1、 人和其他脊椎动物红细胞的主要组成成分，人和其他脊椎动物红细胞的主要组成成分，负责血液中负责血液中氧气氧气和和二氧化碳二氧化碳的运输。的运输。选用一定的选用一定的物理或化学物理或化学的方法分离具有不同物理或化的方法分离具有不同物理或化学性质的学性质的生物大分子生物大分子。根据蛋白质根据蛋白质各种特性各种特性的差异，如的差异，如分子的形状和大小、分子的形状和大小、所带电荷的性质和多少、溶解度、吸附性质和对其他分子所带电荷的性质和多少、溶解度、吸附性质和对其他分子的亲和力的亲和力等等，可用来分离等等，可用来分离不同种类不同种类的蛋白质。的蛋白质。多糖类化合物（如葡聚糖或琼脂糖）构多糖类化合物（如葡
2、聚糖或琼脂糖）构成的成的多孔多孔小球体。小球体。根据蛋白质根据蛋白质相对分子质量相对分子质量的大小，利用的大小，利用具有具有网状结构的凝胶网状结构的凝胶，来进行分离。，来进行分离。相对分子量较小的蛋白质进入凝胶相对分子量较小的蛋白质进入凝胶内内部部的通的通 道，路程道，路程较长较长，移动速度，移动速度较慢较慢;相对分子量较大的蛋白质在凝胶相对分子量较大的蛋白质在凝胶外外部部移动，路程移动，路程较短较短，移动速度，移动速度较快较快。分离蛋白质分离蛋白质混合物上柱混合物上柱 洗脱洗脱 大分子流动快、大分子流动快、小分子流动慢小分子流动慢 收集大收集大分子分子 收集小分子收集小分子洗脱：从色谱柱上端
3、不断注入缓冲液，促使蛋白质分子的差速流动。洗脱：从色谱柱上端不断注入缓冲液，促使蛋白质分子的差速流动。能够抵制外加少量强酸或强碱的影响使原来溶液能够抵制外加少量强酸或强碱的影响使原来溶液PHPH值基本保持不变的混合溶液。值基本保持不变的混合溶液。能够抵制外界的酸和碱对溶液能够抵制外界的酸和碱对溶液PHPH值的影响，维持值的影响，维持PHPH基本不变。基本不变。弱酸和相应的强碱弱酸盐构成。弱酸和相应的强碱弱酸盐构成。,利用缓冲液模拟细胞内的利用缓冲液模拟细胞内的PHPH环境，保证环境，保证 血红蛋白血红蛋白的正常结构和功能，便于观察和科学研究。的正常结构和功能，便于观察和科学研究。H H2 2C
4、OCO3 3/NaHCO/NaHCO3 3 NaH NaH2 2POPO4 4/NaHPO/NaHPO4 4 磷酸缓冲液磷酸缓冲液带电粒子在电场作用下发生迁移的过程。带电粒子在电场作用下发生迁移的过程。许多重要的生物大分子可解离的基团，在一定的许多重要的生物大分子可解离的基团，在一定的PHPH下，基团会带上正电或负电。下，基团会带上正电或负电。在电场的作用下，带电分子会向着与其所带电荷相反在电场的作用下，带电分子会向着与其所带电荷相反的电极移动。的电极移动。利用了待分离样品中各种分子带电性质的差利用了待分离样品中各种分子带电性质的差异以及分子本身的大小、形状的不同，使带电分子产生不异以及分子本
