1、第六章第六章 微生物菌种的选育微生物菌种的选育第一节第一节 从自然界中分离筛选菌种从自然界中分离筛选菌种1、生产菌株来源、生产菌株来源 索取或购买索取或购买 自己选育自己选育 用原有菌株进行遗传改造进行育种用原有菌株进行遗传改造进行育种 向菌种保藏机构索取、购买出发菌株进行选向菌种保藏机构索取、购买出发菌株进行选 从自然界中分离菌种从自然界中分离菌种 从自然界中分离菌种就是从自然界微生物从自然界中分离菌种就是从自然界微生物资源中有目的、快速、准确地选出所需要的菌资源中有目的、快速、准确地选出所需要的菌种。种。设计方案设计方案采样采样增殖培养增殖培养*平板分离平板分离 筛选筛选(初筛、复筛初筛、
2、复筛)单株纯种分离单株纯种分离 性能考察性能考察(生产性能试验、毒性试验、生产性能试验、毒性试验、菌种鉴定）菌种鉴定）从自然界中分离筛选菌种的一般步骤从自然界中分离筛选菌种的一般步骤一、采样一、采样 从自然界种采集含目的菌的样品从自然界种采集含目的菌的样品1.环境条件对土样本中微生物分布的影响环境条件对土样本中微生物分布的影响营养环境营养环境水分水分温度温度通风通风酸碱度酸碱度 2.采样方法采样方法（1）去除表层土去除表层土（2）取取5-15cm土样几十克，装入无菌牛皮低土样几十克，装入无菌牛皮低袋或逆料袋中袋或逆料袋中3.注意注意 记录：时间，地点，环境情况等记录：时间，地点，环境情况等 样
3、品袋应封好口，防止水分失去样品袋应封好口，防止水分失去 土样应在分离前破碎土样应在分离前破碎 尽快分离尽快分离二二.增殖培养（富集培养）增殖培养（富集培养）适用：样品中目的菌数量不够多时适用：样品中目的菌数量不够多时目的目的：提高样品中目的菌的数量和比例：提高样品中目的菌的数量和比例原理原理：通过控制营养成分或培养条件，使目的菌：通过控制营养成分或培养条件，使目的菌得以繁殖和得以繁殖和/或非目的菌的生长受到抑制或非目的菌的生长受到抑制1、增殖培养的、增殖培养的 方法方法 控制营养成分控制营养成分 控制培养基控制培养基pH 控制培养温度控制培养温度 热处理热处理增殖芽孢细菌增殖芽孢细菌 添加抑制
4、剂添加抑制剂 三三.纯种分离纯种分离 目的：将目的菌从混杂的微生物中分离出来，目的：将目的菌从混杂的微生物中分离出来，获得纯培养获得纯培养1.纯种分离的一般方法纯种分离的一般方法（1）稀释平板法稀释平板法 倾注平板或涂布平板倾注平板或涂布平板（2）划线法划线法（3）组织分离法组织分离法*适用于分离高等真菌及植物病原菌适用于分离高等真菌及植物病原菌稀释分离涂布平板稀释分离倾注平板2 2、平皿反应快速检出法、平皿反应快速检出法定性或半定量定性或半定量 纸片培养显色法纸片培养显色法 透明圈法透明圈法 变色圈法变色圈法 生长圈法生长圈法 抑制圈抑制圈 琼脂块培养法筛选抗生素产生菌程序3、厌氧性微生物的
5、分离法、厌氧性微生物的分离法（1）去除培养基中的溶解氧，降低）去除培养基中的溶解氧，降低Eh（2）创造无氧环境）创造无氧环境 物理除氧物理除氧 空气置换法：干燥器或厌氧培养罐空气置换法：干燥器或厌氧培养罐化学除氧化学除氧 H2+O2 H2O (钯作催化剂）钯作催化剂）GASPAK罐除氧：硼氢化钠、柠檬酸，碳酸氢钠罐除氧：硼氢化钠、柠檬酸，碳酸氢钠化学反应产生化学反应产生H2 和和CO2，H2与与O2反应生成水反应生成水（3）厌氧分离（培养）技术）厌氧分离（培养）技术 高层琼脂柱技术高层琼脂柱技术 厌氧罐技术厌氧罐技术 厌氧手套箱技术厌氧手套箱技术GasPak厌氧手套箱厌氧手套箱厌氧培养装置厌氧
6、培养装置四四、筛选、筛选 初筛、复筛初筛、复筛：初 筛 复 筛种 子 斜面菌种 液体种子摇 瓶 每株 1 瓶 每株 3-5 瓶接 种 量 每瓶一环 35%取舍情况留下产量较高的 10-20%的菌株每次保留 1020%，直至最后 35 株好氧培养好氧培养五、培养工艺条件试验与生产试验五、培养工艺条件试验与生产试验1、摇瓶发酵条件、摇瓶发酵条件 培养基组成、初始培养基组成、初始pH、通风量（装液量）、接种量、通风量（装液量）、接种量、培养温度培养温度2、小型台式发酵罐发酵工艺条件、小型台式发酵罐发酵工艺条件 溶解氧控制，溶解氧控制，pH值控制，原料添加模式，消泡剂值控制，原料添加模式，消泡剂第二节
