1、质粒质粒DNA的提取及鉴定的提取及鉴定 生物化学与分子生物学系生物化学与分子生物学系 实验目的实验目的 掌握质粒掌握质粒DNA制备的原理和方法制备的原理和方法 了解质粒琼脂糖凝胶电泳分离了解质粒琼脂糖凝胶电泳分离 Bacterial DNA Plasmids 质粒质粒 实验原理实验原理 细菌悬浮液暴露于阴离子去污剂(细菌悬浮液暴露于阴离子去污剂(SDS) 细胞壁破裂,染色体细胞壁破裂,染色体DNA和蛋白质变性和蛋白质变性 相互缠绕成复合物被相互缠绕成复合物被SDS包裹,当用包裹,当用K+取代取代 Na+时,复合物从溶液中沉淀下来。时,复合物从溶液中沉淀下来。 离心后可从上清中回收质粒离心后可从
2、上清中回收质粒DNA 试试 剂剂 溶液溶液:50 mmol/L葡萄糖、葡萄糖、10mmol/L EDTA、 25mmol Tris-HCl pH8.0 溶液溶液II(新鲜配制)(新鲜配制): 1mol/L NaOH 200 l、 10% SDS 100 l、H2O 700 l 溶液溶液 III : 29.4g KAc、11.5ml冰醋酸、加水至冰醋酸、加水至 100ml 实验流程实验流程 细菌于细菌于LB培养基中培养过夜,分装(培养基中培养过夜,分装(1ml/ 支),支),4000rpm离心离心2min,弃上清。,弃上清。 沉淀重悬于沉淀重悬于100 l溶液溶液中中, 震荡震荡混匀。混匀。 加
3、入加入200 l新鲜配制新鲜配制的溶液的溶液,颠倒颠倒混匀。混匀。 加入加入150 l溶液溶液,颠倒颠倒混匀,冰浴混匀,冰浴5min, 12000rpm离心离心10min。 上清移至另一干净上清移至另一干净EP管中,加入管中,加入等体积饱和等体积饱和 酚酚(约(约450 l),颠倒混匀,),颠倒混匀,12000rpm 离心离心 10min。 实验流程实验流程 上清移至另一干净上清移至另一干净EP管中,加入管中,加入等体积酚等体积酚/氯氯 仿仿,颠倒颠倒混匀,混匀,12000rpm离心离心10min。 上清移至另一干净上清移至另一干净EP管中,加入管中,加入2倍体积冷无倍体积冷无 水乙醇水乙醇混匀,静置混匀,静置5min,12000rpm离心离心10min。 弃上清,用弃上清,用0.5ml 70% 乙醇洗涤乙醇洗涤DNA,弃上清,弃上清, 倒置干燥。倒置干燥。 加入加入10 l TE,1%琼脂糖凝胶电泳观察。琼脂糖凝胶电泳观察。 核酸的定量核酸的定量 260 nm, 1OD值相当于:值相当于: 双链双链DNA浓度为浓度为50 g/ml 单链单链DNA浓度为浓度为40 g/ml A260/A280 = 1.8(DNA) A260/A280 = 2.0(RNA)