1、目的要求：目的要求：一、掌握培养基的种类及其特点一、掌握培养基的种类及其特点三、掌握培养基的组成和其适宜剂量三、掌握培养基的组成和其适宜剂量二、掌握二、掌握MSMS培养基配制培养基配制四、理解培养基筛选方法四、理解培养基筛选方法第一页，共56页。第一节第一节 培养基的种类和成分培养基的种类和成分 一、培养基种类一、培养基种类 二、培养基成分二、培养基成分 第二节第二节 培养基制备培养基制备 一、母液配制和保存一、母液配制和保存 二、培养基配制、分装和灭菌二、培养基配制、分装和灭菌 第三节第三节 培养基的选择培养基的选择 一、单因子试验一、单因子试验 二、多因子试验二、多因子试验 三、逐步增减法
2、三、逐步增减法 四、广谱实验法四、广谱实验法第二页，共56页。一、培养基的种类一、培养基的种类 1 1、根据其态相不同、根据其态相不同分为固体培养基与液体培养分为固体培养基与液体培养基。基。固体培养基固体培养基是指加凝固剂的培养基。是指加凝固剂的培养基。培养基中加入一定量的凝固剂，加热溶解后，培养基中加入一定量的凝固剂，加热溶解后，分别装入常用的培养容器中冷却后即得到固体培养分别装入常用的培养容器中冷却后即得到固体培养基。基。液体培养基液体培养基是指不加凝固剂的培养基。是指不加凝固剂的培养基。第三页，共56页。培养基种类培养基种类 固体培养基固体培养基 液体培养基液体培养基营养分布均匀，生长营
3、养分布均匀，生长整齐一致，但通气性整齐一致，但通气性差。差。通气性较好，便于操作，通气性较好，便于操作，但营养分布不均，生长但营养分布不均，生长发育不整齐。发育不整齐。二者比较二者比较第四页，共56页。2、根据培养物的培养过程、根据培养物的培养过程 培养基分为：培养基分为：初代培养基初代培养基和和继代培养基继代培养基 外植体：从植物体上取出的用于无菌培养的植物外植体：从植物体上取出的用于无菌培养的植物材料。材料。植物材料：茎尖、茎段、花瓣、叶子、花药等植物材料：茎尖、茎段、花瓣、叶子、花药等 第五页，共56页。初代培养初代培养：指用来第一次接种从植物体上指用来第一次接种从植物体上分离下来的外植
4、体过程分离下来的外植体过程。继代培养：继代培养：对培养物(包括细胞、组织或其切段)通过更换新鲜培养基及不断切割或分离，进行连续多代的培养，就称为继代培养。第六页，共56页。3 3、根据其作用不同，培养基分为：、根据其作用不同，培养基分为：诱导培养基诱导培养基 增殖培养基增殖培养基 生根培养基生根培养基 4 4、根据其营养水平不同，培养基可分为基本培养基、根据其营养水平不同，培养基可分为基本培养基和完全培养基。和完全培养基。基本培养基基本培养基（就是通常称呼的培养基）主要有（就是通常称呼的培养基）主要有MSMS、WhiteWhite、N6 N6、B5 B5、改良改良MSMS、HellerHell
5、er、NitshNitsh、SHSH、Miller Miller等。等。完全培养基完全培养基就是基本培养基的基础上，根据试验的不就是基本培养基的基础上，根据试验的不同需要，附加一些物质，如生长调节物质和其他复杂有机物同需要，附加一些物质，如生长调节物质和其他复杂有机物质等。质等。第七页，共56页。常用培养基种类常用培养基种类 MSMS培养基培养基 B B5 5培养基培养基WhiteWhite培养基培养基 N N6 6培养基培养基KM-8PKM-8P培养基培养基第八页，共56页。有机成分复杂，它包括了所有的单糖和维生素有机成分复杂，它包括了所有的单糖和维生素 用于原生质体培养用于原生质体培养(包
