1、 质粒质粒DNA的提取及鉴定的提取及鉴定 生物化学与分子生物学系生物化学与分子生物学系 伍兵伍兵 实验目的实验目的 掌握质粒掌握质粒DNA制备的原理和方法制备的原理和方法 了解质粒琼脂糖凝胶电泳分离了解质粒琼脂糖凝胶电泳分离 Bacterial DNA Plasmids 质粒质粒 碱裂解法流程图 对数期菌体 溶液III中和 溶液I充分重悬 溶液II裂解 上清液(含DNA) 酚/氯仿去蛋白 70%乙醇洗涤沉淀 乙醇沉淀DNA TE溶解DNA 电泳鉴定 溶液溶液: 50 mmol/L 葡萄糖葡萄糖 10mmol/L EDTA 25mmol/L Tris-HCl pH8.0 溶液溶液II(新鲜配制)
2、(新鲜配制): 1mol/L NaOH 200 l 10% SDS 100 l H2O 700 l 溶液溶液 III : 29.4g Kac 11.5ml冰醋酸冰醋酸 加水至加水至100ml 实验流程实验流程 1.细菌于细菌于LB培养基中培养过夜,分装(培养基中培养过夜,分装(1ml/支),支),4000rpm离心离心 2min,弃上清。,弃上清。 2.沉淀重悬于沉淀重悬于100 l溶液溶液中中, 震荡震荡混匀。混匀。 3.加入加入200 l新鲜配制新鲜配制的溶液的溶液,轻轻颠倒轻轻颠倒混匀混匀(不能超过不能超过5min)。)。 4.立即加入立即加入150 l溶液溶液,轻轻颠倒轻轻颠倒混匀,冰
3、浴混匀,冰浴5min,12000rpm 离心离心10min。 5.上清移至另一干净上清移至另一干净EP管中,加入管中,加入等体积饱和酚等体积饱和酚,颠倒颠倒混匀,混匀, 12000rpm 离心离心10min。 6.上清移至另一干净上清移至另一干净EP管中,加入管中,加入等体积酚等体积酚/氯仿氯仿,颠倒颠倒混匀,混匀, 12000rpm离心离心10min。 7.上清移至另一干净上清移至另一干净EP管中,加入管中,加入2倍体积冷无水乙醇倍体积冷无水乙醇混匀,静混匀,静 置置5min,12000rpm离心离心10min。 8.弃上清,用弃上清,用0.5ml 70% 乙醇洗涤乙醇洗涤DNA,12000rpm离心离心5min弃上弃上 清,倒置干燥。清,倒置干燥。 9.加入加入10 l TE,1%琼脂糖凝胶电泳观察。琼脂糖凝胶电泳观察。 核酸的定量核酸的定量 260 nm, 1OD值相当于:值相当于: 双链双链DNA浓度为浓度为50 g/ml 单链单链DNA浓度为浓度为40 g/ml A260/A280 = 1.8(DNA) A260/A280 = 2.0(RNA)