7、第二节 基因突变基因突变21 突变（突变（Mutation）定义）定义：遗传物质核酸（遗传物质核酸（DNA或病或病毒中的毒中的RNA）的分子结构或数量突然发生了可遗传）的分子结构或数量突然发生了可遗传的变化。的变化。突变是一种遗传的状态，是基因由于结构发生改变突变是一种遗传的状态，是基因由于结构发生改变从而由原来的存在状态变为另一种存在状态，即它从而由原来的存在状态变为另一种存在状态，即它的等位基因。的等位基因。突变体：突变体：带有突变基因的细胞或个体带有突变基因的细胞或个体突变型：突变型：突变体的基因型或表型称为突变型，和其突变体的基因型或表型称为突变型，和其相对的原存在状态称为野生型。相对
8、的原存在状态称为野生型。一、一、突变类型突变类型按变化范围分突变类型按变化范围分突变类型(一一)染色体畸变染色体畸变（chromosome aberration)染色染色体数目的变化或染色体结构发生较大片体数目的变化或染色体结构发生较大片段的异常改变。段的异常改变。1、染色体数目的变化、染色体数目的变化1)整倍体整倍体(euploidy)：含有完整的染色体组：含有完整的染色体组 单倍体：单倍体：haploid 二倍体：二倍体：diploid 三倍体：三倍体：triploid 四倍体：四倍体：tetraploid2)非整倍体非整倍体 aneuploidy：含有不完整状态的染：含有不完整状态的染色
9、体组，一般是指二倍体中成对染色体成员色体组，一般是指二倍体中成对染色体成员的增加或减少。的增加或减少。单体（二倍减一，单体（二倍减一，monosomic diploid):2n-1 缺体（二倍减二，缺体（二倍减二，nullisomic dilpoid):2n-2 三体（二倍加一，三体（二倍加一，trisomic diploid):2n+1 四体（二倍加二，四体（二倍加二，tetrasomic diploid):2n+2 双二倍加一（双二倍加一（double trisomic）:2n+1+1 部分二倍体部分二倍体（merodiploid）：细菌等原核生）：细菌等原核生物中由一整条染色体和外来的一
10、个染色体片物中由一整条染色体和外来的一个染色体片段所构成的不完整二倍体。段所构成的不完整二倍体。2、染色体结构的变化、染色体结构的变化 缺失缺失 deletion：重复重复 duplication：倒位倒位 inversion：易位易位 translocation：b f(二二)基因突变（基因突变（gene mutation）-染色体局部座位内的变化染色体局部座位内的变化 点突变点突变：只涉及：只涉及DNA分子中一对或少数几对碱分子中一对或少数几对碱基的改变。突变发生在一个基因范围内。基的改变。突变发生在一个基因范围内。多位点突变：突变超出一个基因范围。多位点突变：突变超出一个基因范围。1、碱
11、基置换、碱基置换 base replacement DNA链上的某一碱基对为另一碱基对所取代。链上的某一碱基对为另一碱基对所取代。(1)转换转换 transition：(2)颠换颠换 transversion：A G T C 转换 颠换 图 21-1 转换与颠换 (3)遗传学效应遗传学效应 错义突变错义突变 missensemissense mutation mutation：同义突变同义突变 silent mutationsilent mutation：无义突变无义突变 nonsense mutationnonsense mutation：表 21-2 点突变的类型(以 Tyr 的密码子为例
12、)无义突变同义突变错义突变DNA TACTAA,TAG RNA UAC UAA UAG aa Tyr Och AmbTAC TAT UAC UAU Tyr TyrTAC TCC UAC UCC Tyr Ser2、移码突变、移码突变 frameshift mutation：由于一对或：由于一对或少数几对（不是三的倍数）核苷酸的插入或缺少数几对（不是三的倍数）核苷酸的插入或缺失而造成此后一系列遗传密码子的阅读框发生失而造成此后一系列遗传密码子的阅读框发生移位错误的突变。移位错误的突变。Phe Asp Glu Pro Leu Cys ThrPhe Asp Glu Pro Leu Cys Thr5-T
