1、第八章第八章-克隆基因的表达克隆基因的表达遗传信息从遗传信息从DNA到蛋白质到蛋白质的传递过程的传递过程-中心法则。中心法则。外源基因在宿主细胞中表达。外源基因在宿主细胞中表达。外源基因外源基因表达载体表达载体重组载体重组载体导入宿主细胞导入宿主细胞在宿主细胞中在宿主细胞中表达出蛋白质表达出蛋白质提取蛋白提取蛋白宿主细胞：宿主细胞：原核细胞或真核细胞。原核细胞或真核细胞。三、制约目的基因表达的因素：三、制约目的基因表达的因素：1.外源基因是否插入在正确的阅读框架外源基因是否插入在正确的阅读框架2.目的基因的有效转录（如启动子的作用）目的基因的有效转录（如启动子的作用）3.mRNA的有效转录（如
2、的有效转录（如S-D序列等作用）序列等作用）4.转录后，翻译后的适当的修饰和加工过程转录后，翻译后的适当的修饰和加工过程所谓所谓表达体系表达体系，是由，是由目的基因目的基因、表达载体表达载体与与宿主细胞宿主细胞组成的完整体系组成的完整体系四、在原核细胞内正确表达的基本条件：四、在原核细胞内正确表达的基本条件：必须能够必须能够正常地转录和翻译正常地转录和翻译1.外源基因外源基因不能带有间隔序列不能带有间隔序列（内含子）（内含子）真核基因必须用真核基因必须用cDNA或全化学合或全化学合成基因，不能用基因组成基因，不能用基因组DNA2.必须利用原核细胞的必须利用原核细胞的强启动子强启动子和和S-D序
3、列序列等调等调 节元件控制外源基因的表达节元件控制外源基因的表达3.外源基因和表达载体连接后，必须形成外源基因和表达载体连接后，必须形成正确的阅读框架正确的阅读框架阅读框架阅读框架:由每三个核苷酸为一组联接起来的编码序列由每三个核苷酸为一组联接起来的编码序列4.通过通过表达载体表达载体将外源基因导入宿主菌，并指导将外源基因导入宿主菌，并指导宿主菌的宿主菌的 酶系统酶系统合成外源蛋白合成外源蛋白表达载体：表达载体：适合在受体细胞内表达外源基因的载体适合在受体细胞内表达外源基因的载体5.利用宿主菌的利用宿主菌的调控系统调控系统，调节外源基因表达，防止外源，调节外源基因表达，防止外源 基因表达产物对
4、宿主菌毒害基因表达产物对宿主菌毒害用原核生物作宿主用原核生物作宿主A dividing E.coli原核或噬菌体启动子原核或噬菌体启动子MCSSD序列序列终止子终止子识别原核细胞的识别原核细胞的启动子启动子，催化所有的，催化所有的RNA合成。合成。数个相关的结构基因与其调控区结合形成一个数个相关的结构基因与其调控区结合形成一个表达的协同单位。表达的协同单位。2.以操纵子为单位以操纵子为单位1.只有一种只有一种RNA多聚酶多聚酶有意义链有意义链5反意义链反意义链3转录转录mRNA53翻译翻译蛋白质蛋白质NC534.不含内含子，缺乏转录后的加工系统。不含内含子，缺乏转录后的加工系统。5.调控主要在
5、转录水平上。调控主要在转录水平上。含有一个启始密码子和一段同核糖体含有一个启始密码子和一段同核糖体16SRNA3末端末端碱基互补的序列，叫碱基互补的序列，叫Shine-Dalgarno（S-D）序列）序列。6.mRNA的核糖体结合位点的核糖体结合位点 外源基因不能带有内含子外源基因不能带有内含子2.必须用必须用cDNA3.不能直接用真核基因组不能直接用真核基因组DNA4.必须利用原核细胞的调控原件（启动子等）必须利用原核细胞的调控原件（启动子等）5.防止外源基因产物对宿主细胞的毒害防止外源基因产物对宿主细胞的毒害是是DNA上的能与上的能与RNA聚合酶结合并能起始聚合酶结合并能起始mRNA合成的
6、序列。合成的序列。大肠杆菌的所有启动子中都有两段一致顺序大肠杆菌的所有启动子中都有两段一致顺序（consensus sequence）。）。1.启动子启动子-35 Box 和和-10 Box（1）启动子序列启动子序列 5-TTGACA-35-TATAAT-3-10box（Pribnow Box）TTGACATATAAT 转录起始位点转录起始位点17bp5核糖体结合位点核糖体结合位点RNA聚合酶聚合酶 亚基的识别位点亚基的识别位点。核糖体结合位点（核糖体结合位点（RBS）1）Shine-Dalgarno（SD）sequence：mRNA上与核糖体上与核糖体16sRNA结合的序列。结合的序列。ri