5、身的大小、形状的不同，使带电分子产生不同的迁移速度，从而实现样品中各种分子的分离。同的迁移速度，从而实现样品中各种分子的分离。决定运动方向决定运动方向形成阻力形成阻力决定运动速率决定运动速率电荷性质电荷性质电荷量电荷量分子形状分子形状分子大小分子大小琼脂糖凝胶电泳、聚丙稀酰胺凝胶电泳（通常）。琼脂糖凝胶电泳、聚丙稀酰胺凝胶电泳（通常）。1 1、聚丙烯酰胺凝胶、聚丙烯酰胺凝胶 单体单体（丙烯酰胺）（丙烯酰胺）+交联剂交联剂（N,N-N,N-亚甲基双丙烯酰胺）亚甲基双丙烯酰胺）三三维网状结构的凝胶。维网状结构的凝胶。二、实验操作实验步骤二、实验操作实验步骤 血液组成成分血液组成成分 （1）洗洗 涤
6、涤 红红 细细 胞胞（2）释放释放血红蛋白血红蛋白（3）分离分离血红蛋白血红蛋白（4）透析透析血红蛋白血红蛋白1、样品、样品 处理处理3、纯化、纯化4、纯度鉴定、纯度鉴定2、粗分离、粗分离SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳聚丙烯酰胺凝胶电泳鉴定血红蛋白纯度鉴定血红蛋白纯度凝胶色谱法进行纯化凝胶色谱法进行纯化注意事项注意事项样品处理样品处理粗分离粗分离纯化纯化纯度鉴定纯度鉴定蛋白质提取和分离步骤蛋白质提取和分离步骤人和其他脊椎动物红细胞的主要组成成人和其他脊椎动物红细胞的主要组成成分，负责血液中分，负责血液中氧气氧气和和二氧化碳二氧化碳的运输。的运输。血液血液100mL100mL3g3g柠檬酸钠柠檬酸钠低
7、速离心低速离心500r/min 2 min500r/min 2 min红细胞红细胞(暗红色暗红色)血血 浆浆吸出血浆吸出血浆重复洗涤重复洗涤3 3次，直至上清液没有黄色次，直至上清液没有黄色（一）样品的处理及粗分离（一）样品的处理及粗分离 去除杂蛋白去除杂蛋白，以利于后续血红蛋白的，以利于后续血红蛋白的分离纯化，洗涤次数不可过少。分离纯化，洗涤次数不可过少。红细胞红细胞(低速适低速适时离心时离心)5 5倍体积生理盐水倍体积生理盐水搅拌搅拌10min10min 1 1、取血样时加入柠檬酸、取血样时加入柠檬酸钠的目的？钠的目的？2 2、为什么要低速、短时、为什么要低速、短时离心？离心？3 3、为什
8、么要缓慢搅拌？、为什么要缓慢搅拌？防止血液凝固防止血液凝固防止白细胞沉淀防止白细胞沉淀防止红细胞破裂，释放出血红蛋白防止红细胞破裂，释放出血红蛋白2.2.释放血红蛋白释放血红蛋白(1)(1)释放血红蛋白过程中，在洗涤释放血红蛋白过程中，在洗涤好的红细胞加入了哪些物质？好的红细胞加入了哪些物质？(2)(2)为了加速释放过程，采取了什么措施？为了加速释放过程，采取了什么措施？蒸馏水的作用蒸馏水的作用是是_。加入甲苯的作用加入甲苯的作用是是_。充分搅拌的目的是充分搅拌的目的是_。使红细胞大量吸水胀裂使红细胞大量吸水胀裂溶解红细胞的细胞膜溶解红细胞的细胞膜加速红细胞的破裂加速红细胞的破裂你有什么方法将
9、红细胞中的血红蛋你有什么方法将红细胞中的血红蛋白释放出来？白释放出来？磁力搅拌器磁力搅拌器3.3.分离血红蛋白分离血红蛋白 如何去除去其中的杂质呢？如何去除去其中的杂质呢？红细胞红细胞混合液混合液高速离心高速离心10min 离心管离心管滤纸滤纸过滤过滤脂类物质脂类物质烧杯烧杯分离过程分离过程:4.4.透析血红蛋白透析血红蛋白 透析的目的：透析的目的：为什么缓冲液的量远多于血红蛋为什么缓冲液的量远多于血红蛋白溶液量？白溶液量？有利于杂质分子充分地向外扩散。有利于杂质分子充分地向外扩散。20mmol/L磷酸缓冲液磷酸缓冲液30mL PH=7.0，12h1mL透析袋一般是用透析袋一般是用硝酸纤维素（