13、TC GAT 5-TTC GAT G GAG CCC TTG TGC ACG-3AG CCC TTG TGC ACG-3 GA mutation GA mutation Phe Asp Lys Phe Asp Lys ProPro Leu Cys Thr Leu Cys Thr5-TTC GAT 5-TTC GAT A AAG CCAG CCC C TTG TGC ACG-3 TTG TGC ACG-3 CT mutation CT mutation Phe Asp Lys Phe Asp Lys ProPro Leu Leu CysCys Thr Thr5-TTC GAT AAG CC5-T
14、TC GAT AAG CCT T TTG TG TTG TGC C ACG-3 ACG-3 CA mutation CA mutation Phe Asp Lys Pro Leu Phe Asp Lys Pro Leu StopStop Thr Thr5-TTC GAT AAG CCC TTG TG5-TTC GAT AAG CCC TTG TGA A ACG-3 ACG-3 Phe Asp GluPhe Asp Glu ProPro Leu Cys Thr Leu Cys Thr5-TTC GAT GAG 5-TTC GAT GAG CCCCCC TTG TGC ACG-3 TTG TGC
15、ACG-3 Insertion of A Insertion of A Phe Asp Lys Phe Asp Lys ThrThr Leu Leu Val His Val His5-TTC GAT AAG 5-TTC GAT AAG A ACCCC CTT GTG CAC G-3 CTT GTG CAC G-3 二、按表型效应分突变类型二、按表型效应分突变类型野生型野生型 wild type：表现该物种正常表型的生物。：表现该物种正常表型的生物。突变型突变型 mutant：由于突变导致其正常的表型发生：由于突变导致其正常的表型发生了改变的生物。了改变的生物。1形态突变型形态突变型2生化突变型
16、生化突变型 营养缺陷型营养缺陷型 auxotrophic mutant 抗性突变型抗性突变型 resistant mutant3.致死突变型致死突变型 4.条件致死突变型条件致死突变型5.调节突变型调节突变型三、三、基因突变的规律基因突变的规律 不对应性或自发性、不对应性或自发性、随机性随机性、稀有性、稀有性、独立性、独立性、稳定性、稳定性、可逆性、可逆性、诱变性诱变性、1、自发突变的证实、自发突变的证实 随机性、不对应性随机性、不对应性1）波动实验）波动实验2）涂布实验）涂布实验3）影印培养实验）影印培养实验波动实验E.coli B 抗噬菌体抗噬菌体a a的波动测验结果的波动测验结果培养皿编
17、号培养皿上菌落数样品来自同一培养物样品来自不同培养物11446411021556200031352230042148107051565500861444253031726494000816512501920564030101347764815111071012040130191400151016017170111864019002035平均值平均值16.751.43.311.35303.8方方 差差15273.8694662040.8四、突变的频率：四、突变的频率：突变率（突变率（mutation rate）：）：每个细胞每一世代每个细胞每一世代中发生突变的概率。中发生突变的概率。v世代总数世
18、代总数=N2-N1v突变率的测定：突变率的测定：固体平板法测突变率：固体平板法测突变率：m=(M2-M1)/(N2-N1)液体培养法测突变率：液体培养法测突变率：m=2(M2/N2-M1/N1)/(g2-g1)液体稀释法测突变率：液体稀释法测突变率：P0=e-mNv细胞分裂非同步性效正：突变率细胞分裂非同步性效正：突变率=ln2m=0.69m五、自发突变的机制五、自发突变的机制环境因素的影响环境因素的影响微生物自身产生的代谢物的影响微生物自身产生的代谢物的影响转座子所造成的插入突变转座子所造成的插入突变DNADNA复制过程中偶尔发生错误复制过程中偶尔发生错误六、诱变剂及其诱变机制六、诱变剂及其