7、bosome binding sitemRNA 5AGGAGGUAUG16S rRNA3UCCUCCAS-D序列距离序列距离AUG的距离也影响翻译的距离也影响翻译AUG（91%）GUG（8%）UUG（1%）位于位于SD序列下游。序列下游。全酶是一个全酶是一个5聚体，含有两个聚体，含有两个小亚基小亚基，和，和2两个大两个大亚基（亚基（和和），一个），一个亚基。亚基。大肠杆菌只有一种类型的大肠杆菌只有一种类型的RNA多聚酶转录多聚酶转录tRNA，rRNA和和mRNA。（1）结构）结构内终止子内终止子 intrinsic terminator：E.coli中促使转录终止的中促使转录终止的DNA位置有
8、一段位置有一段反反向回文顺序向回文顺序，其后紧接一串，其后紧接一串A，称为内终，称为内终止子，形成终止信号。止子，形成终止信号。在表达载体克隆位点的下游一般设计一段转录终止子在表达载体克隆位点的下游一般设计一段转录终止子启动子启动子操纵子操纵子S-D序列序列目的基因目的基因终止子终止子由于茎环由于茎环3段紧接一串段紧接一串A/U的配对，稳定性比较的配对，稳定性比较差，有利于转录物脱落而不利于转录延续。差，有利于转录物脱落而不利于转录延续。反向回文顺序被转录后，立即形成一个茎环结反向回文顺序被转录后，立即形成一个茎环结构，使转录物与模板之间配对的碱基数降低，构，使转录物与模板之间配对的碱基数降低
9、，整个减弱了整个减弱了RNA 与与DNA的互作的互作 茎环结构茎环结构 多聚多聚A/U5-CCCACAGCCGCCAGTTCCGCTGGCGGCATTTTAA CT TCT TTCT-33-GGGTGTCGGCGGTCAAGGCGACCGCCGTAAAATTGAAGAAAGA-5(模板模板)转录转录5-CCCACAGCCGCCAGUUCCGCUGGCGGCAUUUU-OH-3(RNA)RNA折叠折叠mRNA折叠折叠U CCU GGCAUCGCGGCCGCGGCA ACCCAC UUUU3DNARNA聚合酶聚合酶脱落脱落大肠杆菌偏爱大肠杆菌偏爱UAAU。一般安置上。一般安置上全部的三个终止全部的
10、三个终止密码密码防止核糖体跳跃（防止核糖体跳跃（skipping）。）。Translation enhancer能够显著增强外源基因在大肠杆菌细胞中的表达能够显著增强外源基因在大肠杆菌细胞中的表达效率的特殊序列。效率的特殊序列。T7噬菌体基因噬菌体基因10前导序列（简称前导序列（简称g10-L序列）序列）;大肠杆菌大肠杆菌atpE基因基因mRNA5-UTR中富含中富含U的区段。的区段。21 必须是一种强启动子必须是一种强启动子能使外源基因的蛋白产量达到细胞总蛋能使外源基因的蛋白产量达到细胞总蛋白的白的10%-30%以上。以上。应呈现低水平的基础转录应呈现低水平的基础转录便于表达毒性蛋白等。便于
11、表达毒性蛋白等。应是可诱导型的应是可诱导型的用温度或化学试剂诱导。用温度或化学试剂诱导。来自大肠杆菌的乳来自大肠杆菌的乳糖操纵子。糖操纵子。用乳糖或其类似物用乳糖或其类似物IPTG充当诱导物，充当诱导物，与阻遏蛋白结合，与阻遏蛋白结合，解除抑制。解除抑制。Plac O 目的基因目的基因四聚体的四聚体的阻遏物阻遏物阻遏物作用区阻遏物作用区CAP作用区作用区RNA聚合酶作用区聚合酶作用区组成：组成：长度：长度：203bp的的HaeIII片断片断（包括（包括-半乳糖苷酶的前半乳糖苷酶的前8个密码）。个密码）。“可移动的可移动的lac启动子小片断启动子小片断”IPTG有毒、昂有毒、昂贵，不理想。贵，不
12、理想。IPTG=异丙基硫异丙基硫代代-D半乳糖半乳糖trpRP1O trpEtrpDP2trpCtrpB trpAtrpR阻遏蛋白基因；阻遏蛋白基因；P1P2启动子；启动子；O操纵基因；操纵基因；衰减子衰减子来自大肠杆菌的色氨酸操纵子。来自大肠杆菌的色氨酸操纵子。trpRP1O trpEtrpDP2trpCtrpB trpA邻氨基苯甲邻氨基苯甲酸合成酶酸合成酶吲哚甘油吲哚甘油磷酸合成酶磷酸合成酶色氨酸色氨酸合成酶合成酶 链链 链链分支酸分支酸邻氨基邻氨基苯甲酸苯甲酸磷酸核糖基磷酸核糖基邻氨基苯甲酸邻氨基苯甲酸CDRP吲哚甘吲哚甘油油-磷酸磷酸色氨酸色氨酸阻遏物阻遏物转录转录（P1是主要启动子，
13、是主要启动子，P2的作用只有的作用只有3%）没有色氨酸时，阻遏蛋白不能与操纵基因结合，没有色氨酸时，阻遏蛋白不能与操纵基因结合，能转录合成色氨酸所需要的酶。能转录合成色氨酸所需要的酶。trpRP1O trpEtrpDP2trpCtrpB trpA阻遏物阻遏物色氨酸色氨酸结合结合不转录不转录用于表达载体的用于表达载体的trp启动子一般只包含启动启动子一般只包含启动基因、操纵基因、和部分基因、操纵基因、和部分trpE基因。基因。P1OtrpE目的基因目的基因有色氨酸时，阻遏蛋白与色氨酸结合后才能与操有色氨酸时，阻遏蛋白与色氨酸结合后才能与操纵基因结合，从而阻止色氨酸合成酶类的转录纵基因结合，从而阻