6、括原生质融合的培养包括原生质融合的培养)KM-8PKM-8P培养基特点：培养基特点：第九页，共56页。N N6 6培养基特点：培养基特点：19741974年朱至清等为水稻等禾谷类作物花年朱至清等为水稻等禾谷类作物花药培养而设计药培养而设计 成分简单成分简单 KNOKNO3 3 和和(NHNH4 4)2 2SOSO4 4含量高含量高 广泛应用于小麦、水稻及其它植物的花广泛应用于小麦、水稻及其它植物的花药培养等药培养等 第十页，共56页。White培养基特点：培养基特点：1943年由年由hite为培养番茄根尖而设计的。为培养番茄根尖而设计的。1963年又作了改良，称作年又作了改良，称作hite改良
7、培养改良培养基基。特点：无机盐含量较低特点：无机盐含量较低 适用：生根培养。适用：生根培养。第十一页，共56页。B B5 5培养基特点：培养基特点：含较低的铵含较低的铵 双子叶植物双子叶植物 尤其木本植物组培尤其木本植物组培可选择可选择 第十二页，共56页。MSMS培养基特点：培养基特点：无机盐、离子浓度高，硝酸盐无机盐、离子浓度高，硝酸盐含量较高含量较高。MSMS培养基是目前应用最多最普遍的培养基。无机盐的浓度较高培养基是目前应用最多最普遍的培养基。无机盐的浓度较高，能保证组织培生长所需的矿物质营养。并且因为离子浓度高，能保证组织培生长所需的矿物质营养。并且因为离子浓度高，在配制、贮存、消毒
8、过程中，即使有些成分略有出入，也不，在配制、贮存、消毒过程中，即使有些成分略有出入，也不致影响培养基中的离子平衡致影响培养基中的离子平衡 第十三页，共56页。二、二、培养基成分培养基成分 水水 植物激素植物激素 无机盐无机盐 有机物有机物培养体支持材料培养体支持材料 辅助性物质辅助性物质第十四页，共56页。一、无一、无 机机 盐盐 氮 枝叶生长需要氮素，缺氮老叶先发黄；氮过量，枝叶过度茂盛。磷 缺磷，植株生长缓慢，老叶暗紫色。钾 促进花卉生长健壮，增强抗性，茎秆挺拔。缺钾，叶尖、叶缘枯焦，叶片呈皱曲状，老叶发黄或火烧状。钴 缺钴，叶片失绿而卷曲，整个叶片向上弯曲凋枯。第十五页，共56页。二、二
9、、有有机机物物维生素维生素肌醇肌醇氨基酸氨基酸天然复合物天然复合物椰子汁（椰子汁（CM）酵母浸出液（酵母浸出液（YE)水解酪蛋白（水解酪蛋白（CH)碳水化合物碳水化合物马铃薯汁液马铃薯汁液其它其它第十六页，共56页。碳水化合物碳水化合物 选用种类：蔗糖（或葡萄糖、果糖）等选用种类：蔗糖（或葡萄糖、果糖）等 蔗糖浓度：蔗糖浓度：2 2%3%3%，胚培养为，胚培养为4 4%15%15%大生产时可用白糖大生产时可用白糖第十七页，共56页。糖在培养基的作用：糖在培养基的作用：1 1）为细胞提供合成新物质的碳骨架）为细胞提供合成新物质的碳骨架 2 2）为细胞的呼吸代谢提供底物和能量）为细胞的呼吸代谢提供
10、底物和能量 3 3）维持渗透压）维持渗透压第十八页，共56页。种类：种类：VBVB1 1（盐酸硫胺素）、（盐酸硫胺素）、VBVB6 6（盐酸吡哆醇）、（盐酸吡哆醇）、VBVB3 3（烟酸）、（烟酸）、VcVc（抗坏血酸（抗坏血酸 浓度：浓度：0.10.11.01.0mg/L mg/L 作用：作用：VBVB1 1 促愈伤组织产生，提高活力促愈伤组织产生，提高活力VBVB6 6 促根生长促根生长 VcVc 防组织褐变防组织褐变 VBVB3 3 与植物代谢和胚的发育有关系与植物代谢和胚的发育有关系 维生素维生素第十九页，共56页。氨基酸氨基酸：甘氨酸、精氨酸、谷氨酸、谷氨酰胺、天冬氨酸、：甘氨酸、精
11、氨酸、谷氨酸、谷氨酰胺、天冬氨酸、天冬酰胺、丙氨酸等等。因培养基的种类不同，其种类和天冬酰胺、丙氨酸等等。因培养基的种类不同，其种类和浓度不同。浓度不同。肌醇肌醇：又称环己六醇，在糖类的转化中起作用：又称环己六醇，在糖类的转化中起作用 第二十页，共56页。名称名称分子量分子量溶解性质溶解性质性质性质蔗糖蔗糖342.30342.30溶于水、乙醇溶于水、乙醇无变旋现象无变旋现象山梨糖山梨糖180.16180.16溶于水溶于水甜味与蔗糖相似甜味与蔗糖相似葡萄糖葡萄糖180.16180.16溶于水溶于水有变旋现象，以游离态或磷酯有变旋现象，以游离态或磷酯形式存在形式存在果糖果糖180.16180.16
