1、1第第 七七 章章 细菌的细菌的遗传遗传分析分析遗传学 第七章 细菌的遗传分析2本章主要内容：本章主要内容：以大肠杆菌为材料讨论：以大肠杆菌为材料讨论：1、细菌遗传物质的传递规律、细菌遗传物质的传递规律 2、细菌染色体作图、细菌染色体作图 3、细菌同源重组的分子机制、细菌同源重组的分子机制37.1 细菌的细胞和基因组细菌的细胞和基因组7.2 大肠杆菌的突变型及其筛选大肠杆菌的突变型及其筛选7.3 细菌的遗传分析细菌的遗传分析7.4 细菌同源重组的机制细菌同源重组的机制47.1 细菌的细胞和基因组细菌的细胞和基因组 7.1.1 细菌的细胞细菌的细胞 7.1.2 细菌的基因组细菌的基因组57.1.
2、1 细菌的细胞细菌的细胞细菌细菌:真细菌（真细菌（eubacteria）如大肠杆菌）如大肠杆菌 （Escherchia coli）古细菌（古细菌（archaebacteria）如詹氏甲烷球菌）如詹氏甲烷球菌 （Methanococcusjannasch）多种形态存在：多种形态存在：球菌（球菌（cocci）杆菌（杆菌（bacilli）螺旋菌（螺旋菌（sprilla）等）等大小：随种类不同而异大小：随种类不同而异 杆菌一般长杆菌一般长15，宽，宽0.51；球菌以直径大小表示，一般为球菌以直径大小表示，一般为0.51；螺旋菌一般长为螺旋菌一般长为150，直径为，直径为0.51 6细菌结构简单：细菌结
3、构简单：基本结构包括细胞壁、细胞膜、拟基本结构包括细胞壁、细胞膜、拟核、核糖体、细胞质及内含物；核、核糖体、细胞质及内含物；特殊结构如荚膜和鞭毛特殊结构如荚膜和鞭毛 世代时间短，世代时间短，20分钟一代，分钟一代，容易得到生化突变型。容易得到生化突变型。单细胞，遗传物质单细胞，遗传物质 环状核酸分子环状核酸分子基因带基因带/线（线（genophore）也可称染色体。也可称染色体。单细胞单细胞菌落（菌落（clone）/菌株（菌株（strain）野生型菌株野生型菌株 原养型原养型prototroph 营养缺陷型营养缺陷型auxotroph 细菌与细菌之间可有遗传物质的交换细菌与细菌之间可有遗传物质
4、的交换7 细菌染色体不凝缩，没有着丝细菌染色体不凝缩，没有着丝粒，也没有纺锤体结构。粒，也没有纺锤体结构。细菌繁殖：细菌繁殖：双链环形双链环形DNA分子分子随着细胞伸长而采取二分分裂随着细胞伸长而采取二分分裂（binary fission）的方式分开。）的方式分开。87.1.2 细菌的基因组细菌的基因组 细菌染色体大多细菌染色体大多裸露、环状闭合裸露、环状闭合DNA双链双链，无组，无组蛋白结合、不形成核小体，位于蛋白结合、不形成核小体，位于“拟核拟核”区。有利区。有利于外源于外源DNA的插入。的插入。细菌的染色体长度细菌的染色体长度 25035 000m不等。不等。9（1）染色体结构）染色体结
5、构电镜观察表明：电镜观察表明：染色体结构最显著的特征是染色体结构最显著的特征是DNA被包裹压被包裹压缩成一个个有序的环状结构域。缩成一个个有序的环状结构域。大肠杆菌基因组长大肠杆菌基因组长4.7106bp，松弛状况：松弛状况：1 300m，是其细胞长度的，是其细胞长度的1 000倍，倍，必须压缩最少必须压缩最少1 000倍后才能装入细胞中。倍后才能装入细胞中。10 对染色体成分分析表明，对染色体成分分析表明，DNA占占80，其，其余为余为RNA和蛋白质。已分离出和蛋白质。已分离出HU、H1等等DNA结合蛋白，类似于真核染色体的结构蛋白，可结合蛋白，类似于真核染色体的结构蛋白，可能与结构域的形成
6、有关。大肠杆菌染色体中约能与结构域的形成有关。大肠杆菌染色体中约有有100个结构域，每个相当于个结构域，每个相当于40 kb，各结构域，各结构域具相对独立性。具相对独立性。11 染色体的结构域是染色体的结构域是超螺旋结构超螺旋结构，由，由DNA双螺双螺旋的螺旋轴盘绕而形成，是旋的螺旋轴盘绕而形成，是DNA三级结构的一种三级结构的一种形式。形式。如用如用DNA酶处理大肠杆菌染色体，各结构域酶处理大肠杆菌染色体，各结构域DNA链将会断裂，超螺旋结构受到破坏，变为松链将会断裂，超螺旋结构受到破坏，变为松弛型结构。染色体中央部分为支架蛋白和弛型结构。染色体中央部分为支架蛋白和RNA。若用若用RNA酶处
