1、退出Enzyme Engineering酶工程退出第三章第三章 固定化酶固定化酶n第一节第一节 概述概述n第二节第二节 固定化酶的性质及其影响因素固定化酶的性质及其影响因素n第三节第三节 固定化酶的制备固定化酶的制备n第四节第四节 固定化细胞固定化细胞n第五节第五节 固定化辅酶和原生质体固定化辅酶和原生质体n第六节第六节 酶反应器和固定化酶（细胞）酶反应器和固定化酶（细胞）的应用的应用退出第四节第四节 微生物、植物和动物细胞固定化微生物、植物和动物细胞固定化 n细胞特性比较细胞种类植物细胞微生物细胞动物细胞细胞大小/um20-3001-1010-100倍增时间/h120.3-615营养要求简单
2、简单复杂光照要求大多数要光照不要求不要求对剪切力敏感大多数不敏感敏感主要产物色素、药物、香精、酶等醇、有机酸、氨基酸、抗生素、核苷酸、酶疫苗、激素、抗体、酶退出一一.固定化细胞的特点固定化细胞的特点n概念:固定在载体上并在一定的空间范围内进行生命活动的细胞称为固定化细胞.该细胞能进行正常的生长、繁殖和新陈代谢，又称固定化活细胞或固定化增殖细胞。n类型：微生物细胞、植物细胞、动物细胞n生理状态：死细胞（完整细胞、细胞碎片、细胞器）n 活细胞（增殖细胞、静止细胞、完整细胞）n形状：颗粒状、块状、条状、薄膜状或不规则形状。n 最多使用：颗粒状珠体n使用周期：理论上讲，固定化增殖细胞保持了细胞原有的全
3、部活性，n 只要载体不解体，不污染就可以长期使用。退出二二.固定化细胞的优缺点固定化细胞的优缺点n优点优点n(1)省去了酶的分离手续为多酶系统，无须辅因子再生。n(2)细胞生长快、而且多、反应快。n(3)可以连续发酵，节约了成本，而且在蒸馏和提取前不用分离去细胞，能一边排出发酵液，一边进行培养，排除了产物抑制和消耗n(4)保持酶在细胞内的原始状况，增加了酶的稳定、特别是对污染因子的抵抗力增加。退出二二.固定化细胞的优缺点固定化细胞的优缺点n缺点缺点n(1)必须保持菌体的完整，防止菌体自溶，否则，将影响产品纯度。n(2)必须防止细胞内蛋白酶对所需酶的分解，同时，需抑制胞内其他酶的活性止副产物的形
4、成。n(3)细胞膜、壁会阻碍底物渗透和扩散。退出二二.细胞固定化方法细胞固定化方法n吸附法n包埋法退出1.吸附法吸附法n它主要通过载体与细胞间的静电引力，即细胞表面与载体之间范德华作用力，离子键和氢键作用力，才使细胞固定在载体上的。退出影响吸附法的主要因素影响吸附法的主要因素 n（1）Z-电位：Z-电位能近似地代表表面电荷密度的大小n（2）细胞的性质和细胞壁的组成：细胞壁的电荷性质n（3）载体的性质：特别是玻璃、陶瓷等无机材料退出2.包埋固定法包埋固定法 n包理法是在细胞自身并不与凝胶基体发生化学键合的情况下将其包埋在半透性聚合物颗粒（或膜）内的一种固定化方法。包埋法的最大优点是能较好的保持细
5、胞内多酶系统的活力，可象游离细胞那样进行产物的发酵生产。退出n常用载体：琼脂、海藻酸钙、角叉菜胶、明胶、聚丙烯酰胺n常用凝胶包埋法退出举例海藻酸钙包埋法举例海藻酸钙包埋法n基本原理是：称取一定量的海藻酸钠配成水溶液，经杀菌冷却后，与一定体积的细胞或孢子悬浮液混合均匀，然后用注射器或滴管将冷悬液滴入一定浓度的凝固浴中（常用CaCl2 溶液），形成球状固定化细胞退出研究热点研究热点光交联树脂包埋法光交联树脂包埋法 n例：相对分子量为1000-3000的光交联聚氨酯预聚物等，加入1%左右的光敏剂，加水配成一定浓度，加热至50，然后与一定浓度的细胞悬浮液混合均匀，摊成一定厚度的薄层，用紫外照射3min
