1、蒋晓飞蒋晓飞复旦大学附属华山医院检验医学中心复旦大学附属华山医院检验医学中心l表表2 -内酰胺酶的结构和功能分类内酰胺酶的结构和功能分类分子结构分子结构 功能功能 举例举例 最适底物最适底物 抑制剂抑制剂(Ambler)(Bush)PEN CARB OX CR CTX ATM IPM CLAV CLOX EDTA丝氨酸酶丝氨酸酶 A 2a PC1，LEN-1 卅卅 十十 土土 卄卄 l 2b SHV-1,TEM-1 卅卅 十十 十十 卄卄 卄卄 l 2be K1,TEM-3,卅卅 十十 十十 卄卄 卄卄 卄卄 卄卄 l SHV-2,PER-1l 2br TEM-31 卅卅 十十 十十 十十 l
2、 2C PSE-1,BRO-1 卄卄 卅卅 十十 十十 十十 l 2e 卄卄 卄卄 卄卄 卄卄 卄卄 卄卄 l 2f Sme-1,NMC-A 卄卄 十十?十十 十十 卄卄 卄卄 十十 l IMI-1 lC 1 AmpC 卄卄 十十 卅卅 十十 卄卄 lD 2d OXA-1 卄卄 十十 卅卅 十十 V l未定未定 4 AVS-1 卄卄 卄卄 卄卄 V V 金属酶金属酶lB 3 IMP-1 卄卄 卄卄 卄卄 卄卄 卄卄 卄卄 卄卄l 嗜麦芽嗜麦芽L-1l Bush-J-M分类策略 3组金属酶组金属酶 头孢菌素酶头孢菌素酶 1组组 酶酶EDTA 2e组组 2a组组 2d组组 青霉素青霉素 酶酶 2c
3、 组组 2f组组 非金属酶非金属酶 4 组组 2be 组组 广谱酶广谱酶 2b 2br组组小结小结1组酶：头孢菌酶组酶：头孢菌酶，优先水解底物是头孢菌素，它们水解青霉素的，优先水解底物是头孢菌素，它们水解青霉素的的速率低于水解头孢噻啶的速率的的速率低于水解头孢噻啶的速率的30%，对三代头孢菌素和头霉烯，对三代头孢菌素和头霉烯耐药，但对碳青酶烯和四代头孢菌素较为敏感，对酶抑制剂克拉维耐药，但对碳青酶烯和四代头孢菌素较为敏感，对酶抑制剂克拉维酸和酸和EDTA均不敏感，可被氯唑西林抑制均不敏感，可被氯唑西林抑制 2组酶：优先水解青霉素类抗生素，其中水解头孢噻啶的速率低于组酶：优先水解青霉素类抗生素，
4、其中水解头孢噻啶的速率低于水解青霉素的速率的水解青霉素的速率的30%者为青霉素酶者为青霉素酶，又分为，又分为2a、2b、2c、2d、2e和和2 f亚组。亚组。3组酶：又称金属酶，能灭活青霉素类、头孢菌素类和碳青酶烯类组酶：又称金属酶，能灭活青霉素类、头孢菌素类和碳青酶烯类抗生素，但对安曲南敏感；酶活性可被抗生素，但对安曲南敏感；酶活性可被EDTA抑制，但酶抑制剂克抑制，但酶抑制剂克拉维酸和氯唑西林对它无作用拉维酸和氯唑西林对它无作用。4组酶：是染色体介导的耐抑制剂的青霉素酶，对头孢类抗生素的组酶：是染色体介导的耐抑制剂的青霉素酶，对头孢类抗生素的敏感性不定，对氨曲南和碳青霉烯敏感。敏感性不定，
5、对氨曲南和碳青霉烯敏感。A类类-内酰胺酶内酰胺酶1。A类类-内酰胺酶：内酰胺酶：广谱酶广谱酶2b组组ABA 大肠埃希菌TEM-1型酶结构；B 肺炎克雷伯菌的SHV-1型酶结构 超广谱超广谱-内酰胺酶内酰胺酶(2be)经典超广谱经典超广谱-内酰胺酶内酰胺酶 TEM型型ESBLs SHV型型ESBLs SHV-2型ESBLs、SHV-5 型ESBLs SHV环突变型ESBLs 其他超广谱其他超广谱-内酰胺酶内酰胺酶 CTX-M-型酶型酶 可为分4个小组 PER-1及其相关及其相关ESBL PER-1、-2、VEB-1、2 CME-1 TLA-1 特殊的非典型特殊的非典型ESBL SFO-1、GES