14、止色氨酸合成酶类的转录是从是从 噬菌体中得到的一类启动子，比噬菌体中得到的一类启动子，比lac启启动子的活性高动子的活性高8-10倍，比倍，比trp启动子活性高。启动子活性高。cIII N PL/OLcI PMOR/PRCro PEcIIN:抗终止蛋白；抗终止蛋白；Cro:抗阻遏蛋白抗阻遏蛋白(裂解必需的）；裂解必需的）；cI,cII,cIII:阻遏蛋白；阻遏蛋白；P:启动子；启动子；O:操纵子。操纵子。R:右；右；L:左左cIII N PL/OLcI PMOR/PRCro PEcII阻遏物阻遏物转录转录转录转录转录转录当当cI合成后，与合成后，与OL和和OR结合阻止结合阻止RNA聚合酶，则左
15、右基因都受到抑制。但促聚合酶，则左右基因都受到抑制。但促进进PM使使cI进一步转录。进入溶原期。进一步转录。进入溶原期。早期左边早期左边早期右边早期右边表达载体常用的噬菌体启动子是表达载体常用的噬菌体启动子是PL。调节基因调节基因cI 则是选择了一个温度敏感性的突变则是选择了一个温度敏感性的突变基因基因cI857。整合在宿主基因组里，或克隆到载体上。整合在宿主基因组里，或克隆到载体上。42oC时阻遏蛋白失活，外源基因大量转录时阻遏蛋白失活，外源基因大量转录PL外源基因外源基因28oC时阻遏时阻遏PL，外源基因不转录。，外源基因不转录。1.细胞质中表达细胞质中表达（1）包涵体（）包涵体（incl
16、usion body）是存在于细胞质中的一种是存在于细胞质中的一种不溶性蛋白质不溶性蛋白质聚聚集折叠而成的晶体结构物。集折叠而成的晶体结构物。形成原理未知。形成原理未知。例：例：使重组蛋白易于分离、免受蛋白使重组蛋白易于分离、免受蛋白酶降解、不损害寄主细胞。酶降解、不损害寄主细胞。回收的蛋白生物活性差。回收的蛋白生物活性差。缺点缺点 优点优点（1）周质（）周质（periplasm）格兰氏阴性大肠杆菌位于内膜和外膜之间的细格兰氏阴性大肠杆菌位于内膜和外膜之间的细胞结构部分。胞结构部分。蛋白质从细胞质转运到周质蛋白质从细胞质转运到周质的复杂机理目前不完全清楚的复杂机理目前不完全清楚优点：优点：容易
17、被浓缩和纯化、有利于正确折叠、被降容易被浓缩和纯化、有利于正确折叠、被降解的少、具有完全生物学活性的重组蛋白。解的少、具有完全生物学活性的重组蛋白。phoA、OmpA、OmpT、OmpF、LamB、-内酰胺酶（内酰胺酶（lactamase）、）、肠毒素（肠毒素（enterotoxin）ST-II、LT-B等等 大肠杆菌的信号肽：大肠杆菌的信号肽：能带领蛋白穿过膜到达周质。但以后需要正确能带领蛋白穿过膜到达周质。但以后需要正确切割掉。切割掉。（2）信号肽（）信号肽（signal peptide）一般位于一般位于N端。端。鼠源鼠源RNase、人生长激素信号肽。、人生长激素信号肽。也能在细菌中起作用
18、。也能在细菌中起作用。胡萝卜欧氏杆菌的胡萝卜欧氏杆菌的PelB蛋白。蛋白。金黄色葡萄球菌的蛋白金黄色葡萄球菌的蛋白A。枯草芽孢杆菌的内切葡聚糖酶枯草芽孢杆菌的内切葡聚糖酶 （endoglucanase）。）。由于需要穿过两层膜，大肠杆菌只能分泌极由于需要穿过两层膜，大肠杆菌只能分泌极少的蛋白质到培养基中，效果都不太理想。少的蛋白质到培养基中，效果都不太理想。用溶血素基因构建分泌性融合蛋白；用溶血素基因构建分泌性融合蛋白；使在大肠杆菌细胞中表达的外源蛋白使在大肠杆菌细胞中表达的外源蛋白分泌到分泌到细胞外细胞外的培养基中。的培养基中。或与细菌素释放蛋白共表达。或与细菌素释放蛋白共表达。载体表达出的
19、外源基因蛋白质不与载体表达出的外源基因蛋白质不与细菌的任何蛋白质融合在一起。细菌的任何蛋白质融合在一起。S-D序列序列ATG-外源基因外源基因-TAG优点优点:1.非融合型表达载体非融合型表达载体产物结构接近于真核细胞体内的蛋白质结构。产物结构接近于真核细胞体内的蛋白质结构。缺点：缺点：容易被宿主菌的蛋白酶所破坏。容易被宿主菌的蛋白酶所破坏。哈佛大学的哈佛大学的Gilbert实验室建立的。表达能力强。实验室建立的。表达能力强。组成结构：组成结构：强启动子强启动子:tac（trp-lac）:trp的的-35区区lacUV5的的-10区区lac操纵基因操纵基因 操纵基因：操纵基因：乳糖操纵子系统。