7、理，酶处理，DNA折叠结构即不能保持，说折叠结构即不能保持，说明明RNA和支架蛋白是保持染色体结构的重要因素。和支架蛋白是保持染色体结构的重要因素。1213（2）E.coli 基因组概况基因组概况 E.coli 染色体为闭合双链环状染色体为闭合双链环状DNA，长约，长约1333 m1997年测定完成年测定完成E.coli K-12 MG1655菌株全基因组菌株全基因组:4,639，221（约（约4.7106）bp 其中：其中：87.8编码蛋白质编码蛋白质 0.8编码稳定性编码稳定性RNA 0.7%无编码功能的重复序列无编码功能的重复序列 11属调节序列和具有其它功能属调节序列和具有其它功能 在
8、编码蛋白质序列：总共编码在编码蛋白质序列：总共编码4288种已知和未知种已知和未知的蛋白质（可读框），其中约的蛋白质（可读框），其中约38功能不明。功能不明。14 在在K-12 MG1655菌株中，基因的平均长度为菌株中，基因的平均长度为950bp,基因之间的平均间隔约为基因之间的平均间隔约为118bp，但是菌株之间可能，但是菌株之间可能会有很大的差别。会有很大的差别。2005年报道了第二个菌株年报道了第二个菌株E.coli K-12 W3110基因基因组的完整序列。比较组的完整序列。比较K-12 MG1655菌株和菌株和K-12 W3110菌株，发现两者基因组大小并不一致：菌株，发现两者基因
9、组大小并不一致：K-12 W3110基因组大小为基因组大小为4,646,332 bp 基因总数为基因总数为4464个；个；K-12 W3110与与K-12 MG1655 相同的基因有相同的基因有4453个个15Fig.A map of the E.coli genome,showing selected genes.167.2 大肠杆菌的突变型及其筛选大肠杆菌的突变型及其筛选 7.2.1 大肠杆菌的突变类型大肠杆菌的突变类型 7.2.2 细菌的培养与突变型筛选细菌的培养与突变型筛选171.1.合成代谢功能的突变型（营养缺陷型）合成代谢功能的突变型（营养缺陷型）2.2.分解代谢功能的突变型分解代
10、谢功能的突变型3.3.抗性突变型：抗药性突变型抗性突变型：抗药性突变型 抗噬菌体突变型抗噬菌体突变型原养型：原养型：野生菌株可在基本培养基上生野生菌株可在基本培养基上生长。长。n用不同的选择性培养基用不同的选择性培养基 测知突变的特性。测知突变的特性。7.2.1 大肠杆菌的突变类型大肠杆菌的突变类型181.合成代谢功能的突变型合成代谢功能的突变型 野生型品系在基本培养基上具有合成所有野生型品系在基本培养基上具有合成所有代谢和生长所必需的复杂有机物的功能，称为代谢和生长所必需的复杂有机物的功能，称为合成代谢功能合成代谢功能。需大量基因表达，其中任何一。需大量基因表达，其中任何一个必需基因发生突变
11、都不能进行一个特定的生个必需基因发生突变都不能进行一个特定的生化反应，从而阻碍整个合成代谢功能的实现，化反应，从而阻碍整个合成代谢功能的实现，这种突变型称为这种突变型称为营养缺陷型营养缺陷型。它们多是。它们多是条件致条件致死突变死突变，能通过在基本培养基中添加所需的有能通过在基本培养基中添加所需的有机成分使具有这种突变的细菌存活。机成分使具有这种突变的细菌存活。192.分解代谢功能的突变型分解代谢功能的突变型 野生型大肠杆菌能利用比葡萄糖复杂的不野生型大肠杆菌能利用比葡萄糖复杂的不同碳源，使复杂的糖类转化成葡萄糖或其他简同碳源，使复杂的糖类转化成葡萄糖或其他简单的糖类，也能将复杂分子如氨基酸或
12、脂肪酸单的糖类，也能将复杂分子如氨基酸或脂肪酸降解为乙酸或三羧酸循环的中间物。这些降解降解为乙酸或三羧酸循环的中间物。这些降解功能称为功能称为分解代谢功能分解代谢功能。降解功能的实现需许。降解功能的实现需许多有关基因的表达，其中任何一个基因突变都多有关基因的表达，其中任何一个基因突变都会影响降解功能的实现。会影响降解功能的实现。20 如如Lac突变型不能分解乳糖，不能生长突变型不能分解乳糖，不能生长在以乳糖为唯一碳源的基本培养基中，而野在以乳糖为唯一碳源的基本培养基中，而野生型生型Lac细菌能利用乳糖。细菌能利用乳糖。Lac表型是因为表型是因为lacZ或或lacY基因发生基因发生突变，分别产生
13、基因型为突变，分别产生基因型为lacZ或或lacY的突的突变型菌株。这种菌株亦是变型菌株。这种菌株亦是条件致死突变型条件致死突变型。213.抗性突变型抗性突变型（resistant mutants）细菌由于某基因的突变而对某些噬菌细菌由于某基因的突变而对某些噬菌体或抗生素产生体或抗生素产生抗性抗性（resistant）。）。对噬菌体的抗性突变对噬菌体的抗性突变改变细菌的膜蛋白改变细菌的膜蛋白，从而某种噬菌体不能吸附或吸附在这种从而某种噬菌体不能吸附或吸附在这种突变细菌上的能力降低。突变细菌上的能力降低。22 对抗生素产生抗性的突变是严重的公害问题，对抗生素产生抗性的突变是严重的公害问题，研究较
