1、血红蛋白的提取和别离血红蛋白的提取和别离(shk)第一页，共66页。学习目的 简述蛋白质提取和别离的根本原理，并理解凝胶色谱法、电泳法等别离生物大分子的根本原理。1、主要概念：凝胶色谱法 电泳法 缓冲溶液 它们在血红蛋白的提取中分别起到什么作用。2.主要原理：凝胶色谱法别离蛋白质的原理 电泳法别离样品的原理 缓冲溶液的组成和作用机理3、课题重点：凝胶色谱法的原理和方法 4、课题难点：样品的预处理 色谱柱填料的处理和色谱柱的装填。2021/1/122第二页，共66页。2003年4月14日宣布人类基因组序列图完成这标志着进入了后基因组和蛋白质组时代。人类基因组：指DNA分子所携带的全部遗传信息。蛋
2、白质组：生物个体表达的蛋白质分子的总和。主要是对蛋白质功能的研究。对蛋白质的研究和应用，首先需要获得纯度较高的蛋白质。如何从复杂的细胞混合物中提取，别离高纯度的蛋白质呢？2021/1/123第三页，共66页。考虑1 别离生物大分子的根本思路是什么？选用一定的物理或化学的方法别离具有不同物理或化学性质的生物大分子。考虑2 蛋白质的别离和提取的原理是什么？根据蛋白质各种特性的差异，如分子的形状和大小、所带电荷的性质和多少、溶解度和吸附的性质和对其他分子的亲和力等等，可以用来别离不同蛋白质。你认为别离蛋白质和别离DNA一样容易吗？2021/1/124第四页，共66页。考虑3 人们用鸡的红细胞提取DN
3、A，用人 的红细胞提取血红蛋白的原因是什么？鸡的红细胞具有细胞核，含有DNA，便于进展DNA的提取，人的红细胞无细胞核，构造简单，血红蛋白含量丰富便于提取血红蛋白。2021/1/125第五页，共66页。提取提取分离分离方法方法凝胶色谱法凝胶色谱法 凝胶电泳法凝胶电泳法 别离蛋白质的方法：2021/1/126第六页，共66页。一、根底知识 凝胶色谱法分配色谱法：1、凝胶：一些微小多孔的球体内含许多贯穿的通道，由多糖类化合物构成如葡聚糖、琼脂糖，具多孔的凝胶就叫分子筛 2、概念：根据被别离的蛋白质相对分子质量的大小，利用具有网状构造的凝胶的分子筛作用，来进展别离。2021/1/127第七页，共66
4、页。3、原理：当不同的蛋白质通过凝胶时，的蛋白质容易进入凝胶内部的通道，路程 ，挪动速度 ，而 的蛋白质无法进入凝胶内部的通道，只能在 挪动，路程 ，挪动速度 ，相对分子质量不同的蛋白质因此得以别离。4、详细过程相对分子质量较小较长较慢相对分子质量较大凝胶外部较短较快2021/1/128第八页，共66页。2021/1/129第九页，共66页。2021/1/1210第十页，共66页。1、概念：在一定的范围内，能对抗外来少量强酸、强碱或稍加稀释不引起溶液PH发生明显变化的作用叫做缓冲作用，具有缓冲作用的溶液叫做缓冲溶液。缓冲溶液：2、作用：可以抵抗 对溶液的 的影响，维持PH根本不变。外界的酸或碱
5、PH值2021/1/1211第十一页，共66页。3、缓冲溶液的配制通常由 种缓冲剂溶解于水中配制而成。调节缓冲剂的 就可以制得 使用的缓冲液。12使用比例在不同PH范围内 考虑：说出人体血液中缓冲对。NaH2PO4 /Na2HPO4H2CO3 /NaHCO32021/1/1212第十二页，共66页。电泳：1、概念：指带电粒子在电场作用下发生 迁移的过程。考虑：在整个实验过程中使用的缓冲液是什么？它的目的是什么？使用的是磷酸缓冲液，目的是利用缓冲液模拟细胞内的PH环境，保证血红蛋白的正常构造和功能，便于观察红色和材料的科学研究活性。2021/1/1213第十三页，共66页。2、原理：许多重要的生
6、物大分子，如 等都具有 )在()下，这些基团会带上 。在电场的作用下，这些带电分子会向着与其 挪动。电泳利用了待别离样品中各种分子 以及分子本身 、的不同使带电分子产生不同的 ，从而实现样品中各种分子的别离。多肽、核酸可解离的基团正电或负电所带电荷相反的电极带电性质的差异大小形状迁移速度 一定的PH2021/1/1214第十四页，共66页。2021/1/1215第十五页，共66页。1聚丙稀酰胺凝胶：是由单体丙烯酰胺和交联剂N,N-甲叉双丙烯酰胺在引发剂(过硫酸铵和催化剂四甲基已二胺的作用下聚合交联成三维网状构造的凝胶 3.分类：两种常用的电泳方法:琼脂糖凝胶电泳和聚丙稀酰胺凝胶电泳。聚丙烯酰胺
