1、第四讲 高效液相色谱法一.高效液相色谱法简介起源于20世纪60年代末至70年代初融合了经典液相色谱和气相色谱的优点。速度快、效率高、操作自动化适用于蛋白质、核酸、氨基酸、多糖类、植物色素、高聚物、染料及药物等物质的分析。比较高效液相色谱法 与经典液相色谱法高速 高效液相色谱法在分析速度上比经典液相色谱法快数百倍。高效 由于高效液相色谱应用了颗粒极细(几微米至几十微米直径)、规则、均匀的固定相，传质阻力小，分离效率高。高灵敏度 由于现代高效液相色谱仪普遍配有高灵敏度检测器，使其分析灵敏度比经典色谱有较大提高。高效液相色谱=高速液相色谱=高压液相色谱高效液相色谱法与气相色谱法比较 三方面的优点气相
2、色谱法分析对象只限于分析气体和沸点较低的化合物，它们仅占有机物总数的30。占有机物总数近70的高沸点、热稳定性差、分子量大的物质，主要采用高效液相色谱法进行分离和分析。气相色谱一般都在较高温度下进行的，而高效液相色谱法则经常可在室温条件下工作。二.高效液相色谱仪结构 高效液相色谱仪的结构一般可分为4个主要部分：高压输液系统，进样系统，分离系统和检测系统。此外还配有辅助装置：如梯度淋洗，自动进样及数据处理等。高效液相色谱仪工作过程 首先高压泵将贮液器中流动相溶剂经过进样器送入色谱柱，然后从控制器的出口流出。当注入欲分离的样品时，流经进样器的流动相将样品同时带入色谱柱进行分离，然后依先后顺序进入检
3、测器，记录仪将检测器送出的信号记录下来，由此得到液相色谱图。1、高压输液系统 一般由储液罐、高压输液泵、过滤器、压力脉动阻尼器等组成。由于高效液相色谱所用固定相颗粒极细，因此对流动相阻力很大，为使流动相较快流动，必须配备有高压输液系统。它是高效液相色谱仪最重要的部件，2、进祥系统隔膜注射进样器 在色谱柱顶端装一耐压弹性隔膜，进样时用微量注射器刺穿隔膜将试样注入色谱柱。优点：装置简单、价廉、死体积小，缺点是允许进样量小，重复性差。高压进样阀 目前多采用六通阀进样。进样量由定量管的体积严格控制，进样准确，重复性好，适于作定量分析，更换不同体积的定量管，可调整进样量。3、色谱柱是液相色谱的心脏部件，
4、包括柱管与固定相两部分。玻璃管耐压有限，故金属管用得较多。一般色谱柱长530cm，内径为45mm，凝胶色谱柱内径312mm，制备柱内径较大，可达25mm以上。保护柱：一般在分离前备有一个前置柱，内填充物和分离柱完全一样，这样可使淋洗溶剂由于经过前置柱为其中的固定相饱和，使它在流过分离柱时不再洗脱其中固定相，保证分离柱性能不受影响。4、检测系统包括两种基本类型的检测器。一类是溶质性检测器。它仅对被分离组分的物理或化学特性有响应，属于这类检测器的有紫外、荧光、电化学检测器等。另一类是总体检测器，它对试样和洗脱液总的物理或化学性质有响应，属于这类检测器的有示差折光，电导检测器等。（检出限可达（检出限
5、可达10101212 g/cm g/cm3 3 10101313 g/cm g/cm3 3 ），），5、附属系统 它包括脱气、梯度淋洗、恒温、自动进样、馏分收集以及数据处理等装置。梯度淋洗，指在分离过程中使流动相的组成随时间改变而改变。通过连续改变色谱柱中流动相的极性、离子强度或pH等因素，使被侧组分的相对保留值得以改变，提高分离效率。四.高效液相色谱法的使用技巧1.分离类型的选择 高效液相色谱法的各种方法都各有其自身特点和应用范围，一种方法不可能是万能的，它们往往相互补充。应根据分离分析目的；试样的性质和量多少；现有设备条件等选择最合适的方法。一般可根据试样的相对分子质量大小，溶解度及分子结
6、构等进行分离方法初步选择。根据相对分子质量选择 相对分子质量十分低的样品，其挥发性好，适用于气相色谱，标准液相色谱类型(液固、液液、及离子交换色谱)最适合的相对分子质量范围是200-2000。对于相对分子质量大于2000的样品，则用尺寸排阻法为最佳。根据溶解度选择 如果样品可溶于水并属于能离解物质，以采用离子交换色谱为佳；如样品可溶于烃类(如苯或异辛烷)，则可采用液固吸附色谱；如样品溶解于四氯化碳。则多采用常规的分配和吸附色谱分离；如样品既溶于水又溶于异丙醇时，常用水和异丙醇的混合液作液液分配色谱的流动相，以憎水性化合物作固定相。根据分子结构选择 （用红外光谱法简单判断样品中的官能团，确定采用
7、的方法）酸、碱化合物用离子交换色谱；脂肪族或芳香族用液液分配色谱、液固吸附色谱；异构体用液固吸附色谱；同系物不同官能团及强氢键的用液液分配色谱。2.流动相溶剂的要求溶剂对于待测样品，必须具有合适的极性和良好的选择性。化学稳定性好。不能选与样品发生反应或聚合的溶剂。高纯度、低粘度、与检测器匹配。五、高效液相色谱法的计算1.外标法该法是应用最广泛的方法之一，其误差来源主要是进样误差，因此，分析前一定要做面积重复性（即进样重复性）实验。外标法公式：iFiFAiCi21优点：1）不需所有峰都流出或被检测到2）只对所测组分作校正缺点：1）进样量必须准确2）仪器必须有良好的稳定性2、内标法在样品中添加内标物，通过组分与内标峰的面积比，对组分进行定量。该方法减小了进样误差对定量结果的影响。选择内标物应注意理化性质与待测物相近色谱响应与待测物相近与待测物有良好的分离，但不能相距太远与待测物的峰面积比为0.7-1.3最好，因此要根据待测物的浓度确定内标物的添加量内标法内标法公式：ISISCiFiFAAiCi)(21优点：1）进样量不严格要求2）只对所测组分作校正缺点：1）必须在样品中加一内标组分2）操作较为繁琐3）选择内标物困难