6、，就可制得退出三三.固定化细胞的目的固定化细胞的目的n微生物菌体：不需多次培养、扩大，从而缩短了发酵生产周期n植物细胞n动物细胞退出第四节结束第四节结束n点击返回退出第五节第五节 固定化原生质体和辅酶固定化原生质体和辅酶n一.原生质体的制备n二.原生质体的固定化n三.辅酶固定化退出一一.原生质体的制备原生质体的制备n将对数生长期的细胞收集悬浮在含有渗透压稳定剂的高渗缓冲液中加入水解酶分离得到原生质体退出二二.原生质体的固定化原生质体的固定化n将原生质体制备好后，把离心收集到的原生质体重新悬浮在含有渗透压稳定剂的缓冲液中，配成一定浓度的原生质体悬浮液，然后采用包埋法制成固定化原生质体。退出三三
7、辅酶固定化辅酶固定化n1 原因n有机辅因子中具有某些特殊的化学基团，参与酶的催化反应n有机辅因子在使用过程中要流失，并且不能自行再生n有机辅因子价格昂贵n工业上应用全酶的关键是有机辅因子的保留和再生退出n2 固定化方法与酶相似，一般采用溴化氰法，碳二亚胺法以及重氮偶联法等共价偶联，或将其进行适当的化学修饰后固定在超滤器中。n3 辅酶固定化必须解决辅酶在多个酶之间传递的障碍。退出辅酶的固定化辅酶的固定化退出辅酶的固定化方法辅酶的固定化方法退出辅酶固定化的形式：辅酶固定化的形式：退出第五节结束第五节结束n点击返回退出第六节第六节 酶反应器和固定化酶（细胞）的应用酶反应器和固定化酶（细胞）的应用 n
8、酶反应器介绍n反应器选择的依据n反应器和酶稳定性n固定化酶和细胞的应用（工农业、医药、分析化学、酶电极、亲和色谱、环境保护、能源开发、基础理论研究）生物催化反应器工程n通过反应器型式、操作方式的改变能通过反应器型式、操作方式的改变能否使生物催化反应效率最大化？否使生物催化反应效率最大化？n将反应与传质紧密相关 退出一酶反应器。一酶反应器。n1 分批搅拌反应器。n2 连续流搅拌桶反应器。n3 连续搅拌桶-超滤反应器n4 填充床反应器n5 循环反应器n6 流化床反应器 退出1 分批搅拌反应器分批搅拌反应器n反应器结构简单，不需要特殊装置，适与小规模试验退出2 连续流搅拌桶反应器连续流搅拌桶反应器n
9、连续搅拌釜式反应器退出3 连续搅拌桶连续搅拌桶-超滤反应器超滤反应器酶循环退出4 填充床反应器填充床反应器n旋转填充床退出5 循环反应器循环反应器n高效内循环生物反应器（HCR）退出6 流化床反应器流化床反应器n与连续流搅拌桶式反应器类似，是让适量的颗粒状酶悬浮于反应床中，不用搅拌器，而是底物向上流过固定酶床，因此流速要适当控制。退出二二.反应器选择反应器选择n1.酶的形状、大小及机械强度：固定化酶的形状主要有粒状、膜状和纤维状等三种。其中粒状是最常用，这是因为比表面积最大的缘故。粒状酶可采用搅拌罐、填充床、流化床等，膜状酶则可采用膜型反应器。n2.底物的物理性质：底物的性质有三种情况：溶解性
10、物质、颗粒物质与胶体物质。溶解性物质适合任何类型的反应器，但颗粒状和胶体状底物往往会堵塞填充床，可应用搅拌罐或流化床反应器。n3.酶反应动力学n4.酶的稳定性n5.操作要求、应用和可塑性成本退出三三.反应器和酶的稳定性反应器和酶的稳定性n反应器中酶催化活性损失的原因：n酶本身失效n酶从载体上脱落n载体肢解n扩散限制效应退出四固定化酶（细胞）的应用四固定化酶（细胞）的应用n1.固定化酶（细胞）在工农业生产上的应用n2 固定化酶在医药治疗上的应用n3 固定化酶在分析化学中应用n4 固定化酶和亲和色谱n5 固定化酶与环境保护n6 新能源开发中的应用n7 固定化酶在基础理论研究中应用退出1 固定化酶（