7、凝胶电泳：蛋白质在聚丙烯酰胺凝胶中的迁移率取决于它所带静电荷的多少以及分子的大小等因素。2原理 2021/1/1216第十六页，共66页。为了消除静电荷对迁移率的影响可以在凝胶中参加()。SDS能使蛋白质发生完全变性。由几条肽链组成的蛋白质复合体在SDS的作用下会解聚成单条肽链，因此测定的结果只是()。SDS能与各种蛋白质形成蛋白质SDS复合物，SDS所带负电荷的量大大超过了蛋白质分子原有电荷量。因此掩盖了不同种蛋白质间的电荷差异，使电泳迁移率完全取决于()。3SDS-聚丙稀酰胺凝胶电泳作用机理:单条肽链的分子量分子的大小SDS注意：测定 通常用十二烷基磺酸钠SDS聚丙稀酰胺凝胶电泳蛋白质相对
8、分子质量2021/1/1217第十七页，共66页。聚丙烯酰胺凝胶电泳对别离大分子具有较高的分辨率，但核酸比蛋白质分子大得多，只能采用较大孔径的琼脂糖凝胶电泳。核酸分子本身含有大量的磷酸根，核酸带负电荷，在电场中向正极挪动。溴化乙啶荧光染料对核酸染色在紫外线的照射下，发出橙红色荧光。根据荧光条带的粗细和分布的位置，可以用在对PCR扩增效果的鉴定上。说明：2021/1/1218第十八页，共66页。电泳检测PCR结果2021/1/1219第十九页，共66页。二、实验操作 蛋白质的提取和别离一般分为四步：1.样品处理：包括洗涤红细胞；血红蛋白稀释；离心等操作搜集到血红蛋白溶液。2.粗别离：透析除去分子
9、较小的杂质。3.纯化：通过凝胶色谱法将分子量较大的杂质蛋白质除去。4.纯度鉴定：通过聚丙烯酰胺凝胶电泳鉴定。2021/1/1220第二十页，共66页。二 实验操作血液血浆水分其他物质血浆蛋白无机盐磷脂葡萄糖等血细胞白细胞血小板红细胞最多血红蛋白 两个a肽链两个一肽链共四条肽链902021/1/1221第二十一页，共66页。2021/1/1222第二十二页，共66页。2021/1/1223第二十三页，共66页。每个肽链环绕一个亚铁血红素基团，此基团可携带一分子氧或一分子二氧化碳，血红蛋白因含有血红素而呈红色。2021/1/1224第二十四页，共66页。目的：去除 方法：离心速度越高和时间越长会使
10、白细胞和淋巴细胞等一同沉淀达不到别离的效果，然后用胶头吸管吸出上层透明的 ，将下层 的红细胞液体倒入 每个肽链环绕 ，此基团可携带 。血红蛋白因含有 而呈红色。本课题可选用猪、牛、羊或其他哺乳动物的血液来别离血红蛋白。一个亚铁血红素基团一分子氧或一分子二氧化碳血红素(1)红细胞的洗涤杂质蛋白低速短时间黄色血浆暗红色烧杯2021/1/1225第二十五页，共66页。再参加用 的 质量分数为0.9的氯化钠溶液洗涤,缓慢搅拌10min，离心.五倍体积生理盐水低速短时间如此重复洗涤 次，直至上清液中已没有 ，说明洗涤干净。利于后续血红蛋白的别离纯化，不可洗涤次数过少。三黄色2021/1/1226第二十六
11、页，共66页。洗涤过程图解血液100mL3g3g柠檬酸钠柠檬酸钠低速离心低速离心2 min2 min红细胞红细胞血浆血浆吸出血浆吸出血浆红细胞红细胞5 5倍体积生理盐水倍体积生理盐水搅拌搅拌10min10min重复洗涤3次，直至上清液没有黄色2021/1/1227第二十七页，共66页。(2)血红蛋白的释放 加 到 体积，再加40体积的 溶解细胞膜，置于 上充分搅拌10min加速细胞破裂,细胞破裂释放出血红蛋白.(3)别离血红蛋白溶液 将搅拌好的混合液转移到离心管内，以2000r/min的速度离心10 min，试管中的溶液分为4层:原血液甲苯磁力搅拌器蒸馏水2021/1/1228第二十八页，共6