12、溶于水、乙醇溶于水、乙醇有变旋现象，甜度高于蔗糖有变旋现象，甜度高于蔗糖盐酸硫胺素（盐酸硫胺素（VB1VB1）337.28337.28溶于水、乙醇、甘溶于水、乙醇、甘油油受高温影响小，可高温消毒受高温影响小，可高温消毒核黄素（核黄素（VB2VB2）376.37376.37溶于无水乙醇、微溶于无水乙醇、微溶于水溶于水等电点等电点PH=6.0PH=6.0，碱性溶液中易碱性溶液中易变质，光能加速变质变质，光能加速变质盐酸吡哆素（盐酸吡哆素（VB6VB6）205.64205.64溶于水、乙醇溶于水、乙醇对光、空气、热稳定是转氨酶对光、空气、热稳定是转氨酶的辅酶的辅酶钴胺素（钴胺素（VB12VB12）1
13、355.421355.42溶于水、乙醇溶于水、乙醇受高温影响小，可高温消毒，受高温影响小，可高温消毒，参与丝氨酸转变为甘氨酸过程参与丝氨酸转变为甘氨酸过程烟酸（烟酸（VPPVPP）123.11123.11极易溶于水、乙醇极易溶于水、乙醇对空气、光、热、对空气、光、热、PHPH值稳定值稳定生物素（生物素（VHVH）244.31244.31溶于水、乙醇溶于水、乙醇对空气温度稳定对空气温度稳定叶酸（叶酸（VMVM）441.40441.40易溶于乙酸、易溶于乙酸、NaOHNaOH、微溶于水微溶于水参与生物甲基化作用参与生物甲基化作用抗坏血酸（抗坏血酸（VCVC）176.12176.12极易溶于水极易溶
14、于水有较强的还原能力，可做抗氧有较强的还原能力，可做抗氧化剂用，参与酪氨酸代谢及色化剂用，参与酪氨酸代谢及色氨酸的羟基化作用氨酸的羟基化作用肌醇肌醇180.16180.16易溶于水易溶于水植物中广泛存在，可能与植物中广泛存在，可能与IAAIAA的代谢有关的代谢有关 常见糖和维生素及其主要性质常见糖和维生素及其主要性质第二十一页，共56页。椰乳椰乳：促愈伤组织和细胞培养，用量促愈伤组织和细胞培养，用量101020%20%，使用注意茎尖大小使用注意茎尖大小香蕉泥香蕉泥：用量用量150150 200 200ml/L ml/L，应用在兰花组培应用在兰花组培马铃薯汁液马铃薯汁液：用量用量15015020
15、0200g/Lg/L，使苗壮使苗壮水解酪蛋白水解酪蛋白：浓度浓度100100200200mg/Lmg/L，应用在微茎尖应用在微茎尖培养培养天然复合物天然复合物第二十二页，共56页。自然界中，植物激素是植物新陈代谢中产生的天然化合物，它能自然界中，植物激素是植物新陈代谢中产生的天然化合物，它能以极微小的量影响到植物的细胞分化、生长、发育，影响到植物的形以极微小的量影响到植物的细胞分化、生长、发育，影响到植物的形态建成、开花、结实、成熟、脱落、衰老和休眠、萌发等许多生理生态建成、开花、结实、成熟、脱落、衰老和休眠、萌发等许多生理生化活动。化活动。在培养基中，其各种成分对培养物影响最大的最显著的就是
16、激素。在培养基中，其各种成分对培养物影响最大的最显著的就是激素。激素的种类、浓度、以及配比都会显著的影响愈伤组织的形成、不定激素的种类、浓度、以及配比都会显著的影响愈伤组织的形成、不定根、不定芽的分化，胚状体的形成等。根、不定芽的分化，胚状体的形成等。通常，不同植物，或不同品种，甚至同一植物的不同位置对激素的要通常，不同植物，或不同品种，甚至同一植物的不同位置对激素的要求有很大的变化，这主要取决于植物的内源激素水平。求有很大的变化，这主要取决于植物的内源激素水平。组织培养中使用的激素有的是天然的，如脱落酸（组织培养中使用的激素有的是天然的，如脱落酸（ABAABA）等，有的是合成等，有的是合成的