11、细胞）在工农业生产上的应用固定化酶（细胞）在工农业生产上的应用n葡萄糖异构酶世界上生产规模最大的一种固定化酶。n利用固定化乳糖酶可以连续生产低乳糖奶n固定化酵母细胞等微生物可用于生产各种酒类退出2 固定化酶在医药治疗上的应用固定化酶在医药治疗上的应用n例1n固定化青霉素酰化酶，只要改变pH值等条件，就可以生成不同的产物。退出青霉素酰化酶催化合成头孢类抗生素青霉素酰化酶催化合成头孢类抗生素OH2NR2R1NH2NSOOOHNR1NH2NSOOO OHH1:D-(-)-PGA(R1=H,R2=NH2)2:D-(-)-PGM(RI=H,R2=OMe)3.D-(-)-HPGA(R1=OH,R2=NH2
12、)4:D-(-)-HPGM(R1=H,R2=OMeH2OPenicillin G acylase+Ampicillin(RI=H)Amoxicillin(R1=OH)7-ACA as nucleus退出青霉素酰化酶催化合成头孢类抗生素青霉素酰化酶催化合成头孢类抗生素R2R1NH2NSNNSR3R1OOOOOOH2NNH2OHR3HOH+Penicillin G acylaseH2O7-ACCA(R3=Cl)7-ADCA(R3=Me)Cefaclor(R1=H,R3=Cl)Cephalexin(R1=H,R3=Me)Cefadroxil(R1=OH,R3=Me)7-ACCA or 7-ADCA
13、as nucleus退出酶促合成头孢类抗生素酶促合成头孢类抗生素n-Reversible reaction n-Hydrolysis of substrate or product by biocatalystn-Difficulty of separation of product from reactantsCHCOOCH3NH2CHCOOHNH2CHCONHNSOCOOHCH3NH2H2NNSOCOOHCH3+H2NNSOCOOHCH3+Esterase HydrolaseSynthetase退出n例2：制造人工肾n利用固定化脲酶透析液和活性炭一起制成的体外循环装置，大大提高了疗效。退出
14、3固定化酶在分析化学中应用固定化酶在分析化学中应用n酶柱和酶管，可与分光光度计、荧光计或电量计结合，形成酶电极，进行某些物质的自动分析。退出酶电极酶电极n特点：快速、方便、灵敏、精确n范围：糖类、抗生素、氨基酸、甾体化合物、有机酸、脂粉、醇类、胺类以及尿素、尿酸、硝酸、磷酸等n要求：酶必须有较强的专一性，并且要有一定的纯度。退出酶电极酶电极221,5DODH O葡萄糖葡萄糖内酯退出4 固定化酶和亲和色谱固定化酶和亲和色谱n亲和技术的基础：是生物活性化合物生物特异信息的综合。n利用了生命现象中生物分子间特有的高亲和力、高专一性，可逆结合而设计的纯化方法n是唯一能够体现待分离物质间生物学功能差异的
15、分离方法退出5 固定化酶与环境保护固定化酶与环境保护n一：环境监测n二：污染物处理。退出6 新能源开发中的应用新能源开发中的应用nH2是重要的能源物质，虽然有许多微生物可以产生H2，但产氢系统不稳定。有人利用固定化丁酸梭菌连续产氢，稳定性比天然细胞好。n将植物的叶绿体中的铁氧还原蛋白氧化酶系统用胶原膜包被，可用于水的光介产生氢气和氧气退出7 固定化酶在基础理论研究中应用固定化酶在基础理论研究中应用n阐明酶反应机理n揭示酶原激活机理退出酶亚基性质的研究酶亚基性质的研究退出研究蛋白质研究蛋白质-核酸分子结构核酸分子结构n连续的固定化酶柱进行DNA序列分析n原理：是测定DNA聚合时，以掺入dNTP同时释放的焦磷酸判断是否发生了聚合反应，进而确定掺入的是哪种核苷酸从而推导出序列n该系统由连续的6个固定化酶柱组成n焦磷酸酶、DNA聚合酶、甘油激酶、己糖激酶、ATP磷酸化酶，荧光酶柱退出第六节结束第六节结束n点击返回
