1、小鼠肝组织小鼠肝组织RNA提取及提取及 RT-PCR 一、试剂及材料一、试剂及材料 1、小鼠肝脏、小鼠肝脏 2、DEPC处理过的处理过的EP管、管、PCR管管 3、 Trizol 、氯仿、异丙醇、氯仿、异丙醇、DEPC水水 二、实验原理二、实验原理 TRIZOL：异硫氰酸胍：异硫氰酸胍 + 苯酚苯酚 裂解细胞，RNA与蛋 白质分离，将RNA释 放到溶液中。 促使RNA进入水相， 离心后可形成水相 层和有机层。 RNA与仍留在有机相中的蛋白质和与仍留在有机相中的蛋白质和DNA分离开。分离开。 水相层（无色）主要为水相层（无色）主要为RNA，有机层（黄色），有机层（黄色） 主要为主要为DNA和蛋白
2、质。和蛋白质。 三、实验步骤三、实验步骤 RNA提取提取 1、新鲜肝组织置、新鲜肝组织置EP管中，加管中，加200 l Trizol充分研磨后，补加充分研磨后，补加 800 l Trizol，枪头吹匀。，枪头吹匀。 2、加入、加入200 l 氯仿，剧烈震荡氯仿，剧烈震荡15秒，秒，4 12000g离心离心15min。 3、将上层水相移至洁净、将上层水相移至洁净EP管中，加入管中，加入500 l异丙醇颠倒混匀。异丙醇颠倒混匀。 4、4 12000g离心离心10min。 5、弃水相，、弃水相，EP管开盖干燥，溶于管开盖干燥，溶于50 l DEPC水中。水中。 RT-PCR：RNA的反转录的反转录
3、+ cDNA的的PCR RT-PCR操作步骤操作步骤 5x Prime Script Buffer 2 l Prime Script RT Enzyme Mix 0.5 l Oligo dT primer (50 m) 0.5 l Random 6 mers (100 m) 1 l 提取的提取的RNA 0.5 l RNase Free 水水 5.5 l 37 15min 85 5 sec 10 l PCR 10x PCR Buffer 5 l dNTP 4 l 模板模板DNA 2 l 引物引物1 2 l 引物引物2 2 l Taq 酶酶 0.5 l H2O 34.5 l 50 l 94 5 min 94 30 sec 54 30 sec 72 30 sec 72 7 min 25 cycle 1%琼脂糖凝胶电泳观察结果琼脂糖凝胶电泳观察结果 D2000 mark 2l DNA染料 2l loading buffer 10l PCR产物 or Mark 混匀 上样10l