12、6页。第1层最上层：甲苯层第2层中上层：色薄层固体，的沉淀层。第3层中下层：的液体，的水溶液层。第4层最下层：其它杂质 的沉淀层无色透明脂溶性物质白血红蛋白红色透明暗红色2021/1/1229第二十九页，共66页。用 过滤，除去 ，于分液漏斗中静置片刻后，分出下层的红色透明液体。滤纸脂溶性沉淀层2021/1/1230第三十页，共66页。别离血红蛋白别离过程红细胞混合液高速离心高速离心10min 10min 离心管离心管滤纸滤纸过滤过滤脂脂溶性沉淀溶性沉淀物物烧杯烧杯2021/1/1231第三十一页，共66页。取()ml的血红蛋白溶液装入 中，将透析袋放入盛有300ml的物质的量浓度为20mmo
13、l/L的 中，pH为 ，透析12小时，目的是 或用于更换样品中的 。透析袋一般用硝酸纤维素制成，又称玻璃纸。除去样品中分子量较小的杂质透析袋磷酸缓冲液缓冲液(4)透析粗别离12021/1/1232第三十二页，共66页。2021/1/1233第三十三页，共66页。小结：样品处理和粗别离n1、红细胞的洗涤：n目的是去除杂蛋白。要参加柠檬酸钠防止血液凝固；离心将血液分层，用胶头吸管吸出黄色血浆；用生理盐水洗涤。n2、血红蛋白的释放：n在蒸馏水和甲苯作用下，红细胞破裂释放n3、别离血红蛋白溶液：n离心分层；滤纸过滤去除脂溶性沉淀层；分液漏斗分出红色透明液体。n4、透析：n装入透析袋并置于磷酸缓冲液中P
14、H为7.0透析。去除小分子杂质。2021/1/1234第三十四页，共66页。(1)凝胶色谱柱的制作(2)凝胶色谱柱的装填(3)样品的参加和洗脱血红蛋白的纯化2021/1/1235第三十五页，共66页。凝胶色谱柱的制作：本卷须知：底塞中插入的玻璃管的上部不得超出橡皮塞的凹穴底面，否那么难以铺实尼龙网，还会导致液体残留，蛋白质别离不彻底。2021/1/1236第三十六页，共66页。材料：交联葡聚糖凝胶G-75；20mmol/L磷酸缓冲液装填:(2)凝胶色谱柱的装填：步骤操作要求立即用磷酸缓冲液洗涤平衡12h洗涤平衡一次性缓慢倒入；轻轻敲打装填悬浮液凝胶颗粒洗脱液沸水浴 凝胶颗粒蒸馏水充分溶胀根据色
15、谱柱体积计算凝胶用量色谱柱垂直固定在支架上配制悬浮液计算称量凝胶固定色谱柱2021/1/1237第三十七页，共66页。(3)样品的参加和洗脱调节缓冲液面滴加透析样品注意：正确的加样操作是：1.不要触及并破坏凝胶面。2.贴壁加样。3.使吸管管口沿管壁环绕挪动。样品渗入凝胶床 洗脱 搜集注意：在别离过程中，假如红色区带均匀一致的挪动，说明色谱柱制作成功。2021/1/1238第三十八页，共66页。2021/1/1239第三十九页，共66页。3.SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳选做判断 的蛋白质是否到达要求，需要进展蛋白质的鉴定。纯化2021/1/1240第四十页，共66页。知识总结血红蛋白的提取和别离蛋白
16、质分子的差异性蛋白质分子的差异性凝胶色谱法凝胶色谱法 原理原理 分离过程分离过程凝胶电泳法凝胶电泳法缓冲溶液缓冲溶液组组 成成作作 用用蛋白质的蛋白质的提取分离提取分离样品处理样品处理粗分离粗分离纯纯 化化纯度鉴定纯度鉴定2021/1/1241第四十一页，共66页。影响蛋白质分子运动的因素 决定运动方向形成库仑力形成阻力决定运动速率电荷性质电荷量分子形状分子大小2021/1/1242第四十二页，共66页。观察你处理的血液样品离心后是否分层见教科书图5-18，假如分层不明显，可能是洗涤次数少、未能除去血浆蛋白的原因。此外，离心速度过高和时间过长，会使白细胞和淋巴细胞一同沉淀，也得不到纯洁的红细胞