14、深入，细菌对各种抗生素的抗性机制各研究较深入，细菌对各种抗生素的抗性机制各不相同。不相同。链霉素抗性细菌核糖体链霉素抗性细菌核糖体30S亚基的亚基的S12蛋白变蛋白变异，从而使抗链霉素突变型细菌的异，从而使抗链霉素突变型细菌的S12不再和不再和链霉素结合，链霉素结合，能进行正常的翻译作用和正常能进行正常的翻译作用和正常的分裂繁殖。的分裂繁殖。23抗药性突变型如抗药性突变型如:青霉素青霉素:penpenr r,penpens s 链霉素链霉素:strstrr r,str,strs s PenPenicillin icillin Str Streptomycineptomycin 抗性抗性:r r
15、esistance esistance 敏感敏感:s sensitive ensitive 抗噬菌体突变型如：抗噬菌体突变型如：T T1 1噬菌体噬菌体 TonTonr r Ton Tons s T T2 2噬菌体噬菌体 TtoTtor r Tto Ttos s培养基中培养基中加有青霉素加有青霉素s24257.2.2 细菌的培养与突变型筛选细菌的培养与突变型筛选1 1保存：保存：固体培养基上生长，固体培养基上生长，44保保存存；或或7070保存于甘油中。保存于甘油中。2 2活化：活化：缓缓慢慢升温升温 液体培养基液体培养基 摇床摇床。3 3涂布和繁殖：涂布和繁殖：每个细胞在较短时间每个细胞在较
16、短时间内内(如一夜如一夜)能裂殖到能裂殖到10107 7个子细胞个子细胞 肉眼可见的菌落或克隆。肉眼可见的菌落或克隆。4 4分析：分析：形态性状的突变有限，形态性状的突变有限，生理生理特性的突变特性的突变和和抗性突变抗性突变较多。如较多。如：肺炎双球菌肺炎双球菌：左为光滑型：左为光滑型(S)S)，右为粗糙型右为粗糙型(R)R)。2627Lederberg J.,1958 Nobel奖获得者，奖获得者，发现细菌转导和接合发现细菌转导和接合无链霉素吸附细菌丝绒印在母板上再印在选择培养基上链霉素筛选出抗链霉素的菌系从模板中挑出抗性和敏感菌系细菌突变型的筛选细菌突变型的筛选影印法影印法 黎德伯格等黎德
17、伯格等(Lederberg J.1952)Lederberg J.1952)设计。设计。28细菌中，大肠杆菌（细菌中，大肠杆菌（E.coli）最为广泛的遗传学实验材料最为广泛的遗传学实验材料细菌的遗传重组可通过三种途径实现：细菌的遗传重组可通过三种途径实现：（1）接合（）接合（conjugation）：）：通过供体与受体之通过供体与受体之 间的接触而传递间的接触而传递DNA；（2）转化（）转化（transformation）：）：指游离的细菌指游离的细菌DNA 片段被吸收到不同的细菌细胞内（受体）；片段被吸收到不同的细菌细胞内（受体）；（3）转导（）转导（transduction）：）：指一种
18、细菌的指一种细菌的DNA片片 段经过温和的或经有缺陷的噬菌体传递给另一段经过温和的或经有缺陷的噬菌体传递给另一 种细菌。种细菌。7.3 细菌的遗传分析细菌的遗传分析297.3.1 接合（接合（Bacterial conjugation）经细菌细胞的经细菌细胞的直接接触直接接触，把一个细胞（供体），把一个细胞（供体）的遗传物质传递给另一个细胞（受体），从而的遗传物质传递给另一个细胞（受体），从而实现遗传重组（见图）实现遗传重组（见图）。接合能传递大段的接合能传递大段的DNA，在细菌的遗传重组中效率最高。，在细菌的遗传重组中效率最高。301.细菌经典的杂交实验细菌经典的杂交实验 1946年年 Le
19、derberg&Tatum，首次证明，首次证明 E.coli 的有性生殖的有性生殖和基因重组和基因重组.不同营养缺陷型的大肠杆菌菌株不同营养缺陷型的大肠杆菌菌株：A A菌株：菌株：met-bio-thr+leu+thi+，需加甲硫氨酸和生物素。需加甲硫氨酸和生物素。B菌株菌株：Met+bio+thr-leu-thi-，需加苏氨酸亮氨酸需加苏氨酸亮氨酸和和硫胺素硫胺素。A A菌株和菌株和B B菌株菌株是营养缺陷型是营养缺陷型，不不能在基本培养基上生长。能在基本培养基上生长。A+BA+B菌株混合培养在完全培养基菌株混合培养在完全培养基上，几小时后离心，涂布基本培养上，几小时后离心，涂布基本培养基基