17、，如二氯苯氧乙酸（的，如二氯苯氧乙酸（2 2，4 4D D）三、激素三、激素第二十三页，共56页。（一）、激素的种类：（一）、激素的种类：1 1、生长素类：、生长素类：在自然界中，生长素影响茎和节间的伸长、在自然界中，生长素影响茎和节间的伸长、向性、顶端优势、叶片脱落和生根等现象向性、顶端优势、叶片脱落和生根等现象 在组织培养中的主要作用是：诱导细胞的分裂在组织培养中的主要作用是：诱导细胞的分裂和根的分化，诱导愈伤组织）和根的分化，诱导愈伤组织）第二十四页，共56页。组织培养中常用的生长素：组织培养中常用的生长素：1 二氯苯氧乙酸（二氯苯氧乙酸（2 2，4 4D D）2 2 萘乙酸（萘乙酸（N
18、AANAA）3 3 吲哚乙酸（吲哚乙酸（IAAIAA）4 4 吲哚吲哚3 3丁酸（丁酸（IBAIBA）NAA NAA、IAAIAA、IBAIBA被广泛用于生根，被广泛用于生根，2 2，4 4D D有利于有利于愈伤组织的诱导和生长。愈伤组织的诱导和生长。IAAIAA容易光解，注意用棕色试剂瓶保存，保存时容易光解，注意用棕色试剂瓶保存，保存时间不要太久。间不要太久。溶解方法：溶解方法：1 1M NaOHM NaOH或或9595酒精，以前者为好酒精，以前者为好 保存：配成一定浓度后，冰箱冷藏保存保存：配成一定浓度后，冰箱冷藏保存第二十五页，共56页。2 2、细胞分裂素、细胞分裂素 自然界中，细胞分裂
19、素影响细胞分裂，顶端优势的变化和茎的分自然界中，细胞分裂素影响细胞分裂，顶端优势的变化和茎的分化等化等 组织培养中，细胞分类素主要促进细胞分裂和由愈伤组织上或器官上分组织培养中，细胞分类素主要促进细胞分裂和由愈伤组织上或器官上分化不定芽化不定芽。细胞分裂素常常与生长素相互配合，用以调节细胞分裂，。细胞分裂素常常与生长素相互配合，用以调节细胞分裂，细胞伸长，细胞分化和器官形成。细胞伸长，细胞分化和器官形成。常用的细胞分裂素有：常用的细胞分裂素有：6 6苄氨基嘌呤（苄氨基嘌呤（6 6BABA）激动素（激动素（6-6-糠氨基嘌呤、糠氨基嘌呤、KTKT）玉米素（玉米素（ZTZT）噻二唑苯基脲（噻二唑苯
20、基脲（thidiazuronthidiazuron、TDZ TDZ）溶解方法：溶解方法：1 1MHCL MHCL 保存：配成一定浓度后，冰箱冷藏保存保存：配成一定浓度后，冰箱冷藏保存第二十六页，共56页。3 3、赤霉素、赤霉素 由由 人黑泽人黑泽19261926年发现。自然界中，赤霉素能够打破休眠、促进果实成年发现。自然界中，赤霉素能够打破休眠、促进果实成长等效果。虽然已经用于顶端分生组织的培养和维管分化的研究，但在培养长等效果。虽然已经用于顶端分生组织的培养和维管分化的研究，但在培养基中很少添加，因为它的作用往往是负面的。虽然也有赤霉素能刺激不定胚基中很少添加，因为它的作用往往是负面的。虽然
21、也有赤霉素能刺激不定胚发育成正常小植株的报道，但在使用中仍需慎重，不可轻易添加。发育成正常小植株的报道，但在使用中仍需慎重，不可轻易添加。赤霉素有赤霉素有2020多种，其中在组织培养中最常用的是多种，其中在组织培养中最常用的是GA3GA3。在组织培养中。在组织培养中与生长素和细胞分裂素相比，赤霉素不太常用，据报道赤霉素能刺激不与生长素和细胞分裂素相比，赤霉素不太常用，据报道赤霉素能刺激不定胚正常发育成小植株定胚正常发育成小植株 溶解方法：溶解方法：9595酒精酒精 保存：配成一定浓度后，冰箱冷藏保存保存：配成一定浓度后，冰箱冷藏保存 赤霉素易溶于水，但溶于水后不稳定，容易分解赤霉素易溶于水，但