19、诱变机制 诱变是指通过人为的方法，利用物理、化学因素处理微生物而引起的突变。(一一)物理诱变剂物理诱变剂1）辐射：）辐射：uv，x-射线射线-射线等射线等 效应：点突变或染色体畸变效应：点突变或染色体畸变 机制：直接作用和间接作用机制：直接作用和间接作用 间接作用：辐射作用于染色体外物质，产间接作用：辐射作用于染色体外物质，产 生生 具有诱变作用的物质；具有诱变作用的物质；直接作用：辐射直接作用于染色体，直接作用：辐射直接作用于染色体，2）热：机理复杂）热：机理复杂3)离子束离子束:能量传递、动量交换，离子沉积与电荷积累能量传递、动量交换，离子沉积与电荷积累过程过程1、紫外线、紫外线 UV 有
20、效波长有效波长 2650，紫外灯波长，紫外灯波长 2537 作用机理作用机理 嘧啶二聚体、嘧啶水合物、嘧啶二聚体、嘧啶水合物、交联作用、交联作用、DNA链断裂链断裂 效应：效应：移码突变，碱基置换移码突变，碱基置换 紫外线诱发胸苷二聚体紫外线诱发胸苷二聚体 O O UV O O H CH3 H CH3 H CH3 CH3 H N N N N O N H O N H O N H H N O Thymine Thymine Thymine dimer O O 4 5 4 5 3 6 6 2 1 Fig.21-Production of thymine dimer by ultraviolet li
21、ght irradiation.2、电离辐射：、电离辐射：x-射线，射线，g g-射线射线作用机理作用机理直接作用：打断化学键直接作用：打断化学键间接作用：通过自由基打断化学键间接作用：通过自由基打断化学键效应：染色体畸变，碱基置换，移码突变效应：染色体畸变，碱基置换，移码突变3、热、热作用机理：脱嘌呤作用机理：脱嘌呤效应：碱基置换，移码突变效应：碱基置换，移码突变4、离子束、离子束(二二)化学诱变剂化学诱变剂1.碱基类似物：碱基类似物：是指其分子结构同是指其分子结构同DNA分子分子中的碱基非常类似，因此能取代碱基参入中的碱基非常类似，因此能取代碱基参入到到DNA分子中的一类化合物。分子中的一
22、类化合物。主要诱变剂：主要诱变剂：5-溴尿嘧啶和溴尿嘧啶和2-氨基嘌呤；氨基嘌呤；可诱发可诱发AT GC的转换。的转换。碱基类似物碱基类似物 base analog5-溴尿嘧啶溴尿嘧啶(5-BU，BU),5-氟尿嘧啶氟尿嘧啶(5-FU，FU),5-氨基尿嘧啶氨基尿嘧啶(5-AU，AU),2-氨基嘌呤氨基嘌呤(2-AP，AP)8-氮鸟嘌呤（氮鸟嘌呤（8-NG，NG）例：例：BU烯醇式：烯醇式：BUe，高频出现，高频出现，BUe G酮式酮式：BUk，低频出现低频出现，BUk=A A A G G T BUK BUE C 酮式 烯醇式5-BU掺入后的掺入后的掺入错误掺入错误G CG BUeG CG B
23、UeG CA=TA=BUkA:TA:BUkA:TG BUeA:TG CG BUe G CA=T5-BU复制错误复制错误A:T G C2.移码诱变剂移码诱变剂嵌入嵌入DNA 分子相邻碱基对之间，从而有分子相邻碱基对之间，从而有利于核苷酸的环出，因此可提高移码突利于核苷酸的环出，因此可提高移码突变的突变率。变的突变率。主要诱变剂：吖啶类化合物；溴化乙锭主要诱变剂：吖啶类化合物；溴化乙锭(ethidium bromide)，ICR系列化合物等系列化合物等部分移码诱变剂 DNA插入剂插入剂 (a)增加碱基 插入剂分子 模板链 5 ATCAG TTACT3 新合成链 3TAGTC G AATGA5 06
24、8nm 随机选择碱基 嵌入插入剂处 下一轮复制 5 ATCAG C TTACT 3 3TAGTC G AATGA 5(b)缺失碱基 模板链 5 ATCAG T TACT3 新合成链 3TAGTC ATGA5 插入剂失去 后复制 插入剂 5 ATCAGTACT 3 3TAGTCATGA 5 图 21-15 插入突变导制碱基的增加(a)和减少(b)3.化学修饰碱基的诱变剂化学修饰碱基的诱变剂1）烷化剂烷化剂：使：使DNA分子的碱基发生烷化反应，从分子的碱基发生烷化反应，从而更容易发生错配，是最常用的一类诱变剂。而更容易发生错配，是最常用的一类诱变剂。常用的有：硫酸二乙酯常用的有：硫酸二乙酯(DES