20、乳糖操纵子系统。终止子：终止子：调节基因：调节基因：Lac I宿主菌染色体上的乳糖操纵子系统。如宿主菌染色体上的乳糖操纵子系统。如JM105菌菌rrnB的强终止子的强终止子rrnB强终止子强终止子S-D插入位点区插入位点区S-D序列和插入位点区：序列和插入位点区：tac PLac O S-D 插入位点区插入位点区rrnB T宿主宿主lac I载体的其余部分：载体的其余部分：来自来自pBR322质粒。质粒。表达诱导物：表达诱导物：IPTG（乳糖的类似物，不会被降解）（乳糖的类似物，不会被降解）阻遏物阻遏物IPTG必须选择一个有必须选择一个有lacI的宿主菌。的宿主菌。条件：条件：载体表达出的外源
21、蛋白质与细菌的分泌信号肽载体表达出的外源蛋白质与细菌的分泌信号肽连在一起，可被宿主菌分泌到细胞周质中。连在一起，可被宿主菌分泌到细胞周质中。如：如：pIN III系列：系列：pIN III-comA1,pIN III-comA2,pIN III-comA3,（1）组成结构）组成结构Ipplac P lac O S-D/ATG ompa 插入位点插入位点 Ipp（脂蛋白基因启动子）和（脂蛋白基因启动子）和lacUV5 启动子。启动子。调节基因：调节基因：lac I S-D序列和起始密码序列和起始密码ATG。分泌信号肽：分泌信号肽：大肠杆菌外膜蛋白基因大肠杆菌外膜蛋白基因ompa。插入位点区（多克
22、隆位点）。插入位点区（多克隆位点）。强启动子：强启动子：以以pBR322为基为基础构建的。础构建的。调节基因不必调节基因不必借助于宿主的借助于宿主的lacI.表达出的外源基因产物蛋白是与质粒载体上的表达出的外源基因产物蛋白是与质粒载体上的菌体蛋白连接在一起的。菌体蛋白连接在一起的。启动子：启动子：tac操纵基因：操纵基因：lacP调节基因：调节基因：lacIS-D序列序列（1）优点）优点（2）组成结构）组成结构便于融合蛋白的分离和纯化。便于融合蛋白的分离和纯化。22lacItac lac O S-D/ATG GST 插入位点插入位点 TGAlacPori：pBR322 ori融合肽：融合肽：G
23、ST(谷胱甘肽巯基转移酶）谷胱甘肽巯基转移酶）GST融合蛋白用融合蛋白用Glutathione Sepharose亲亲和层析柱和层析柱分离纯化。分离纯化。用凝血酶或用凝血酶或Xa因子可以把外源蛋白从因子可以把外源蛋白从GST上切下来上切下来柱（柱（columncolumn）GSTGST 外源蛋白外源蛋白凝血酶凝血酶外源蛋白外源蛋白柱（柱（columncolumn）GSTGSTGSTGST洗脱洗脱柱（柱（columncolumn）可再利用可再利用插入区：插入区：pGEX-1 TCTG GTT CCG CGT GGA TCC CCG GAA TTC ATC GTG ACT GAC TGA CGAL
24、eu Val Pro Arg Gly Ser Pro Glu Phe Ile Val Thr AspEcoR IBamH I凝血酶凝血酶CTG GTT CCG CGT GGA TCC CCG GGA ATT CAT CGT GAC TGA CTGACGLeu Val Pro Arg Gly Ser Pro Gly Ile His Arg AspEcoR IBamH I凝血酶凝血酶ATC GAA GGT CGT GGG ATC CCC GGG AAT TCA TCG TGA CTGACTGACIle Glu Gly Arg Gly Ile Pro Gly Asn Ser SerEcoR IBam
25、H IXa因子因子pGEX-2X的插入区：的插入区：pGEX-3X的插入区：的插入区：Sma ISma IHis-tag（组氨酸标签）：（组氨酸标签）：在外源多肽的在外源多肽的N端或端或C端接上端接上6个组氨酸个组氨酸（His）。）。His-tag能与能与Ni2+柱柱结合，但很容易被结合，但很容易被EDTA（或咪（或咪唑溶液）洗脱下来，可以纯化蛋白质。唑溶液）洗脱下来，可以纯化蛋白质。溴化氰溴化氰Cyanogen bromide：5-TTGACA-35-TATAAT-3-35box-10box（Pribnow Box）1.启动子的结构对表达效率的影响启动子的结构对表达效率的影响RNA聚合酶聚合