22、溶于水后不稳定，容易分解 灭菌：高温易分解，要过滤灭菌灭菌：高温易分解，要过滤灭菌第二十七页，共56页。4 4、脱落酸、脱落酸 在自然界中，脱落酸能阻碍发育、促进老化、在自然界中，脱落酸能阻碍发育、促进老化、形成休眠芽等作用。形成休眠芽等作用。经试验表明，脱落酸有利于胚性愈伤组织形成经试验表明，脱落酸有利于胚性愈伤组织形成正常不定芽。正常不定芽。材料的试管保存，加上脱落酸能抑制生长，使继代培材料的试管保存，加上脱落酸能抑制生长，使继代培养时间延长。养时间延长。溶解：易溶于溶解：易溶于NaHCONaHCO3 3溶液、氯仿或丙酮。溶液、氯仿或丙酮。保存：具有热稳定性，但容易发生光解。保存：具有热稳
23、定性，但容易发生光解。配成一定浓度后，冰箱冷藏保存配成一定浓度后，冰箱冷藏保存第二十八页，共56页。第二节 培养基配制一、单因子试验 二、多因子试验第三十二页，共56页。溶解方法：95酒精（一）、激素的种类：高低 高中 高高2 对每一类物质再选定3个浓度，既：低（L)、中（M）和高（H）、4类物质各3种浓度的各种不同组合构成了一项包括81个处理的试验。保存：配成一定浓度后，冰箱冷藏保存对光、空气、热稳定是转氨酶的辅酶常见糖和维生素及其主要性质第五十二页，共56页。对生长的刺激：其吸附了有抑制作用的物质第二节 培养基配制三、掌握培养基的组成和其适宜剂量要求封口松紧适宜，系活扣，便于接种操作。2
24、当进行营养需要研究时，应注意不要使用琼脂，因为市场供应所有琼脂含有杂质，特别是含有Ca,Mg和微量元素。第三十八页，共56页。第二十五页，共56页。A B CVB3 与植物代谢和胚的发育有关系（二）、常见培养基中植物激素配方类型（二）、常见培养基中植物激素配方类型激激 素素 配配 方方 再生方式及用途再生方式及用途1.1.无植物激素无植物激素诱导生根、无性胚、愈伤组织形成诱导生根、无性胚、愈伤组织形成2.2.单加生长素单加生长素诱导生根、愈伤组织、无性胚、不定芽诱导生根、愈伤组织、无性胚、不定芽3.3.单加细胞分裂素单加细胞分裂素诱导不定芽、侧芽增殖、愈伤组织形成诱导不定芽、侧芽增殖、愈伤组织
25、形成4.4.高生长素低细胞分裂素高生长素低细胞分裂素诱导芽、原球茎增殖、愈伤组织形成诱导芽、原球茎增殖、愈伤组织形成5.5.低生长素高细胞分裂素低生长素高细胞分裂素诱导丛芽、愈伤组织形成诱导丛芽、愈伤组织形成6.6.低生长素低细胞分裂素低生长素低细胞分裂素诱导不定芽、侧芽增殖诱导不定芽、侧芽增殖7.7.等量生长素与细胞分裂素等量生长素与细胞分裂素诱导侧芽增殖诱导侧芽增殖8.8.加生长抑制剂（多效唑、矮壮素等）加生长抑制剂（多效唑、矮壮素等）壮苗、延缓生长、利于试管苗保存壮苗、延缓生长、利于试管苗保存9.9.加加GA3GA3打破种子、芽休眠，促进伸长生长打破种子、芽休眠，促进伸长生长第二十九页，
26、共56页。名称名称 分子量分子量 溶解性质溶解性质 主要作用主要作用吲哚乙酸吲哚乙酸（IAAIAA）175.19175.19易溶于热水、乙醇、易溶于热水、乙醇、乙醚、丙酮乙醚、丙酮促进细胞的延伸生促进细胞的延伸生长和细胞壁结构的长和细胞壁结构的松驰，也可用于诱松驰，也可用于诱导生根导生根 吲哚丁酸吲哚丁酸 (IBA)IBA)203.24203.24溶于醇、丙酮、醚稀溶于醇、丙酮、醚稀碱、稀酸液碱、稀酸液为生根刺激剂为生根刺激剂 a-a-萘乙酸萘乙酸 (NAA)NAA)186.20 186.20 易溶于热水、丙酮、易溶于热水、丙酮、醚、乙酸、稀碱液醚、乙酸、稀碱液促进细胞生长，刺促进细胞生长，刺
27、激生根激生根2,4-2,4-二氯苯二氯苯氧乙酸氧乙酸(2,4-(2,4-D)D)221.04221.04易溶于醇、丙酮、乙易溶于醇、丙酮、乙醇、稀碱液醇、稀碱液促进愈伤组织形成促进愈伤组织形成 赤霉酸赤霉酸(GA3)GA3)346.38346.38易溶于醇、乙酸乙酯、易溶于醇、乙酸乙酯、碳酸氢钠和醋酸钠的碳酸氢钠和醋酸钠的水溶液，其钠水溶液，其钠促进茎、叶伸长生促进茎、叶伸长生长，打破休眠长，打破休眠 （三）、常见生长调节剂及主要性能一览表（三）、常见生长调节剂及主要性能一览表第三十页，共56页。（四）、常见生长调节剂的微摩尔（四）、常见生长调节剂的微摩尔/升浓度与毫克升浓度与毫克/升的换升的