25、)，甲基磺酸乙酯，甲基磺酸乙酯(EMS)，亚硝基乙基尿，亚硝基乙基尿(NEU),亚硝基胍亚硝基胍(NTG),乙烯亚胺乙烯亚胺(EI)等。等。NTG（亚硝基胍）诱变作用特强，作用于复制叉，（亚硝基胍）诱变作用特强，作用于复制叉，可诱发多基因并发突变，被称为超诱变剂。可诱发多基因并发突变，被称为超诱变剂。Chemical reactivity of bases is responsible for some DNA lesionAlkylated bases部分烷化剂和烷化碱基alkylating agentsDNA的脱嘌呤 烷化鸟嘌呤的碱基配对 烷化鸟嘌呤的交联作用 如甲基黄酸乙脂（如甲基黄酸乙
26、脂（EMS）使使G的第的第6位烷化，使位烷化，使T的第的第4位上烷化，结位上烷化，结果产生的果产生的O-6-E-G和和 O-4-E-T分别和分别和T、G配对，配对，导致导致G C对转换成对转换成A T对；对；T A对转换成对转换成C G G O-6-E-G A T O-4-E-T C C T T A G G2)亚硝酸（亚硝酸（introus acid,NA）有氧化脱氨作用，）有氧化脱氨作用，可使可使G第第2个碳原子上的氨脱去，产生黄嘌呤个碳原子上的氨脱去，产生黄嘌呤（xanthine,x），次黄嘌呤），次黄嘌呤(H)仍和仍和C配对，配对，故不产生转换突变。但故不产生转换突变。但C和和A脱氨后分
27、别产生脱氨后分别产生U和次黄嘌呤和次黄嘌呤H，产生了转换，使，产生了转换，使C G转换转换成成A T，A T转换成转换成G C HNO2 A H G G A A T C C C U T HNO2 3)羟胺（羟胺（NH2OH）只特异地和胞嘧啶起反应，在只特异地和胞嘧啶起反应，在第第4 4个个C C原子上加原子上加-OH-OH，产生，产生4-OH-C4-OH-C，此产，此产 物可以物可以和和A A 配对，使配对，使CGCG转换成转换成TATA 作用：与作用：与C反应，造成反应，造成GCAT转换转换 HA C 4-OH-C T G A A 七、DNA损伤的修复1、光复活作用、光复活作用 photor
28、eactivation 2、切补修复、切补修复 excision repair（暗复活）（暗复活）Damage Mutant base is mismatched and/or distorts stractur Incision Endonuclease cleaves on both sides of damaged ba Excision Exonuclease removes DNA Between nicks Synthesis Polymerase synthesizes Replacement DNA Ligase seals nickFig.21-Excision repar
29、removes and replaces a stretch of DNA that includes the dameged base(s)第三节第三节 诱变育种诱变育种一、诱变育种的一般步骤一、诱变育种的一般步骤出发菌株出发菌株纯化、活化、同步培养纯化、活化、同步培养培养液培养液离心收集细胞、洗涤，制备均一的菌悬液（玻璃株打散、过滤）离心收集细胞、洗涤，制备均一的菌悬液（玻璃株打散、过滤）单细胞或单孢子悬液单细胞或单孢子悬液活菌计数，诱变预备试验活菌计数，诱变预备试验诱变处理诱变处理活细胞计数，致死率计算活细胞计数，致死率计算中间培养中间培养(后培养后培养)平板分离平板分离 变异率计算变异
30、率计算初筛初筛复筛复筛 保藏及扩大试验保藏及扩大试验（一）（一）出发菌株的选择出发菌株的选择1.出发菌株的类型出发菌株的类型2.对诱变剂的敏感性对诱变剂的敏感性3.具有特定生产性状的可能性：具有特定生产性状的可能性：4.要尽量选择单倍体，单核细胞（孢子要尽量选择单倍体，单核细胞（孢子)（二）菌悬液的制备（二）菌悬液的制备 1.细胞的生长状态细胞的生长状态2.菌悬液的均一性：菌悬液的均一性：3.菌悬液细胞浓度菌悬液细胞浓度酵母、霉菌孢子：酵母、霉菌孢子：106107个个/ml 细菌、放线菌孢子：细菌、放线菌孢子：108个个/ml4.菌悬液介质：菌悬液介质：（三）诱变处理（三）诱变处理 1.1.诱