6、-1 TEM型型ESBLs1Glu140Lys和Glu240Lys替换：对头孢他啶和氨曲南 耐药2Arg164Ser或His：对头孢他啶耐药，对头孢噻肟敏感 3Gly238Ser：主要提高了对头孢噻肟的水解能力（如TEM-19)SHV型型ESBLs1.SHV-2型ESBLs：Gly238Ser，主要提高水解头孢噻肟的能力2.SHV-5型ESBLs：同时具有Gly238Ser和Glu240Lys突变3.SHV环突变型ESBLs：Asp179Ala、Arg A类类-内酰胺酶与内酰胺酶与B类、类、C类和类和D类酶的同源性比较类酶的同源性比较B类类-内酰胺酶内酰胺酶 又称金属又称金属-内酰胺酶，内酰胺
7、酶，Bush功能分类中属于功能分类中属于3组酶，能灭组酶，能灭活青霉素类、头孢菌素类和碳青酶烯类抗生素，但对安活青霉素类、头孢菌素类和碳青酶烯类抗生素，但对安曲南敏感；酶活性可被曲南敏感；酶活性可被EDTA抑制，但酶抑制剂克拉维酸抑制，但酶抑制剂克拉维酸和氯唑西林对它无作用和氯唑西林对它无作用。金属酶的功能亚分类金属酶的功能亚分类：3a、3b、3c金属酶的分子生物学亚型分类金属酶的分子生物学亚型分类:B1、B2、B3 亚分类亚分类 物学亚类物学亚类 酶的型别酶的型别 宿主宿主 发现国家发现国家 发现时间发现时间 分子量分子量 等电点等电点 3a B1 CcrA3 脆弱拟杆菌脆弱拟杆菌 美国美国
8、 1994 26 未测未测3a B1 CcrA4 脆弱拟杆菌脆弱拟杆菌 美国美国 1994 26 未测未测3a B1 CcrA 脆弱拟杆菌脆弱拟杆菌 美国美国 1986 26 5.23a B1 PCM-1 洋葱假单胞菌洋葱假单胞菌 未知未知 1994 未测未测 8.53a B1 IMP-1 铜绿假单胞菌铜绿假单胞菌 日本日本 1991 28 9.0 3a B1 IMP-2 不动杆菌属不动杆菌属 意大利意大利 1999 26 8.1 3a B1 IMP-3 铜绿假单胞菌铜绿假单胞菌 日本日本 2000 3a B1 IMP-4 不动杆菌属不动杆菌属 香港香港 2001 8.0 杨氏枸橼酸杆菌杨氏枸
9、橼酸杆菌 中国中国 2001 未测未测 未测未测 3a B1 IMP-6 粘质沙雷菌粘质沙雷菌 日本日本 2001 未测未测 未测未测 3a B1 IMP-7 铜绿假单胞菌铜绿假单胞菌 加拿大加拿大 2002 3a B1 IMP-8 肺炎克雷伯菌肺炎克雷伯菌 中国台湾中国台湾 2001 未测未测 8.2 3a B1 VIM-1 铜绿假单胞菌铜绿假单胞菌 意大利意大利 1999 5.3 3a B1 VIM-2 铜绿假单胞菌铜绿假单胞菌 法国法国 2000 未测未测 未测未测 3a B1 VIM-3 铜绿假单胞菌铜绿假单胞菌 台湾台湾 2000 未测未测 5.1 3b B2 CphA 嗜水气单胞菌