26、酶 亚基的识别位点亚基的识别位点（1）一致顺序）一致顺序间隔为间隔为17bp时，启动子最强。时，启动子最强。（3）-35区和区和-10区的碱基顺序区的碱基顺序越接近一致顺序，启动子越强。越接近一致顺序，启动子越强。5-TTGACATATAAT一致顺序一致顺序lactrp PLrecAtac Itac II5-TTTACATATGTT5-TTGACATTAACT5-TTGACAGATACT5-TTGATATATAAT5-TTGACATATAAT5-TTGACATTTAAT-35box-10box5-AGGAGGU-3S-D序列后面的序列后面的4个碱基：个碱基：如果是如果是A（T）,翻译效率最高；
27、翻译效率最高；如果是如果是G（C）,效率只有效率只有50%或或25%。（1）S-D序列序列？AUG左侧的三个碱基也有影响。左侧的三个碱基也有影响。-半乳糖苷酶的半乳糖苷酶的mRNA中：中：AUG左侧如果是左侧如果是UAU或或CUU时，最为有效；时，最为有效；如果是如果是UUC、UCA或或AGG时下降时下降20倍。倍。多顺反子的多顺反子的mRNA与核糖体的结合位点有一个与核糖体的结合位点有一个或几个终止密码。或几个终止密码。噬菌体外壳蛋白或核糖体蛋白噬菌体外壳蛋白或核糖体蛋白mRNA的核糖体的核糖体结合位点有多个结合位点有多个U。3.启动子与外源基因之间的距离启动子与外源基因之间的距离转录终止区
28、的存在保证载体转录终止区的存在保证载体不会转录非必须基因不会转录非必须基因，不必浪费源量和能量、不会干扰正常的表达。不必浪费源量和能量、不会干扰正常的表达。增加载体的拷贝数会增加转录出的增加载体的拷贝数会增加转录出的mRNA数目。数目。增加表达效率。增加表达效率。5.载体拷贝数及稳定性对表达效率的影响载体拷贝数及稳定性对表达效率的影响6.外源蛋白在菌体中的稳定性对表达效率的影响外源蛋白在菌体中的稳定性对表达效率的影响但过度的外源基因的表达会影响宿主的正常生长。但过度的外源基因的表达会影响宿主的正常生长。选择强启动子序列，如选择强启动子序列，如tac 等等2.调整调整S-D序列与序列与AUG碱基
29、的距离碱基的距离距离过长或过短都影响真核基因的表达。根据距离过长或过短都影响真核基因的表达。根据不同的启动子选择不同的距离。不同的启动子选择不同的距离。3.改变起始密码下面的几组密码子改变起始密码下面的几组密码子一般为一般为5-9bp。能提高翻译的起始效率。能提高翻译的起始效率。4.增加增加mRNA的拷贝数和稳定性的拷贝数和稳定性在外源基因的下游插入在外源基因的下游插入“重复性基因外回文序列重复性基因外回文序列”能防止能防止mRNA受到受到35外切酶的攻击。外切酶的攻击。5.减轻宿主细胞的代谢负荷减轻宿主细胞的代谢负荷合理地调节代谢负荷与外源基因高效表达的关系。合理地调节代谢负荷与外源基因高效
30、表达的关系。将宿主生长代谢与外源基因表达分开。将宿主生长代谢与外源基因表达分开。（1）诱导表达）诱导表达 一般采用温度诱导或药物诱导。一般采用温度诱导或药物诱导。cI857阻遏物有活性，抑制阻遏物有活性，抑制 PL启动子，外源启动子，外源基因不表达，宿主大量生长。基因不表达，宿主大量生长。28C:42C:cI857阻遏物失活，阻遏物失活，PL启动子启动，外源基启动子启动，外源基因高水平表达，宿主生长受到限制。因高水平表达，宿主生长受到限制。cI857PL外源基因外源基因PO调节基因调节基因lac I（位于宿主基因组内或载体上）始终产（位于宿主基因组内或载体上）始终产生阻遏物。生阻遏物。无无IP
31、TG:阻遏物与阻遏物与lac操纵基因结合，抑制外源基因操纵基因结合，抑制外源基因转录。宿主大量生长。转录。宿主大量生长。有有IPTG:阻遏物与阻遏物与IPTG结合，结合，lac操纵基因解放，操纵基因解放，外源基因大量转录。宿主生长受抑制。外源基因大量转录。宿主生长受抑制。将宿主的生长与载体的复制分开。将宿主的生长与载体的复制分开。当宿主大量当宿主大量生长后生长后，再诱导载体制粒的复制，再诱导载体制粒的复制，增加拷贝数。增加拷贝数。当需要宿主大量当需要宿主大量生长时生长时，抑制载体质粒的复制。，抑制载体质粒的复制。N末端：由原核基因编码一段多肽，末端：由原核基因编码一段多肽，C末端：是完整的真核