31、变剂的选择诱变剂的选择对于低产或野生菌，对于低产或野生菌，uvuv线往往是首选，烷化剂等线往往是首选，烷化剂等也是常用的也是常用的诱变剂；对于经多次诱变处理的菌株，诱变剂；对于经多次诱变处理的菌株，常需要强辐射进行处理。常需要强辐射进行处理。碱基置换易回复，染色体畸变、移码等不易回复碱基置换易回复，染色体畸变、移码等不易回复细胞的透性和生理状态细胞的透性和生理状态经常变换诱变剂或复合处理经常变换诱变剂或复合处理2.2.剂量选择剂量选择最适剂量因诱变剂的类型、出发菌株及其生理状态最适剂量因诱变剂的类型、出发菌株及其生理状态的的 不同而不同。不同而不同。亚硝基胍亚硝基胍在低死亡率剂量时突变率较在低
32、死亡率剂量时突变率较 高，而高，而uvuv则在高致死率时才有较高的突变率。则在高致死率时才有较高的突变率。高产菌株在高产菌株在低剂量低剂量时效果较好，而对多核细胞处理时效果较好，而对多核细胞处理剂剂 量不宜过低。质量性状宜选用高剂量。量不宜过低。质量性状宜选用高剂量。经多次诱变处理已钝化的菌株可用一次高剂量处理经多次诱变处理已钝化的菌株可用一次高剂量处理来来 激活激活3 处理方法处理方法单一诱变剂处理单一诱变剂处理;复合处理复合处理02468101214161820123456789 10试验号突变率/%乙烯亚胺与紫外线复合诱变处理结果乙烯亚胺与紫外线复合诱变处理结果 1-对照；对照；2-乙烯
33、亚胺（浓度乙烯亚胺（浓度1:7000）；）；3,5,7,9-紫外线；紫外线；4,6,8,10-乙烯亚胺加紫外线乙烯亚胺加紫外线 紫外线的剂量（紫外线的剂量（erg/mm2）：）：3,4-2000；5,6-4000；7,8-6000；9,10-10000 X-射线的照射剂量与亚热带链霉菌白霉素高产菌株射线的照射剂量与亚热带链霉菌白霉素高产菌株39#变异的关系变异的关系 形态突变型形态突变型 负突变型负突变型 正突变型正突变型 紫外线照射剂量与龟裂链霉菌土霉素高产菌株紫外线照射剂量与龟裂链霉菌土霉素高产菌株293#变异的关系变异的关系（四）后培养后培养目的目的使突变基因纯合并表达，消除表型使突变基
34、因纯合并表达，消除表型延迟。延迟。后培养培养基：后培养培养基：营养要求丰富，酪素水营养要求丰富，酪素水解液解液(或蛋白胨或蛋白胨)可提供大量氨基酸，酵可提供大量氨基酸，酵母膏可提供各种生长因子。母膏可提供各种生长因子。（五）变异菌株的分离及筛选五）变异菌株的分离及筛选 筛选：包括初筛，复筛和终筛等。筛选：包括初筛，复筛和终筛等。明确筛选目标：产量突变还是其它突变型；明确筛选目标：产量突变还是其它突变型；产量准备提高多少等；产量准备提高多少等；一次诱变目标不要太高一次诱变目标不要太高 制定筛选方案：筛选准备分几步；筛选采制定筛选方案：筛选准备分几步；筛选采用的培养方法和培养条件；每一步准备筛用的
35、培养方法和培养条件；每一步准备筛选多少菌株；每一步准备采用的分析方法选多少菌株；每一步准备采用的分析方法等。等。诱变育种工作中应注意的问题诱变育种工作中应注意的问题 安全问题：安全问题：各种诱变剂几乎都有致癌作用，因此在操作中应各种诱变剂几乎都有致癌作用，因此在操作中应时刻注意安全问题：个人安全和环境安全。时刻注意安全问题：个人安全和环境安全。v 个人安全：个人安全：操作时注意防护，不同诱变剂要求不同防护方法，操作时注意防护，不同诱变剂要求不同防护方法，如如-射线辐射防护要求较高，射线辐射防护要求较高，uv要求较低，而化学诱变剂则要求较低，而化学诱变剂则要求不与身体有关部位直接接触；要求不与身