10、嗜水气单胞菌 意大利意大利 1993 28 8.03b B2 A2h 嗜水气单胞菌嗜水气单胞菌 美国美国 1990 28 8.03b B2 ACP 嗜水气单胞菌嗜水气单胞菌 苏格兰苏格兰 1996 31 8.23b B2 AsbM1 简达气单胞菌简达气单胞菌 美国美国 1990 34 9.13b B2 AsA-1 杀蛙气单胞菌杀蛙气单胞菌 苏格兰苏格兰 1994 19 7.93b B2 Imis 温和气单胞菌温和气单胞菌 英国英国 1995 未测未测 9.3c B2 戈氏军团菌戈氏军团菌 1986 25 10.53a B3 L1 嗜麦芽窄食单胞菌嗜麦芽窄食单胞菌 日本日本 1982 118 6
11、.9 B类类-内酰胺酶内酰胺酶 金属酶的三维结构图 A：CcrA（脆弱拟杆菌）B：Bc（蜡样芽胞杆菌）C：L1（嗜麦芽窄食单胞菌）园柱代表螺旋，板片代表片层 绿色数字为His残基，兰灰色数字为Asp残基，橙色数字为Cys或Ser残基。ABC获得性金属酶获得性金属酶（1）IMP型金属酶（2）VIM型金属酶-内酰胺酶的检测内酰胺酶的检测1酶蛋白性质分析：包括表型分析和酶动力学分析。酶蛋白性质分析：包括表型分析和酶动力学分析。2基因分析：基因型别分类、测序、分析其结构基因和调控基因分析：基因型别分类、测序、分析其结构基因和调控 基因。基因。3转移性分析：分析酶编码基因位于质粒上还是染色体上；转移性分
12、析：分析酶编码基因位于质粒上还是染色体上；在不在整合子中。在不在整合子中。收集菌株收集菌株 耐药表型分析（纸片药敏试验和耐药表型分析（纸片药敏试验和E-试验分析）试验分析）提取酶粗制品进行三相水解试验、等电聚焦电泳和酶动力学分析提取酶粗制品进行三相水解试验、等电聚焦电泳和酶动力学分析 根据结果判定酶的类群，选择相应根据结果判定酶的类群，选择相应PCR引物扩增引物扩增 阳性阳性 阴性阴性 整合子整合子PCR初筛初筛 阳性阳性 阴性阴性 鸟枪法克隆可表达鸟枪法克隆可表达 -内酰胺酶基因内酰胺酶基因 测定测定PCR产物序列产物序列 PCR扩增全扩增全 测定全克隆片段测定全克隆片段 可变区并测序可变区
13、并测序 序列序列整合子检查整合子检查 提取质粒接合实验提取质粒接合实验 克隆并转化到克隆并转化到DH5表达表达-内酰胺酶内酰胺酶 阳性阳性 阴性阴性 钙转或钙转或MgCl2或电转化或电转化 （2）耐药表型分析：纸片药敏试验和E-试验测定MICs（3）酶性质分析：提取酶粗提物进行a.三相水解试验。b.等电聚焦电泳。C.酶动力学分析。（4）基因分析：a.PCR扩增及PCR产物测序。b.PCR扩增整合子全可变区，分析其中结构和可能的-内酰胺酶基因。C.鸟枪法克隆可表达的-内酰胺酶基因，分析基因结构。（4）转移性分析：A。质粒：a.质粒接合试验。b.转化试验：电转化、钙转化或MgCl2转化 B。整合子
14、：a.PCR扩增整合子全可变区及PCR产物序列测定。l1纸片法：表1 肺克、催娩克雷伯、大肠埃希菌ESBLs产株纸片法初筛和确证实验2 MIC法：表2 肺克、催娩克雷伯、大肠埃希菌ESBLs产株MIC法初筛和确证实验验方法 初筛试验 表型确证试验培养基 MH MH 抗菌药物浓度 头孢泊肟 10g 或 头孢他啶 30g l 头孢他啶 30g 或 头孢他啶/克拉维酸 30/10g l 氨曲南 30g 或 和l 头孢噻肟 30g 或 头孢噻肟 30gl 头孢曲松 30g 头孢噻肟/克拉维酸 30/10gl （同时用多于一种抗生素可提高试验灵敏度）（确证试验要求同时做上述四种纸片）孵育条件 同标准纸片