20、，长出原养型，长出原养型(Met+bio+thr+leu+thi+)菌落菌落。31结果：结果：基本培养基上大约基本培养基上大约107个亲体细胞就个亲体细胞就会出现一个会出现一个met+bio+thr+Leu+thi+原养原养型菌落。而分别培养在基本培养基上的，型菌落。而分别培养在基本培养基上的，未经混合的两个亲体品系作为对照没有未经混合的两个亲体品系作为对照没有产生原养型菌落。产生原养型菌落。32 说明原养型菌落的产生，一定是说明原养型菌落的产生，一定是A菌菌株的株的thr+Leu+thi+和和B菌株菌株met+bio+的基的基因结合到一个基因组里了。因结合到一个基因组里了。1107是一个很低
21、的数值，从一千是一个很低的数值，从一千万个细胞中挑出一个，在果蝇等遗传实万个细胞中挑出一个，在果蝇等遗传实验材料中很难做到这一点。验材料中很难做到这一点。33问题：问题：（1）这种与亲代不同的能在基本培养基）这种与亲代不同的能在基本培养基上生长的细菌上生长的细菌不一定是基因型的改变，不一定是基因型的改变，可能是培养上的互补可能是培养上的互补，即一些物质从一，即一些物质从一个品系的细胞中泄漏出来而被另一个品个品系的细胞中泄漏出来而被另一个品系的细胞所吸收呢？系的细胞所吸收呢？34（2）还是另一种可能，是基因型的改变，）还是另一种可能，是基因型的改变，但不一定是由于两个品系间的杂交，而但不一定是由
22、于两个品系间的杂交，而是是一个品系的一个品系的DNA片段逸出细胞后，携片段逸出细胞后，携带着相应的基因（如带着相应的基因（如met+bio+）进入另）进入另一个品系的细胞，因为这种转化作用而一个品系的细胞，因为这种转化作用而产生了上述的营养型？产生了上述的营养型？35为回答以上问题：为回答以上问题：1950年年Davis的的U型管实验，有力地支型管实验，有力地支持了细菌菌株杂交的判断。他用一个持了细菌菌株杂交的判断。他用一个U型型管，在底部用一块过滤器隔开，把管分管，在底部用一块过滤器隔开，把管分隔为相等的两臂。滤器的孔很小，细菌隔为相等的两臂。滤器的孔很小，细菌不能通过，只有象不能通过，只有
23、象DNA这样这样0.1微米的游微米的游离分子、培养液和营养物质可以通过。离分子、培养液和营养物质可以通过。36 U型管两臂中分别为营养缺陷型品系型管两臂中分别为营养缺陷型品系A和和B，使它们繁殖到饱和状态，同时在，使它们繁殖到饱和状态，同时在U型管的一端交替地吸和压，使两臂中的培型管的一端交替地吸和压，使两臂中的培养液充分混合，但两个品系的细菌却不会养液充分混合，但两个品系的细菌却不会接触。在接触。在U型管中培养一些时间后，再从型管中培养一些时间后，再从两端分别取细菌进行培养，没有发现一个两端分别取细菌进行培养，没有发现一个细菌能在基本培养基上生长。细菌能在基本培养基上生长。37结论：结论：要
24、有原养型要有原养型细胞的形成，细胞的形成，两个菌株间的两个菌株间的直接接触必不直接接触必不可少。可少。38Lederberg 和和 Tatum 根据实验作解释，认为上根据实验作解释，认为上述原养型是两个亲本品系基因的重组体。在述原养型是两个亲本品系基因的重组体。在E.coli 中基因重组经一系列步骤进行：中基因重组经一系列步骤进行：（1）细胞融合；）细胞融合；（2）亲本细胞的遗传物质经过融合形成）亲本细胞的遗传物质经过融合形成 二倍体合子；二倍体合子；（3）遗传物质发生交换的合子经过分裂）遗传物质发生交换的合子经过分裂 产生了带有重组基因的子代细菌。产生了带有重组基因的子代细菌。39这个解释的
25、实质是：这个解释的实质是：在两个亲本细菌之间，就象真核在两个亲本细菌之间，就象真核细胞的有性过程一样，发生了杂交细胞的有性过程一样，发生了杂交和遗传物质的交换，产生了基因重和遗传物质的交换，产生了基因重组体。组体。40用基因符号图解表示：用基因符号图解表示：412.E.coli 遗传物质的单方向转移遗传物质的单方向转移 上述的解释虽然比较正确，但其中有一点上述的解释虽然比较正确，但其中有一点却被却被 Hayes 的一个意外发现所否定。的一个意外发现所否定。Lederbery 和和 Tatum 认为两个亲本细菌在认为两个亲本细菌在基因重组过程中起着同等作用基因重组过程中起着同等作用E.coli