32、外源基因。末端：是完整的真核外源基因。这是避免被降解的最好措施。这是避免被降解的最好措施。质粒基因产物质粒基因产物 目的基因产物目的基因产物NC切割切割6.提高表达产物的稳定性提高表达产物的稳定性防止被宿主的酶降解。防止被宿主的酶降解。ZUV5载体载体:lac ZG AATTCCTTAA G外源基因外源基因 Z2载体载体:lac ZGGG AATTCCCCTTAA G外源基因外源基因 Z3载体载体:lac ZGG AATTCCCTTAA G外源基因外源基因提供三种融合插入阅读框。提供三种融合插入阅读框。使用次黄嘌呤核苷（使用次黄嘌呤核苷（lon）缺陷型菌株，减少宿）缺陷型菌株，减少宿主菌的蛋白
33、酶合成。主菌的蛋白酶合成。大肠杆菌的大肠杆菌的htp R基因突变也减少蛋白酶的降解基因突变也减少蛋白酶的降解作用。作用。T4噬菌体的噬菌体的pin基因产物能抑制细菌的蛋白酶。基因产物能抑制细菌的蛋白酶。可把可把pin增加到载体上。增加到载体上。减少宿主菌本身的蛋白酶的表达。减少宿主菌本身的蛋白酶的表达。细胞质细胞质外膜外膜内膜内膜周间质周间质质粒质粒染色体染色体位于位于N端，一般为端，一般为15-30aa。真核与原核的结。真核与原核的结构相似构相似,功能相似，可以互换。功能相似，可以互换。碱性氨基酸碱性氨基酸N疏水氨基酸核心区疏水氨基酸核心区切割位点切割位点Arg、LysLeu、IleAlaG
34、lySer信号肽酶信号肽酶外源蛋白外源蛋白 有信号肽。有信号肽。细胞内的转运机制。细胞内的转运机制。真核细胞中的分泌蛋白能在大肠杆菌中很好地真核细胞中的分泌蛋白能在大肠杆菌中很好地分泌表达；分泌表达；但非分泌蛋白很难在大肠杆菌中分泌。但非分泌蛋白很难在大肠杆菌中分泌。信号肽酶信号肽酶I、信号肽酶、信号肽酶II等近等近20多种蛋白质的参与。多种蛋白质的参与。蛋白质内有与分泌相关的蛋白质内有与分泌相关的aa 序列。序列。为蛋白指明目的地。为蛋白指明目的地。23colE orilacIintein CBDMCST7PromotorAmprM13 orirop维持拷贝数维持拷贝数pTYB1，pTYB2
35、，pTYB11，pTYB12 几丁质结合几丁质结合1.pTYB1，pTYB2:intein在在C端端Intein与与Chitin柱结合柱结合DTT或或-巯基乙醇或半胱氨酸能巯基乙醇或半胱氨酸能够诱导够诱导Intein的自我裂解活性的自我裂解活性单柱一步纯化蛋白。单柱一步纯化蛋白。无需蛋白酶作用即可将目的无需蛋白酶作用即可将目的蛋白与融合蛋白蛋白与融合蛋白IPTG诱导的诱导的T7启动子启动子分离纯化出天然蛋白，不带分离纯化出天然蛋白，不带有载体蛋白残基。有载体蛋白残基。分子内二硫键、分子间二硫键。二硫键异构酶催分子内二硫键、分子间二硫键。二硫键异构酶催化。使蛋白质能够正确折叠。化。使蛋白质能够正
36、确折叠。1.形成正确的二硫键形成正确的二硫键 抗体分子抗体分子人血红蛋白分子人血红蛋白分子如信号肽、内含肽（如信号肽、内含肽（intein）等序列的切割。）等序列的切割。（1）O-糖基化（糖基化（Ser,Thr）增加蛋白质的稳定性和某些特殊性质。增加蛋白质的稳定性和某些特殊性质。糖基糖基（2）N-糖基化（糖基化（Asn）Dol：长醇：长醇Mannose：甘露糖：甘露糖Glucose：葡萄糖：葡萄糖N-AcGlc：N乙酰氨基葡萄糖乙酰氨基葡萄糖磷酸化、乙酰化、磷酸化、乙酰化、硫酸化、丙烯酸化、硫酸化、丙烯酸化、羰基化、豆冠酸化、羰基化、豆冠酸化、软脂化软脂化羟脯氨酸羟脯氨酸甲基组氨酸甲基组氨酸羟
37、赖氨酸羟赖氨酸羧基谷氨酸羧基谷氨酸缺乏蛋白质的加工。缺乏蛋白质的加工。（如糖基化、氨基酸（如糖基化、氨基酸修饰等）。修饰等）。酵母菌、植物原生质体、动物培养细胞等。酵母菌、植物原生质体、动物培养细胞等。真核或病毒启动子真核或病毒启动子 MCS PolyA信号信号 终止子终止子外源基因外源基因真核细胞表达体系表达外源具有以下特点：真核细胞表达体系表达外源具有以下特点：真核细胞可真核细胞可识别并切除外源基因的内含子识别并切除外源基因的内含子，从而成功表达目的多肽从而成功表达目的多肽;真核细胞内具有一系列剪切酶真核细胞内具有一系列剪切酶2.真核基因在真核细胞中表达时，其真核基因在真核细胞中表达时，其
38、S-D序列序列 与细胞核糖体与细胞核糖体RNA（rRNA）16S亚基亚基3末端末端 的的互补程度互补程度较高，对翻译水平的调节有利较高，对翻译水平的调节有利;3.在真核细胞内，由外源基因表达的蛋白在真核细胞内，由外源基因表达的蛋白 可被可被糖基化糖基化，成为糖蛋白，有利于保持，成为糖蛋白，有利于保持 或提高免疫原性或提高免疫原性;4.外源基因导入真核细胞的外源基因导入真核细胞的效率较低效率较低，其，其 在染色体在染色体DNA上的整合是上的整合是随机随机的和的和自发自发 的，无法控制整合的位置和拷贝数的，无法控制整合的位置和拷贝数;5.真核细胞的真核细胞的培养要求较高培养要求较高，大量生产比，大