28、换微摩微摩尔尔/升升毫克毫克/升升IAAIAAIBAIBANAANAA2,4-2,4-D DKTKTBABA2 2iPiPZTZTTDZTDZGA3GA31 10.1750.1750.2030.2032 20.1860.1862 20.22100.22100.21520.22530.22530.20270.20270.21900.21900.22020.22020.34640.34642 20.35040.35040.4060.4064 40.3720.3724 40.44210.44210.43040.43040.45050.45050.40540.40540.43800.43800.440
29、40.44040.69270.69273 30.52550.52550.6090.6094 40.5580.5586 60.66310.66310.64560.64560.67580.67580.60810.60810.65700.65700.66060.66061.03911.03914 40.70070.70070.8120.8128 80.7440.7448 80.88420.88420.86080.86080.90100.90100.81080.81080.87600.87600.88080.88081.38551.38555 50.87590.87591.0161.0160 00.9
30、310.9310 01.10521.10521.07611.07611.12631.12631.01351.01351.09501.09501.10101.10101.73191.73196 61.05111.05111.2191.2192 21.1171.1172 21.32621.32621.29131.29131.35161.35161.21621.21621.31401.31401.32121.32122.07822.07827 71.22631.22631.4221.4224 41.3031.3034 41.54731.54731.50651.50651.57681.57681.41
31、891.41891.53301.53301.54141.54142.42462.42468 81.40141.40141.6251.6256 61.4891.4896 61.76831.76831.72171.72171.80211.80211.62161.62161.75201.75201.76161.76162.77102.77109 91.57661.57661.8281.8288 81.6751.6758 81.98941.98941.93691.93692.02732.02731.82431.82431.97101.97101.98181.98183.11733.1173第三十一页，
32、共56页。四、培养体支持材料四、培养体支持材料 1.1.琼脂琼脂 用量用量7 71010g/Lg/L（0.7%-1%0.7%-1%）注意：注意：1 1 若浓度过高，培养基就会变得很硬，营养物质就难于扩散到培若浓度过高，培养基就会变得很硬，营养物质就难于扩散到培养的组织中。养的组织中。2 2 当进行营养需要研究时，应注意不要使用琼脂，因为市场供当进行营养需要研究时，应注意不要使用琼脂，因为市场供应所有琼脂含有杂质，特别是含有应所有琼脂含有杂质，特别是含有Ca,MgCa,Mg和微量元素。和微量元素。2.2.其它其它 卡拉胶、玻璃纤维、滤纸桥、海绵卡拉胶、玻璃纤维、滤纸桥、海绵等等第三十二页，共56
