基因本身的结构和性质外源基因本身的结构和性质2.2.附带的原核载体顺序附带的原核载体顺序3.3.染色体位置染色体位置4.4.甲基化甲基化5.5.外源基因在受体细胞中的表达方式表外源基因在受体细胞中的表达方式表现为组织特异性和发育阶段特异性现为组织特异性和发育阶段特异性第二节研制转基因动物的基本步骤第二节研制转基因动物的基本步骤转基因动物的鉴定转基因动物的鉴定从小鼠尾尖提取