17、，影响后续血红蛋白的提取纯度。三 实验结果分析与评价1、是否完成对血液样品的处理2021/1/1243第四十三页，共66页。由于凝胶是一种半透明的介质，因此可以在凝胶柱旁放一支与凝胶柱垂直的日光灯，检查凝胶是否装填得均匀。此外，还可以参加大分子的有色物质，例如蓝色葡聚糖2000或红色葡聚糖，观察色带挪动的情况。假如色带均匀、狭窄、平整，说明凝胶色谱柱的性能良好。假如色谱柱出现纹路或是气泡，轻轻敲打柱体以消除气泡，消除不了时要重新装柱。2、凝胶色谱柱的装填是否成功2021/1/1244第四十四页，共66页。3、血红蛋白的别离是否成功假如凝胶色谱柱装填得很成功、别离操作也正确的话，能清楚地看到血红
18、蛋白的红色区带均匀、狭窄、平整，随着洗脱液缓慢流出；假如红色区带歪曲、散乱、变宽，说明别离的效果不好，这与凝胶色谱柱的装填有关。2021/1/1245第四十五页，共66页。课后练习1提取DNA的第一步是材料的选取，其目的是一定要选取DNA含量较高的生物材料，否那么会由于实验过程中或多或少的损失而造成检测的困难；第二步是DNA的释放和溶解，这一步是实验成功与否的关键，要尽可能使细胞内的DNA全部溶解；第三步是DNA的纯化，即根据DNA的溶解特性、对酶及高温的耐受性的不同等特性，最大限度地将DNA与杂质分开；最后一步是对DNA进展鉴定，这是对整个实验的结果的检测。(P57)2021/1/1246第
19、四十六页，共66页。2提取蛋白质比提取DNA的难度大。这是因为，与DNA相比，蛋白质对温度、盐浓度、pH等条件要敏感得多，很容易失活；并且蛋白质的空间构造多种多样，理化性质各不一样，使得蛋白质的提取没有一种统一的方法，只能根据特定蛋白质的特性探究提取的条件，设计特定的方法。2021/1/1247第四十七页，共66页。课后练习(P63)1.绘图可参考教科书中图5-9。PCR反响中的目的片段一般以2n的方式积累，其中n为反响循环次数。一个DNA片段在30次循环后反响物中大约有10亿个这样的片段2n=230=1 073 741 824)。2.PCR引物是根据需要扩增的目的DNA的碱基序列来设计的。2
20、021/1/1248第四十八页，共66页。课后练习(P70)1凝胶色谱法也称为分配色谱法，它是根据分子量的大小别离蛋白质的方法之一。所用的凝胶实际上是一些微小的多孔球体，这些小球体大多数是由多糖类化合物构成，小球体内部有许多贯穿的通道，当一个含有各种分子的样品溶液缓慢流经时，各分子在色谱柱内进展两种不同的运动，即垂直向下的运动和无规那么的扩散运动。相对分子质量较大的蛋白质分子不能进入凝胶颗粒内部，只能分布在颗粒之间，通过的路程较短，挪动速度较快；相对分子质量较小的蛋白质分子比较2021/1/1249第四十九页，共66页。容易进入凝胶内的通道，通过的路程较长，挪动速度较慢。因此，样品中相对分子质
21、量较大的蛋白质先流出，相对分子质量中等的分子后流出，相对分子质量最小的分子最后流出，这种现象又叫分子筛现象。此外，凝胶本身具有三维网状构造，相对分子质量大的分子通过这种网状构造上的空隙时阻力大，而相对分子质量小的分子通过时阻力小，因此不同分子量的蛋白质分子可以获得别离。2021/1/1250第五十页，共66页。2在一定范围内，能对抗外来少量强酸、强碱或稍加稀释不引起溶液pH发生明显变化的作用叫做缓冲作用，具有缓冲作用的溶液叫做缓冲溶液。缓冲溶液通常是由一或两种化合物缓冲剂溶解于水中制得，调节缓冲剂的配比就可制得不同pH范围的缓冲液。缓冲溶液的作用是维持反响体系的pH不变。在生物体内进展的各种生
22、物化学过程都是在准确的pH下进展的，受到氢离子浓度的严风格控。为了在实验室条件下准确地模拟生物体内的天然环境，就必须保持体外生物化学反响过程有与体内过程完全一样的pH。2021/1/1251第五十一页，共66页。3电泳是指带电粒子在电场的作用下发生迁移的过程。许多重要的生物分子，如氨基酸、多肽、蛋白质、核苷酸、核酸等都具有可解离基团，它们在某个特定的pH下会带上正电或负电；在电场的作用下，这些带电分子会向着与其所带电荷相反的电极方向挪动。电泳技术就是在电场的作用下，利用待别离样品中各种分子带电性质以及分子本身大小、形状等性质的差异，使带电分子产生不同的迁移速度，从而到达对样品进展别离、鉴定或提