26、的性的性系统是同宗配合。系统是同宗配合。42Hayes则证明：则证明：E.coli 遗传物质的传递方式与具有典型减遗传物质的传递方式与具有典型减数分裂的生物不同。数分裂的生物不同。两个亲本类型对后代的遗传贡献并不相等，两个亲本类型对后代的遗传贡献并不相等，有些亲本基因的组合会在后代出现，有一些则有些亲本基因的组合会在后代出现，有一些则不会出现，而且所有后代中出现的基因都是连不会出现，而且所有后代中出现的基因都是连锁的，因此，锁的，因此，E.coli 的有性过程应该是异宗配的有性过程应该是异宗配合。合。43 Hayes做了一个杂交实验，用的品做了一个杂交实验，用的品系与系与Lederbery和和
27、 Tatum用的相似：用的相似：品系品系A：metthr+Leu+thi+品系品系B：met+thrLeuthi44在杂交前，将品系在杂交前，将品系A或或B用高剂量的链霉素处理（链霉用高剂量的链霉素处理（链霉素并不立即杀死它们，只是阻碍细胞的分裂）素并不立即杀死它们，只是阻碍细胞的分裂）Streptomycin 处理处理 A B 基本培养基基本培养基 原养型重组体原养型重组体 对照对照 A B MM A streptomycin处理处理B 原养型重组体原养型重组体 MM 无原养型重组体产生无原养型重组体产生45Hayes 认为：认为：E.coli 遗传物质的重组不是交互进行，而遗传物质的重组不
28、是交互进行，而是一种单向转移的结果，其中品系是一种单向转移的结果，其中品系A作为遗传作为遗传物质的供体（物质的供体（Donor），品系），品系B的细胞则是遗的细胞则是遗传物质的受体（传物质的受体（Receptor）。当两个亲本细胞）。当两个亲本细胞接触后，供体品系接触后，供体品系A的遗传物质进入受体品系的遗传物质进入受体品系B的细胞中，紧接着的细胞中，紧接着A和和B品系遗传重组现象就品系遗传重组现象就在受体品系在受体品系B的细胞中发生。的细胞中发生。供体品系相当于雄性，受体品系则相当于供体品系相当于雄性，受体品系则相当于雌性。雌性。463.F 因子（因子（Fertility factor）19
29、53年，年，Hayes获得证据：获得证据：E.coli 的遗传交换仅的遗传交换仅 供体细胞供体细胞受体细胞；受体细胞；在在E.coli 两个品系间遗传物质的转移通过一个两个品系间遗传物质的转移通过一个Sex factor F(a fertility factor，致育因子，致育因子)因子介导实行。因子介导实行。供体细胞有供体细胞有F因子因子F 受体细胞缺乏受体细胞缺乏F因子因子F 现在已证实现在已证实F因子是质粒（因子是质粒（plasmid）的一种，能）的一种，能自我复制，象一个微型染色体，包含约自我复制，象一个微型染色体，包含约100个基因。个基因。47F 因子的重要性质：因子的重要性质：（
30、1）能自我复制，保持在分裂的细胞群体中（图）能自我复制，保持在分裂的细胞群体中（图a）（2）携带）携带F因子的细胞产生伞毛（因子的细胞产生伞毛（pili）微小的微小的蛋白质表面管（蛋白质表面管（minute proteinaceoustubules），使），使F细细胞能与其他细胞吸附，并且保持接触（图胞能与其他细胞吸附，并且保持接触（图b）48（3）F细胞能转移新合成的环状细胞能转移新合成的环状F基因组拷贝到受基因组拷贝到受体细胞（体细胞（F）中去（图）中去（图c）。注意）。注意一个拷贝的一个拷贝的F因子因子仍留在供体细胞中仍留在供体细胞中。一旦一个供细胞转移一个拷贝的。一旦一个供细胞转移一个
31、拷贝的F因子到因子到F细胞中，受体细胞也变为细胞中，受体细胞也变为F细胞，因为这细胞，因为这时受体细胞也包含了一个环状的时受体细胞也包含了一个环状的F因子基因组。因子基因组。FFF49（4）F细胞通常阻止与另一个细胞通常阻止与另一个F细胞接触，并且通细胞接触，并且通常不转移常不转移F基因组到基因组到F细胞。细胞。（5）偶尔，）偶尔，F因子整合进宿主细菌染色体上（下图因子整合进宿主细菌染色体上（下图a）。出现这种情况后，）。出现这种情况后，F因子能与自己的因子能与自己的DNA一起一起转移宿主染色体基因（标记）到受体细胞（下图转移宿主染色体基因（标记）到受体细胞（下图b）50（6）整合的）整合的F