15、扩散法 同标准纸片扩散法结果 头孢泊肟抑菌圈 22mm 有一种抗生素出现加有克拉维酸纸片抑菌圈 l头孢他啶抑菌圈 22mm 没有加克拉维酸纸片抑菌圈5 mm=产ESBLl氨曲南抑菌圈 27mml头孢噻肟抑菌圈 27mml头孢曲松抑菌圈 25mml=可疑产ESBL质量控制 阴性对照 ATCC25922 阴 性对照 ATCC25922加有克拉维酸 （参考质控标准）没有加克拉维酸抑菌圈 2mm l阳性对照 ATCC700603l头孢泊肟抑菌圈 9-16mm 头孢他啶/克拉维酸抑菌圈 l头孢他啶抑菌圈 10-18mm 头孢他啶抑菌圈5 mml氨曲南抑菌圈 9-17mml头孢噻肟抑菌圈 17-25mm
16、头孢噻肟/克拉维酸抑菌圈l头孢曲松抑菌圈 16-24mm 头孢噻肟抑菌圈3 mml l 验方法 初筛试验 表型确证试验培养基 CAMHB CAMHB 抗菌药物浓度 头孢泊肟 1g/mL或 头孢他啶 0.25-128 g/mL l 头孢他啶 1g/mL或 头孢他啶/克拉维酸 0.25/4-128/4g l 氨曲南 1g/mL或 和l 头孢噻肟 1g/mL或 头孢噻肟 0.25-64 g/mL l 头孢曲松 1g/mL 头孢噻肟/克拉维酸 0.25/4-64/4g l （同时用多于一种抗生素 （确证试验要求同时做上述l 可提高试验灵敏度）四种纸片）孵育条件 同标准MIC法 同标准MIC法结果 生长
17、=可疑产ESBL 有一种抗菌素生素出现加有克拉维酸 （例：MIC 2 g/mL）的MIC没有加克拉维酸的MIC 3个对 倍稀释度=产ESBL质量控制 阴性对照 ATCC25922=无生长 l阳性对照 ATCC700603 阳性对照 ATCC700603l头孢泊肟抑菌圈 2 g/mL 有一种抗菌素生素出现加有克拉维l头孢他啶抑菌圈 2 g/mL 的MIC没有加克拉维酸的MIC 3个对 l氨曲南抑菌圈 2 g/mL 倍稀释度l头孢噻肟抑菌圈 2 g/mL l头孢曲松抑菌圈 2 g/mL l1初筛试验l2 头孢西丁三相水解试验l3 联合用克拉维酸和氯唑西林两种抑制 平行试验lAmpC酶的检测酶的检测
18、l1 酶的提取l 冻融法 超声波破碎法l 1个菌落 1个菌落 l 种入12ml大豆汤。35度震摇4-6h 种入40ml大豆汤。35度震摇过夜l 4度40000rpm，离心20min，去上清液 4度4000rpm，离心20分钟，去上清l l沉淀物-890度反复冻溶5次 重悬在5mlpH7.0 的.01MPBS中，l 加入1.5mlpH7.0的0.01MPBS，超声波破碎10秒，间隔15秒重复 旋转混匀。10次l l4度12,000转rpm离心20分钟 4度12,000rpm离心20分l l取上清，-20度保存备用 取上清液，-20度保存备用l1 测定方法l 0.5麦氏单位浓度的大肠杆菌ATCC25922 涂在MH平皿上，中心贴头孢西丁纸片（30）l l 切出3-4个不同方向的狭缝，钩出其中的琼脂 l l 每沟中加入待测菌的40 的粗提物l l 35度孵育过夜 l l 观察结果