36、体有关部位直接接触；v 环境安全：环境安全：所用物品要经解毒处理；液体经解毒或充分稀释所用物品要经解毒处理；液体经解毒或充分稀释才可以排放。才可以排放。要养成良好的工作习惯：要养成良好的工作习惯：如仔细观察细微的形态变化、要详如仔细观察细微的形态变化、要详实记录菌株的诱变史和诱变谱系。实记录菌株的诱变史和诱变谱系。诱变育种技术诱变育种技术要和其他育种手段相结合。要和其他育种手段相结合。诱变育种由于其筛选的盲目性，突变的不定向性，工作量十诱变育种由于其筛选的盲目性，突变的不定向性，工作量十分大，因此分大，因此要对整个工作进行合理的设计并结合新技术提高要对整个工作进行合理的设计并结合新技术提高其工
37、作效率。其工作效率。二二、营养缺陷型突变株的筛选营养缺陷型突变株的筛选营养缺陷型（营养缺陷型（auxotroph）突变株：）突变株：是指丧失了合成一种或多种必需生长因子能力是指丧失了合成一种或多种必需生长因子能力的菌株，它们只能在补充了相应的生长因子的培的菌株，它们只能在补充了相应的生长因子的培养基上才能正常生长。养基上才能正常生长。营养缺陷型突变株的用途营养缺陷型突变株的用途 科研上：科研上：v研究代谢途径；研究代谢途径；v基因重组的遗传标记菌种；基因重组的遗传标记菌种；vAAAA、碱基、维生素生物测定的试验菌种、碱基、维生素生物测定的试验菌种生产上：生产上：v发酵法生产氨基酸，核苷酸的生产
38、菌种；发酵法生产氨基酸，核苷酸的生产菌种；v生产菌株杂交育种的亲本进行遗传标记生产菌株杂交育种的亲本进行遗传标记完全培养基完全培养基 Complete Medium （CM）含有满足某微生物的所有营养缺陷型和野生型菌含有满足某微生物的所有营养缺陷型和野生型菌株生长所需营养物质的天然或半合成培养基。株生长所需营养物质的天然或半合成培养基。基本培养基基本培养基Minimal Medium（MM）：）：不含生长因子仅能满足某微生物的野生型菌株生不含生长因子仅能满足某微生物的野生型菌株生长需要的最低成分合成培养基。长需要的最低成分合成培养基。补充培养基补充培养基Supplemented Medium(
39、SM)：补充了一种或数种生长因子，以满足某微生物的补充了一种或数种生长因子，以满足某微生物的特定的营养缺陷型生长的培养基，其中的生长因子特定的营养缺陷型生长的培养基，其中的生长因子多是通过直接添加多是通过直接添加AA、碱基或维生素而提供。、碱基或维生素而提供。(一一)筛选方法筛选方法 后培养后培养淘汰野生型淘汰野生型检出缺陷型检出缺陷型鉴定缺陷型鉴定缺陷型1、淘汰野生型、淘汰野生型 原理：原理：限制营养成分使缺陷型细胞生限制营养成分使缺陷型细胞生长受抑制，野生型细胞在生长过程中长受抑制，野生型细胞在生长过程中被杀死或生长后被除去被杀死或生长后被除去 方法：方法：v 抗生素法：抗生素法：v 菌丝
40、过滤法：适用于丝状真菌菌丝过滤法：适用于丝状真菌v 差别杀菌：差别杀菌：抗生素淘汰野生型抗生素淘汰野生型饥饿培养：培养细胞经离心、洗涤后，悬浮饥饿培养：培养细胞经离心、洗涤后，悬浮于无氮基本培养基中培养于无氮基本培养基中培养1-21-2小时，耗尽细胞小时，耗尽细胞内氮源，防止加抗生素后的内氮源，防止加抗生素后的“误杀误杀”；加抗生素处理：加入等体积的加抗生素处理：加入等体积的2N2N基本培养基基本培养基（两倍浓度氮源的基本培养基），同时加入（两倍浓度氮源的基本培养基），同时加入抗生素，培养一定时间，野生型细胞由于生抗生素，培养一定时间，野生型细胞由于生长而被杀死，缺陷型细胞处于休止状态而得长而
41、被杀死，缺陷型细胞处于休止状态而得以保留。以保留。v制霉菌素可用于处理酵母菌和霉菌。制霉菌素可用于处理酵母菌和霉菌。v注意：注意：培养基应培养基应添加渗透压稳定剂添加渗透压稳定剂而制成高而制成高渗培养基，可避免由于细胞破裂而给缺陷型渗培养基，可避免由于细胞破裂而给缺陷型提供营养物质。提供营养物质。2、检出缺陷型、检出缺陷型1）限量补充法）限量补充法2）夹层培养法）夹层培养法3）逐个检出法）逐个检出法4）影印培养法）影印培养法3、鉴定缺陷型、鉴定缺陷型-生长谱法生长谱法大类的鉴定：大类的鉴定：v营养因子：营养因子：A、酪素水解液（、酪素水解液（AA混合物）混合物）B、水溶性维生素混合液、水溶性维