32、也能离开细菌染色体回到细胞质也能离开细菌染色体回到细胞质中。少数情况下，脱离染色体时，可以携带寄中。少数情况下，脱离染色体时，可以携带寄主的少数基因，形成环状的主的少数基因，形成环状的F。这种含有细菌。这种含有细菌染色体基因的染色体基因的F因子叫做因子叫做F（F prime）因子）因子，带有带有lac基因的基因的F叫做叫做F(lac)。5152 要把要把F细菌变为细菌变为F，最有效的方法是，最有效的方法是用吖黄素处理。调节吖黄素的浓度，使该用吖黄素处理。调节吖黄素的浓度，使该浓度不妨碍细菌的增殖，但可选择性地阻浓度不妨碍细菌的增殖，但可选择性地阻碍碍F因子的复制，在含有吖黄素的培养液因子的复制
33、，在含有吖黄素的培养液中培养中培养F细菌，所有的细菌都成为细菌，所有的细菌都成为F。534.高频重组高频重组（high frequency of recombination,Hfr）在在E.coli F因子整合进细菌染色体的雄性因子整合进细菌染色体的雄性细胞，当细胞，当F因子促进与雌性细胞（因子促进与雌性细胞（F）接合）接合时，雄性细菌的基因高频率地转移到雌性细时，雄性细菌的基因高频率地转移到雌性细胞中，叫胞中，叫高频重组高频重组。带有一个整合的带有一个整合的F因子的细胞叫做因子的细胞叫做高频重高频重组细胞。组细胞。54 Cavalli（1951年）和年）和Hayes（1954年）先后从年）先
34、后从能育的能育的A品系中分离出了两个新的品系，它们和菌品系中分离出了两个新的品系，它们和菌株株B（F）杂交时，出现的重组体频率很高，通常）杂交时，出现的重组体频率很高，通常比比A FB F杂交组合高出一千倍，这个新菌株杂交组合高出一千倍，这个新菌株叫做叫做 Hfr菌株菌株。已知在已知在FF杂交中，几乎所有杂交中，几乎所有F细菌变为细菌变为F，而在，而在HfrF杂交中，尽管出现高频重组，但杂交中，尽管出现高频重组，但F细菌很少转变为细菌很少转变为F细菌。这个问题使遗传学家细菌。这个问题使遗传学家感到迷惑不解。感到迷惑不解。555.用中断杂交实验作连锁图用中断杂交实验作连锁图 （Interrupt
35、ed-mating experiment）Wollman 和和 Jacob想了解想了解Hfr品系在杂交时，什么品系在杂交时，什么时候把它的基因转入时候把它的基因转入F细胞，进行中断杂交实验，细胞，进行中断杂交实验，对对E.coli 的遗传研究作出了重大突破。的遗传研究作出了重大突破。Hfr thr+Leu+azir tonr Lac+gal+strs F thr Leu azis tons Lac gal strr azi：叠氮化钠；：叠氮化钠；ton：噬菌体：噬菌体 T1；str：链霉素；：链霉素；Lac：乳糖；：乳糖；gal：半乳糖：半乳糖 56 两种菌株两种菌株混合通气培养（混合通气培养
36、（Hfr细菌与细菌与F细菌开细菌开始接触）始接触）形成接受管形成接受管（每隔一定时间）取样（每隔一定时间）取样（菌液在搅拌器内）搅拌（断开接合管，使配对的（菌液在搅拌器内）搅拌（断开接合管，使配对的细菌断开）细菌断开）稀释菌液（防止再度配对）稀释菌液（防止再度配对）涂布在涂布在含有链霉素，但不含有苏氨酸和亮氨酸的培养基上，含有链霉素，但不含有苏氨酸和亮氨酸的培养基上，只有只有thr+和和Leu+的的Hfr菌和带菌和带strr的的F菌的重组子可菌的重组子可以生长。重组子以生长。重组子thr+Leu+strr 的菌落影印培养在若的菌落影印培养在若干不同的选择培养基（干不同的选择培养基（select
37、ive media）上，分析）上，分析Hfr染色体上其它非选择性标记基因进入染色体上其它非选择性标记基因进入F细菌的细菌的顺序和所需时间（分钟）绘制出连锁图。顺序和所需时间（分钟）绘制出连锁图。57 这种根据供体基因进入受体细胞的顺序和这种根据供体基因进入受体细胞的顺序和时间绘制连锁图的技术，称为时间绘制连锁图的技术，称为中断杂交技术中断杂交技术（Interrupted mating technique）。）。营养缺陷型突变基因在杂交试验中有选择营养缺陷型突变基因在杂交试验中有选择重组型排除亲代型的作用，所以称为被选择重组型排除亲代型的作用，所以称为被选择的标记基因。的标记基因。58结果发现结
38、果发现Hfr的选择性标记基因进入的选择性标记基因进入F所需时间：所需时间：分钟分钟5991118259 9分钟分钟时：时：有少量有少量叠氮化物抗性叠氮化物抗性的菌落的菌落，少数少数aziazir r基因进入基因进入F F-细胞。细胞。但对但对T T1 1菌噬体敏感型，菌噬体敏感型，tonAtonAr r基基因还未进入因还未进入F F-细胞。细胞。1111分钟分钟时：时：出现出现抗菌噬体抗菌噬体T T1 1的的F F-细菌。细菌。1818和和2525分钟分钟时：时：分别出现乳糖和半乳糖发分别出现乳糖和半乳糖发酵基因，即酵基因，即lac+和和gal+进入进入F-细细胞。胞。60 从下图可以看到，从