39、量生产比 较困难，成本也高较困难，成本也高.能在能在E.coli中克隆和扩增。中克隆和扩增。1.酵母克隆载体酵母克隆载体Leu2+、His+、Ura3+、Trp1+;有合适的克隆位点。有合适的克隆位点。有酵母的选择标记有酵母的选择标记Ori有大肠杆菌的选择标记有大肠杆菌的选择标记Ampr、Tetr。Dividing Saccharomyces cerevisiae(bakers yeast)cells由大肠杆菌质粒和酵母的由大肠杆菌质粒和酵母的DNA片段（选择标记）片段（选择标记）构成。构成。ColE1 酵母酵母Leu 2+如如 PYeleu10:转化率低（转化率低（1-10转化子转化子/微克
40、微克DNA）。）。载体上只有细菌的复制区，没有酵母的载体上只有细菌的复制区，没有酵母的自主复制区。自主复制区。可与受体细胞的染色体可与受体细胞的染色体DNA同源重组，随同源重组，随染色体一起复制。染色体一起复制。不能在酵母细胞中自主复制不能在酵母细胞中自主复制整合到酵母的染色体上整合到酵母的染色体上不能从酵母细胞中提取载体。不能从酵母细胞中提取载体。由大肠杆菌质粒和酵母的由大肠杆菌质粒和酵母的DNA片段片段(选择标记和酵选择标记和酵母母DNA自主复制顺序自主复制顺序ARS）构成。）构成。大肠杆菌质粒大肠杆菌质粒 酵母酵母ARS 酵母选择标记酵母选择标记ARS（automously replic
41、ating sequence）:ATTTTATATTTAT G T250bp保守区保守区转化率高（转化率高（102-103转化子转化子/微克微克DNA)。不稳定，容易丢失。不稳定，容易丢失。可从大肠杆菌和酵母中提取质粒。可从大肠杆菌和酵母中提取质粒。既能在大肠杆菌中复制，又能在酵母细胞既能在大肠杆菌中复制，又能在酵母细胞中自主复制。中自主复制。穿梭载体（穿梭载体（shuttle vector）在在YRp质粒中插入酵母染色体的质粒中插入酵母染色体的着丝粒区着丝粒区。特点：特点：YRp质粒质粒 酵母着丝粒酵母着丝粒不易从细胞中提取。不易从细胞中提取。行为像染色体，能稳定遗传。行为像染色体，能稳定遗
42、传。单拷贝存在。单拷贝存在。由大肠杆菌质粒、由大肠杆菌质粒、2 m质粒质粒及及酵母染色体酵母染色体DNA选选择标记构成。择标记构成。大肠杆菌质粒大肠杆菌质粒酵母选择标记酵母选择标记2 m质粒质粒如如pYF92:pBR3222 m酵母酵母his 3+酿酒酵母的内源质粒，长度是酿酒酵母的内源质粒，长度是2 m。含有自主复制起。含有自主复制起始区始区ori和和STB序列（使质粒在供体中维持稳定）。序列（使质粒在供体中维持稳定）。很高的转化活性（很高的转化活性（103-105转化子转化子/微克微克DNA）拷贝数多（拷贝数多（25-100分子分子/细胞）细胞）比比YRp稳定稳定YEp24Leu-酵母酵母
43、原生质体原生质体感受态感受态酶去壁酶去壁CaCl2、PEG整合到染色体上，整合到染色体上，或独立在酵母细胞内或独立在酵母细胞内转化转化Leu营养缺陷营养缺陷型培养基筛选型培养基筛选转化子克隆生长转化子克隆生长酵母载体酵母载体大肠杆菌大肠杆菌提取提取插入外源基因插入外源基因鉴定克隆鉴定克隆发酵表达发酵表达外源基因产物外源基因产物分离、纯化分离、纯化（1）优点）优点对其遗传学和生理学的研究比较深入。对其遗传学和生理学的研究比较深入。小量培养和大规模反应器中都能生长。小量培养和大规模反应器中都能生长。已经分离出很强的启动子。已经分离出很强的启动子。有翻译后的加工有翻译后的加工。本身自然分泌很少，便于
44、胞外蛋白的纯化。本身自然分泌很少，便于胞外蛋白的纯化。安全性高（安全性高（FDA确认的安全生物），不需要确认的安全生物），不需要 大量的宿主安全性检验。大量的宿主安全性检验。常常发生质粒丢失常常发生质粒丢失重组蛋白常常超糖基化重组蛋白常常超糖基化表达量普遍低表达量普遍低每个每个N-寡糖链上含有寡糖链上含有100多个甘露糖，多个甘露糖，分泌困难。分泌困难。正常的高甘露糖寡糖链上仅有正常的高甘露糖寡糖链上仅有8-13个甘露糖。个甘露糖。分泌型蛋白有时会留在分泌型蛋白有时会留在壁膜壁膜间隙，间隙，啤酒酵母不能识别和处理高等真核内含啤酒酵母不能识别和处理高等真核内含 子，必须使用子，必须使用cDNA2