10、玻硝酸纤维素（玻璃纸）制成的。璃纸）制成的。透析的原理：小分子自由出入，大分子小分子自由出入，大分子保保留在带内留在带内去除去样品中分子量较小的杂质去除去样品中分子量较小的杂质（二）凝胶色谱操作（二）凝胶色谱操作 P68P68图图5 519 19准备材料准备材料加工橡皮塞加工橡皮塞安装色谱柱安装色谱柱装配好的凝胶装配好的凝胶柱柱材料：交联葡聚糖凝胶材料：交联葡聚糖凝胶G-75G-75；20mmol/L20mmol/L磷酸缓冲液磷酸缓冲液装填装填:2.2.凝胶色谱柱的装填凝胶色谱柱的装填步骤步骤操作要求操作要求立刻用磷酸缓冲液洗涤平衡立刻用磷酸缓冲液洗涤平衡12h12h洗涤平衡洗涤平衡一次性缓慢
11、倒入；轻轻敲打一次性缓慢倒入；轻轻敲打装填悬浮液装填悬浮液凝胶颗粒洗脱液凝胶颗粒洗脱液沸水浴沸水浴 凝胶颗粒蒸馏水凝胶颗粒蒸馏水充分溶胀充分溶胀根据色谱柱体积计算凝胶用量根据色谱柱体积计算凝胶用量色谱柱垂直固定在支架上色谱柱垂直固定在支架上配制悬浮液配制悬浮液计算称量凝胶计算称量凝胶固定色谱柱固定色谱柱思考：配制悬浮液时，为什么可以用沸水浴沸水浴思考：配制悬浮液时，为什么可以用沸水浴沸水浴节约时间，除去凝胶中可能带有的微生物，排除胶粒内的空气正确的加样操作是：正确的加样操作是：1 1、不要触及并破坏凝胶面。、不要触及并破坏凝胶面。2 2、贴、贴壁加样。壁加样。3 3、使吸管管口沿管壁环绕移动。
12、、使吸管管口沿管壁环绕移动。1 1、洗脱液面不要低于凝胶表面，、洗脱液面不要低于凝胶表面，否则可能有否则可能有气泡混入，影响液气泡混入，影响液体在柱内的流动与最终生物大体在柱内的流动与最终生物大分子物质的分离效果分子物质的分离效果。2 2、不能发生洗脱液流干，露出、不能发生洗脱液流干，露出凝胶颗粒的现象。凝胶颗粒的现象。收集得到的纯化后的血红蛋白收集得到的纯化后的血红蛋白注意事项注意事项 洗涤次数不能过少；低速、短时离心洗涤次数不能过少；低速、短时离心 沸水浴法时间短，还能除去微生物和气泡沸水浴法时间短，还能除去微生物和气泡 装填尽量紧密，降低颗粒间隙；装填尽量紧密，降低颗粒间隙；无气泡；洗脱
13、液不能断流无气泡；洗脱液不能断流 红色区带均匀一致地移动。红色区带均匀一致地移动。让血红蛋白处在稳定的让血红蛋白处在稳定的pHpH范围内，维持结构和功能正常。范围内，维持结构和功能正常。血红蛋白是血红蛋白是有色蛋白有色蛋白，因此在凝胶色谱分离时可以通过观察，因此在凝胶色谱分离时可以通过观察颜颜色色来判断什么时候应该收集洗脱液。这使血红蛋白的分离过程非来判断什么时候应该收集洗脱液。这使血红蛋白的分离过程非常直观，大大简化了实验操作。常直观，大大简化了实验操作。1.1.红细胞的洗涤：红细胞的洗涤：2.2.凝胶的预处理：凝胶的预处理：3.3.色谱柱的装填：色谱柱的装填：4.4.色谱柱成功标志：色谱柱成功标志：离心时间长，转速快，会使白细胞等一同沉淀Bb b BBBB b