39、从下图可以看到，从Hfr菌株的基因在菌株的基因在F细菌中出细菌中出现开始，随着时间的推移，具有这一基因的菌落逐渐现开始，随着时间的推移，具有这一基因的菌落逐渐增加，直到某一百分数为止；基因出现的时间愈早，增加，直到某一百分数为止；基因出现的时间愈早，它所达到百分数也愈高。它所达到百分数也愈高。例：例：azir 基因出现最早，基因出现最早，24分钟时达到分钟时达到90的的F菌落；菌落；gal+基因出现最迟，基因出现最迟，60分分钟取样，仅钟取样，仅30的菌落的菌落属于能利用型。属于能利用型。61 这说明上述四个基因在混合后这说明上述四个基因在混合后24分钟内，分钟内，以一定的顺序和时间间隔，先后
40、从以一定的顺序和时间间隔，先后从Hfr F进进入入F的细菌中。因为基因位于染色体上，因的细菌中。因为基因位于染色体上，因此，可以说：染色体从一端开始，这一端称此，可以说：染色体从一端开始，这一端称为为原点原点（origin）或）或 0，以线性方式进入，以线性方式进入F细细胞中，基因离开原点越远，进入胞中，基因离开原点越远，进入F细胞越迟。细胞越迟。62 根据中断杂交技术，用杂交后根据中断杂交技术，用杂交后Hfr基因最基因最初在受体细菌中出现的时间作为指标，可以初在受体细菌中出现的时间作为指标，可以作连锁图。这里距离的单位是分钟，如作连锁图。这里距离的单位是分钟，如ton在在azi开始进入开始进
41、入F细胞后细胞后2分钟进入，那么分钟进入，那么azi和和ton相隔相隔2单位。单位。63 如果让如果让Hfr F+F杂交继续进行，长达二杂交继续进行，长达二小时，然后使之中断，发现某些小时，然后使之中断，发现某些F受体转变受体转变为为Hfr F+，这说明，这说明Hrf F的全部基因已转移的全部基因已转移完毕，排在最后的完毕，排在最后的F因子最后转移到受体，使因子最后转移到受体，使它成为供体，但效率很低，是线性染色体的它成为供体，但效率很低，是线性染色体的最后一个单位，可得下图：最后一个单位，可得下图：646.大肠杆菌的染色体呈环形大肠杆菌的染色体呈环形 Wollman和和Jocob 用不同用不
42、同Hfr菌株进行中断杂交试验，菌株进行中断杂交试验，作成连锁图，可见基因转移的顺序、起点和方向都不同：作成连锁图，可见基因转移的顺序、起点和方向都不同：Hfr类型类型 原点原点 基因转移顺序基因转移顺序 H H 0 0 thr thr pro lac pur gal his pro lac pur gal his gly thigly thi 1 0 1 0 thr thi glythr thi gly his gal pur lac pro his gal pur lac pro 2 0 pro 2 0 pro thr thi glythr thi gly his gal pur lac h
43、is gal pur lac 3 0 pur lac pro 3 0 pur lac pro thr thi glythr thi gly his gal his galAB312 AB312 0 0 thi thrthi thr pro lac gur gal his pro lac gur gal his glygly 粗看，都不相同，细看，有规可循：粗看，都不相同，细看，有规可循：任一行中任何一对相邻的基因在其他各行中也相邻。任一行中任何一对相邻的基因在其他各行中也相邻。例如：例如：his 基因总是一边为基因总是一边为gal，另一边为，另一边为gly。其他基因也。其他基因也是如此。是如此
44、。65如：如：his 基因总是一边为基因总是一边为gal，另一边为，另一边为gly。其他基因也是如此。其他基因也是如此。每个每个Hfr菌系的基因排列顺序都相同，所不菌系的基因排列顺序都相同，所不同的是同的是0点的位置改变，基因转移的方向不尽点的位置改变，基因转移的方向不尽相同。相同。66Hfr1和和HfrAB312菌系的中断杂交试验及其连锁图菌系的中断杂交试验及其连锁图Hfr1HfrAB312开始开始开始开始结束结束结束结束67 根据上述分析和致育因子最后转移，推断根据上述分析和致育因子最后转移，推断致育因子一定在致育因子一定在0点的相对一端。点的相对一端。Allan Campbell提出一个