23、纯的目的。2021/1/1252第五十二页，共66页。4血红蛋白提取和别离的程序可分为四大步，包括：样品处理、粗别离、纯化和纯度鉴定。首先通过洗涤红细胞、血红蛋白的释放、离心等操作搜集到血红蛋白溶液，即样品的处理；再经过透析去除分子量较小的杂质，即样品的粗别离；然后通过凝胶色谱法将相对分子质量大的杂质蛋白除去，即样品的纯化；最后经聚丙烯酰胺凝胶电泳进展纯度鉴定。2021/1/1253第五十三页，共66页。5血红蛋白是有色蛋白，因此在凝胶色谱别离时可以通过观察颜色来判断什么时候应该搜集洗脱液。这使血红蛋白的别离过程非常直观，大大简化了实验操作。2021/1/1254第五十四页，共66页。讨论：如
24、何测定蛋白质的分子量？使用SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳测定蛋白质的分子量时，可选用一组分子量的标准蛋白同时进展电泳，根据分子量的标准蛋白的电泳区带位置，用电泳迁移率和分子量的对数作标准曲线，可以测定未知蛋白质的分子量。市场上有高分子量、次高分子量及低分子量的标准蛋白试剂出售2021/1/1255第五十五页，共66页。练习稳固1、随着人类跨入蛋白质组时代，对蛋白质的研究和应用越来越深化，首先要做的一步是A 弄清各种蛋白质的空间构造B 弄清各种蛋白质的功能C 弄清各种蛋白质的合成过程D 获得高纯度的蛋白质2021/1/1256第五十六页，共66页。2、用凝胶色谱法别离蛋白质的过程中，关于蛋白质的表达，
25、正确的选项是A 相对分子质量较小的蛋白质行程大于相对分子质量较大的蛋白质B 相对分子质量较小的蛋白质行程小于相对分子质量较大的蛋白质C 相对分子质量较小的蛋白质行程等于相对分子质量较大的蛋白质D 二者根本无法比较2021/1/1257第五十七页，共66页。3、使用SDS-聚丙烯酰胺电泳过程中，不同蛋白质的电泳迁移率完全取决于A 电荷的多少 B 分子的大小C 肽链的多少 D 分子形状的差异4、在采血容器中参加柠檬酸钠的目的是A 调节pH B 维持红细胞的能量供给C 防止微生物生长 D 防止血液凝固2021/1/1258第五十八页，共66页。5、一分子血红蛋白最多可携带的 O2分子数和CO2分子数
26、分别是A 4、2 B 4、4 C 2、1 D、1、16、记住样品处理中的血红蛋白溶液离心后分层顺序自上而下是：有机溶剂-脂类物质-血红蛋白溶液-红细胞破碎物沉淀2021/1/1259第五十九页，共66页。B2021/1/1260第六十页，共66页。8.凝胶色谱柱取长为40 cm，内径为16 cm，有关说法中，正确的选项是 (多项选择)A一般凝胶色谱柱直径的大小不影响别离的效果B凝胶色谱柱过高超过1 m，不影响别离的效果C凝胶色谱柱过矮，那么影响混合物的别离度D凝胶色谱柱直径过大会耗用过多洗脱液，样品的稀释度过大2021/1/1261第六十一页，共66页。n9.在装填凝胶柱时，不能有气泡存在的原
27、因是nA、气泡会搅乱洗脱液中蛋白质的洗脱次 序，降低别离效果nB、气泡阻碍蛋白质的运动nC、气泡与蛋白质发生化学反响nD、气泡在装填凝胶的时候，使凝胶不严密A2021/1/1262第六十二页，共66页。n10.样品的参加和洗脱的操作不正确的选项是nA 加样前，翻开色谱柱下端的流出口，使柱内凝胶面上的缓冲液缓慢下降到凝胶面的下面nB加样后，翻开下端出口，使样品渗入凝胶床内nC等样品完全进入凝胶层后，关闭下端出口nD用吸管小心的将1ml透析后的样品加到色谱柱的顶端，不要破坏凝胶面A2021/1/1263第六十三页，共66页。n11.以下是有关血红蛋白提取和别离的相关操作，其中正确的选项是 nA可采集猪血作为实验材料 B用蒸馏水重复洗涤红细胞nC血红蛋白释放后应低速短时间离心 D洗脱液接近色谱柱底端时开场搜集流出液 A2021/1/1264第六十四页，共66页。2021/1/1265第六十五页，共66页。第六十六页，共66页。