33、页。五、辅助性物质五、辅助性物质 1.1.抗生素抗生素 2.2.抗氧化物抗氧化物 3.3.活性炭活性炭第三十三页，共56页。抗生素抗生素1.1.常用种类：青霉素链霉素常用种类：青霉素链霉素 庆大霉素等庆大霉素等2.2.用量：用量：5 5%20%20%3.3.作用：防止由外植体内生菌造成的作用：防止由外植体内生菌造成的污染。污染。4 4 过滤灭菌过滤灭菌 第三十四页，共56页。抗氧化物抗氧化物常用抗氧化剂及使用：常用抗氧化剂及使用：半胱氨酸半胱氨酸VCVC（5050200mg/L200mg/L液洗涤外植体伤口表液洗涤外植体伤口表面）。面）。活性炭活性炭1.1.作用：作用：具吸附作用；茎尖初代培养
34、可防褐化；促进新具吸附作用；茎尖初代培养可防褐化；促进新梢增殖（浓度梢增殖（浓度0.1 0.1 0.2%0.2%）；促进生根；防止组培苗玻璃）；促进生根；防止组培苗玻璃化（浓度化（浓度0.3%0.3%）。利于胚胎培养。）。利于胚胎培养。2.2.常用浓度：常用浓度：0.50.51010g/Lg/L3.3.活性炭的作用活性炭的作用 对生长的抑制：其吸附了植物激素对生长的抑制：其吸附了植物激素 对生长的刺激：其吸附了有抑制作用的物质对生长的刺激：其吸附了有抑制作用的物质第三十五页，共56页。第二节第二节 培养基配制培养基配制一、母液配制与保存一、母液配制与保存二、培养基配制二、培养基配制第三十六页，
35、共56页。(一一)母液配制流程图母液配制流程图 称称 量量 母液分装母液分装确定培养基确定培养基 溶溶 解解 定定 容容 贴标签贴标签保存于冰箱保存于冰箱一、母液配制一、母液配制(以以MS为例为例)第三十七页，共56页。称量药品称量药品 天平预置天平预置全显示全显示清清 零零称称 药药第三十八页，共56页。(二二)母液配制要求：母液配制要求：1.1.母液浓缩倍数母液浓缩倍数：10-100 10-100，大量元素大量元素1010；微量元素、；微量元素、铁盐铁盐100100；有机物；有机物5050；2.2.选用蒸馏水、重蒸馏水、分析纯或化学纯试剂选用蒸馏水、重蒸馏水、分析纯或化学纯试剂 3.3.防
36、止沉淀防止沉淀 4.4.激素母液浓度：激素母液浓度：1 1mg/ml,1mg/ml,1次配成次配成5050或或100 100 mlml 5.5.激素溶解：激素溶解：IAAIAA、IBAIBA、GAGA、ZTZT先溶先溶95%95%酒精再定容；酒精再定容；NAANAA先溶于热水或先溶于热水或95%95%酒精再加水；酒精再加水；2 2，4-4-D D先溶于先溶于1 1M NaOHM NaOH再加水；再加水；KTKT、BABA先溶于先溶于1 1M HClM HCl再加水。再加水。第三十九页，共56页。为什么要配制母液？为什么要配制母液？1 1）方便）方便 2 2）准确（有些成分量太小）准确（有些成分
37、量太小）3 3）母液要分类配，）母液要分类配，否则有些成分混合一起会产生沉淀否则有些成分混合一起会产生沉淀 以以MSMS培养基为例：培养基为例：第四十页，共56页。MS培养基母液的配制培养基母液的配制第四十一页，共56页。母液保存：母液保存：在冰箱内在冰箱内低温保存低温保存第四十二页，共56页。二、培养基配制二、培养基配制移母液移母液调调PH值值培养基熬制培养基熬制灭菌灭菌称取蔗糖、琼脂称取蔗糖、琼脂扎口扎口定容定容分装分装二次定容二次定容接种接种确定配方确定配方第四十三页，共56页。大量元素母液大量元素母液 微量元素母液微量元素母液 铁铁 盐母液盐母液 有机物母液有机物母液 取100ml取1