45、4（1）细胞质内表达）细胞质内表达例：人例：人Cu/Zn-SOD在酵母中表达：在酵母中表达：超氧化物超氧化物H+H2O2H2O过氧化物酶过氧化物酶表达出的表达出的SOD修饰正确：修饰正确：起始氨基酸被切掉，起始氨基酸被切掉，第二个氨基酸丙氨酸也被乙酰化。第二个氨基酸丙氨酸也被乙酰化。SOD(超氧化物歧化酶超氧化物歧化酶)宿主：宿主：亮氨酸合成缺亮氨酸合成缺陷型酵母。陷型酵母。GAPD：甘油醛磷酸脱甘油醛磷酸脱氢酶氢酶在啤酒酵母中，只有分泌型的蛋白质才能被糖基化。在啤酒酵母中，只有分泌型的蛋白质才能被糖基化。需要糖基化的重组蛋白必须是分泌蛋白。需要糖基化的重组蛋白必须是分泌蛋白。方法：方法：在重
46、组蛋白的前面加一段编码酵母菌交配类型因子在重组蛋白的前面加一段编码酵母菌交配类型因子a1的前导肽，与重组蛋白的的前导肽，与重组蛋白的N端通过端通过Lys-Arg相连。相连。前导肽（前导肽（leader peptide）：）：蛋白质分泌到壁膜间隙时，酵母菌的蛋白质分泌到壁膜间隙时，酵母菌的内切蛋白酶内切蛋白酶识别这个切点信号，把重组蛋白正确切下来。识别这个切点信号，把重组蛋白正确切下来。前导肽前导肽 Lys-Arg 重组蛋白（水蛭素）重组蛋白（水蛭素）内切蛋白酶内切蛋白酶（1）乙肝表面抗原在嗜甲醇酵母中表达）乙肝表面抗原在嗜甲醇酵母中表达在大型发酵反应器中容易生长；在大型发酵反应器中容易生长；以
47、甲醇作唯一的碳源和能源，成本低。以甲醇作唯一的碳源和能源，成本低。有甲醇时，表达的有甲醇时，表达的乙醇氧化酶乙醇氧化酶高达胞内总蛋高达胞内总蛋白的白的40%！嗜甲烷酵母（嗜甲烷酵母（Pichia pastoris）的特点）的特点HBsAg:乙肝表面抗原。可以作为疫苗。乙肝表面抗原。可以作为疫苗。Aox1：乙醇氧化酶基因：乙醇氧化酶基因1启动子（受甲醇激活调控）。启动子（受甲醇激活调控）。His4：组氨酸合成所需的组氨酸脱氢酶基因。：组氨酸合成所需的组氨酸脱氢酶基因。3-aox1：整合到特定染色体的位点序列。：整合到特定染色体的位点序列。诱导物：甲醇诱导物：甲醇产量：产量：9106剂疫苗剂疫苗/
48、240L发酵罐发酵罐作为饲料作为饲料添加剂促添加剂促进反刍动进反刍动物消化。物消化。产量：产量：10L，200h连续连续发酵产出发酵产出50g溶菌酶。溶菌酶。1.杆状病毒（杆状病毒（Baculovirus）广泛侵染包括许多昆虫在内的无脊椎动物。广泛侵染包括许多昆虫在内的无脊椎动物。（1）侵染周期：）侵染周期：两种形式两种形式单独病毒粒子形式单独病毒粒子形式病毒病毒粒子粒子宿主细胞宿主细胞病毒病毒粒子粒子侵染侵染释放释放病毒病毒粒子粒子宿主细胞宿主细胞侵染侵染宿主细胞宿主细胞侵染侵染合成多合成多角体蛋白角体蛋白裂解裂解释放释放多面体溶解多面体溶解一般使用苜蓿银纹夜蛾细胞核型多角体病毒一般使用苜蓿
49、银纹夜蛾细胞核型多角体病毒（Autographa california multiple nuclear polyhedrosis virus，ACMNPV）感染后感染后36-48h，病毒开始合成大量的，病毒开始合成大量的 多角蛋白。多角蛋白。多角蛋白的启动子特别强。多角蛋白的启动子特别强。多角蛋白基因可以被替换掉而不影响多角蛋白基因可以被替换掉而不影响 病毒的繁殖。病毒的繁殖。多角体基因被外源基因取代后，病毒仍然能形多角体基因被外源基因取代后，病毒仍然能形成有感染能力的病毒粒子，但不能形成多面体。成有感染能力的病毒粒子，但不能形成多面体。通过显微镜检查看是否有多面体形成。通过显微镜检查看是否
50、有多面体形成。源自草地夜蛾的细胞株，在这种细胞中，多角蛋源自草地夜蛾的细胞株，在这种细胞中，多角蛋白的白的启动子特别活跃启动子特别活跃。（1）转移载体的构建）转移载体的构建大肠杆菌质粒大肠杆菌质粒，插入两段，插入两段ACMNPV序列序列以供同源重组。以供同源重组。杆状病毒的基因组太大（杆状病毒的基因组太大（13kb环状环状DNA），不能），不能直接插入。直接插入。必须使用同源重组的办法。必须使用同源重组的办法。多角蛋白的启动子和终止子及多角蛋白的启动子和终止子及polyA加尾信号。加尾信号。启动子与终止子之间插入多克隆位点启动子与终止子之间插入多克隆位点 转移载体中插入外源基因转移载体中插入外