45、惊人的假设：提出一个惊人的假设：在在F雄性细胞里，雄性细胞里，F是一个小的细胞质因是一个小的细胞质因子（在接合后能够方便地转到子（在接合后能够方便地转到F细胞里）。细胞里）。如果如果F雄性细胞的染色体是一个环状的染色雄性细胞的染色体是一个环状的染色体，因而在恰当的位置和合适的方向，体，因而在恰当的位置和合适的方向，F因子因子插入进环状的染色体上都可以产生任何线性插入进环状的染色体上都可以产生任何线性的的Hfr染色体。染色体。68从该假设中得到并证实几个结论：从该假设中得到并证实几个结论：（1）F因子的插入方向将决定因子的插入方向将决定Hfr染色体的极性染色体的极性69（2）插入）插入F因子的一
46、端将是因子的一端将是origin（原点），从原点（原点），从原点Hfr染色体的转移开始；在染色体的转移开始；在F因子另一端的终止点因子另一端的终止点（terminus）可能并不被转移，除非整个染色体都被）可能并不被转移，除非整个染色体都被转移。因为在所有的基因被转移之前染色体经常断裂，转移。因为在所有的基因被转移之前染色体经常断裂，并且因为并且因为F因子的未端常与育性有关，这样因子的未端常与育性有关，这样仅一小部仅一小部分的受体细胞将被转变成雄性细胞（分的受体细胞将被转变成雄性细胞（F+）.707.F因子插入染色体的过程因子插入染色体的过程 F因子是怎样整合（因子是怎样整合（integrate
47、）或插入）或插入（incorports）染色体而使染色体而使F细菌转化成细菌转化成Hfr F+的呢？的呢？F因子因子 环状，由三个区域组成：环状，由三个区域组成：（1）原点（基因）原点（基因O），染色体转移的起始点；），染色体转移的起始点；（2）致育性基因（）致育性基因（Fertility Genes）可使）可使F细胞转化细胞转化 为为F；（3）配对区（）配对区（pairing region），它的核苷酸顺序中有），它的核苷酸顺序中有一段或多段与细菌染色体一段或多段与细菌染色体DNA的某些区段（的某些区段（IS等）对等）对应，通过交换，可以把应，通过交换，可以把F质粒整合到染色体上，从而质粒整
48、合到染色体上，从而使使F转变为转变为Hfr F+。7172 即：在环状的细菌染色体和环状的即：在环状的细菌染色体和环状的F因子之因子之间的一个简单交换，可以形成一个较大的环，间的一个简单交换，可以形成一个较大的环，这种交换的基础是同源重组，因为这种交换的基础是同源重组，因为F因子含有因子含有IS区域，并集中在一起。区域，并集中在一起。E.coli 染色体上也多染色体上也多数有数有IS存在。存在。前述各前述各Hfr菌株染色体的原点和转移方向菌株染色体的原点和转移方向的不同，是的不同，是F因子整合到细菌染色的不同因子整合到细菌染色的不同IS部部位的结果。位的结果。73F因子有两种存在状态：因子有两
49、种存在状态：一种是一种是游离的细胞质因子游离的细胞质因子，它的复制和，它的复制和细胞染色体的复制彼此独立而又相互协调，细胞染色体的复制彼此独立而又相互协调，能单独从能单独从F转入转入F细胞，并使细胞，并使F变成变成F；另一方面可以另一方面可以整合到染色体上成为染色整合到染色体上成为染色体的一个部分体的一个部分而进行复制和传递，这样的质而进行复制和传递，这样的质粒特称为附加体（粒特称为附加体（episomes）。）。748.细菌基因的交换过程细菌基因的交换过程 Hfr F+的染色体进入的染色体进入F的细胞中，接着就发生基因的细胞中，接着就发生基因的交换。在真核细胞中，交换在两个交配亲本的整套基的
50、交换。在真核细胞中，交换在两个交配亲本的整套基因组间进行，但原核生物的交换不一样，由于接合交配因组间进行，但原核生物的交换不一样，由于接合交配过程中断，受体细胞往往只得到供体细胞基因的一部分，过程中断，受体细胞往往只得到供体细胞基因的一部分，得到全部基因组很偶然且是极个别的。得到全部基因组很偶然且是极个别的。这种含有一个亲本全部基因组和另一个亲本一这种含有一个亲本全部基因组和另一个亲本一部分基因组的合子叫做部分基因组的合子叫做部分合子部分合子（merozygote）或部分二倍体（或部分二倍体（partial diploid）75 完整的基因组称作完整的基因组称作F内基因子内基因子（endoge