38、0ml取10ml取10ml注：注：MSMS培养基配制培养基配制容量瓶容量瓶要求：要求：一次性移取，不能吸一次性移取，不能吸进吸气球里，数量看准，不进吸气球里，数量看准，不滴不漏，吹净为度。滴不漏，吹净为度。移母液移母液第四十四页，共56页。用自来水定容至用自来水定容至1升升定定 容：容：第四十五页，共56页。称取蔗糖、琼脂用自来水定容到用自来水定容到1 1升升取蔗糖取蔗糖25253030g g，琼脂琼脂7 78 8g g。第四十六页，共56页。培养基熬制培养基熬制：3.3.将容量瓶中剩余的液体一将容量瓶中剩余的液体一并倒入铝锅中，摇晃使均匀并倒入铝锅中，摇晃使均匀。1.1.将定容好的培养液取将
39、定容好的培养液取1/31/3倒倒入铝锅中，同时加入称好的入铝锅中，同时加入称好的蔗糖和琼脂，边煮边搅拌，蔗糖和琼脂，边煮边搅拌，防止糊底。防止糊底。2.2.用旺火煮开，再用文火加用旺火煮开，再用文火加热，直至琼脂全部融化。热，直至琼脂全部融化。第四十七页，共56页。用用0.10.1MNaOHMNaOH或或HClHCl调调PHPH值为值为6.06.0。调调PHPH值：值：第四十八页，共56页。分装：分装：趁热分装，趁热分装，100ml的三角瓶约装入的三角瓶约装入3040ml。第四十九页，共56页。扎口与灭菌扎口与灭菌:要求封口松紧适宜，系要求封口松紧适宜，系活扣，便于接种操作。活扣，便于接种操作
40、。培养基应及时灭菌，培养基应及时灭菌，防止变质防止变质。第五十页，共56页。灭菌后，应尽快地转移培养瓶使其冷却，灭菌后，应尽快地转移培养瓶使其冷却，一般应将灭菌后的培养基储藏于一般应将灭菌后的培养基储藏于3030以下的以下的室内名，最好储藏在室内名，最好储藏在4 41010的条件下。的条件下。应当注意的是，某些生长调节物质如应当注意的是，某些生长调节物质如IAAIAA、ZTZT、ABAABA等以及某些维生素是不稳定的，不能等以及某些维生素是不稳定的，不能和其他的培养基一起高压灭菌，而要进行过滤和其他的培养基一起高压灭菌，而要进行过滤灭菌。灭菌。第五十一页，共56页。第三节培养基的选择第三节培养
41、基的选择一、单因子试验一、单因子试验二、多因子试验二、多因子试验三、逐步增减法三、逐步增减法四、广谱试验法四、广谱试验法第五十二页，共56页。2 2种激素种激素5 5种浓度的实验组合种浓度的实验组合 6BA（mg/L)A1 A2 A3 A4 A5 NAA（mg/L)B1B2 B4 B3B5B1A1 B1A2 B1A3 B1A4 B1A5B2A1 B2A2 B2A3 B2A4 B2A5B3A1 B3A2 B3A3 B3A4 B3A5B4A1 B4A2 B4A3 B4A4 B4A5B5A1 B5A2 B5A3 B5A4 B5A5第五十三页，共56页。2 2种激素种激素3 3种浓度的实验组合种浓度的
42、实验组合NAA（mg/L)6BA（mg/L)低中高低中高 低低中中高高低低低低 低中低中 低高低高中低中低 中中中中 中高中高高低高低 高中高中 高高高高第五十四页，共56页。广谱试验法 1 把培养基分为4个大类：无机盐、生长素、细胞分裂素和有机营养物质。2 对每一类物质再选定3个浓度，既：低（L)、中（M）和高（H）、4类物质各3种浓度的各种不同组合构成了一项包括81个处理的试验。3 在这81个处理中最好的一个用4个字母表示，例如：一个包含中等浓度无机盐、低浓度生长素、中等浓度细胞分类素和高浓度有机营养物质的处理表示为：MLMH。4 达到这个阶段后，可以再试验不同类型的生长素和细胞分裂素，以找到它们的最好类型。因为有些试验系统对生长素和细胞分类素这两类生长物质的具体形式比较敏感。第五十五页，共56页。NAAA：NAA 0mg/L，芽（少），根（无）B：NAA 0.1mg/L，芽（少），根（无），愈伤组织（少量）C：NAA 5.0mg/L，芽（少），根（多），愈伤组织（一定量）A B C第五十六页，共56页。