42、生素混合液C、酵母核酸水解液（碱基）、酵母核酸水解液（碱基）D、酵母膏水溶液、酵母膏水溶液v制备平板：制备平板：缺陷型菌经缺陷型菌经CM液体培液体培养后，离心洗涤，制成养后，离心洗涤，制成107108个个/ml菌悬液。取菌悬液。取0.1ml涂布至涂布至MM平平板上板上ABCDv方法：方法：分别用无菌小滤片沾取少许各种营养因分别用无菌小滤片沾取少许各种营养因子后，放入接种的子后，放入接种的MM上，适宜温度下培养上，适宜温度下培养 v判断：判断：A、D生长，生长，AA缺陷型缺陷型 B、D生长，维生素缺陷型生长，维生素缺陷型 C、D生长，碱基缺陷型生长，碱基缺陷型 AB、D生长，生长，AA、维生素双
43、缺、维生素双缺 AC、D生长，生长，AA、碱基双缺、碱基双缺 BC、D生长，维生素、碱基双缺生长，维生素、碱基双缺 组生长因子甲123456乙27891011丙3812131415丁4913161718戊51014171920己61115182021详细鉴定详细鉴定生长因子组合法生长因子组合法营养缺陷型的生长谱鉴定营养缺陷型的生长谱鉴定天冬氨酸天冬氨酸天冬氨酰磷酸天冬氨酰磷酸天冬氨酸半醛天冬氨酸半醛HseMetThrIle二氨基庚二酸二氨基庚二酸LysAKase钝齿棒杆菌钝齿棒杆菌L-赖氨酸生物合成途径及调节赖氨酸生物合成途径及调节不同类型突变株积累不同类型突变株积累L-赖氨酸的水平赖氨酸的水
44、平突变菌株突变菌株突变型突变型产量产量(mg/ml)钝齿棒杆菌钝齿棒杆菌Hse-17.93钝齿棒杆菌钝齿棒杆菌Thr-2.33钝齿棒杆菌钝齿棒杆菌Thr-+Met-2.00钝齿棒杆菌钝齿棒杆菌AECr20.0AECr,Hse-50.0北京棒杆菌北京棒杆菌Hse-36.6Hse-,AECr45.0三、三、其它类型突变型的筛选其它类型突变型的筛选（一）抗代谢类似物突变型的筛选（一）抗代谢类似物突变型的筛选抗反馈调节突变株抗反馈调节突变株：是指一种对反馈抑制不是指一种对反馈抑制不敏感或对阻遏有抗性的组成型突变株，或兼敏感或对阻遏有抗性的组成型突变株，或兼而有之的突变株。而有之的突变株。代谢类似物代谢
45、类似物：结构与代谢物类似，因此可起到代：结构与代谢物类似，因此可起到代谢物所具有的调节作用的一类化合物。谢物所具有的调节作用的一类化合物。1、抗反馈抑制突变、抗反馈抑制突变发生发生基因突变基因突变的细胞：酶的的细胞：酶的结构基因发生结构基因发生突变突变导致调节酶的调节部位发生改变，不导致调节酶的调节部位发生改变，不再与结构类似物（或产物）结合，从而解再与结构类似物（或产物）结合，从而解除了产物的反馈抑制作用，使产物得以合除了产物的反馈抑制作用，使产物得以合成。成。突变前 突变后 2、抗反馈阻遏突变型抗反馈阻遏突变型 由于由于调节基因发生突变调节基因发生突变，使产生的阻遏蛋白不，使产生的阻遏蛋白
46、不再能和辅阻遏物结合，或由于操纵基因发生突再能和辅阻遏物结合，或由于操纵基因发生突变，被激活的阻遏蛋白不能作用于已突变的操变，被激活的阻遏蛋白不能作用于已突变的操纵基因，从而解除产物的阻遏作用，使产物得纵基因，从而解除产物的阻遏作用，使产物得以过量积累。以过量积累。3、筛选方法筛选方法（1）将经过诱变的细胞直接涂布在含有一）将经过诱变的细胞直接涂布在含有一定浓度结构类似物的基本培养基平板上，定浓度结构类似物的基本培养基平板上，长出的菌落即为抗结构类似物突变株；长出的菌落即为抗结构类似物突变株；（2）将经过诱变的细胞涂布在基本培养基）将经过诱变的细胞涂布在基本培养基平板上，在平板的中央加少量结构
47、类似平板上，在平板的中央加少量结构类似物，在抑菌圈内长出的个别菌落即为抗物，在抑菌圈内长出的个别菌落即为抗结构类似物突变株；结构类似物突变株；注意：注意：如果是协同反馈抑制，则要在基本培养如果是协同反馈抑制，则要在基本培养基中添加起协同反馈抑制作用的产物基中添加起协同反馈抑制作用的产物 抗结构类似物突变是数量性状，可通过抗结构类似物突变是数量性状，可通过逐渐提高结构类似物的浓度使产物的积逐渐提高结构类似物的浓度使产物的积累水平逐渐提高累水平逐渐提高结构类似物和代谢终产物结构类似物和代谢终产物终产物结构类似物过量积累产物精氨酸D-精氨酸精氨酸苯丙氨酸对氟苯丙氨酸,噻吩丙氨酸苯丙氨酸赖氨酸AEC赖
48、氨酸酪氨酸对氟苯丙氨酸,D-酪氨酸酪氨酸色氨酸5-碱基色氨酸,6-甲基色氨酸色氨酸脯氨酸3,4-二氢脯氨酸,磺胺胍脯氨酸腺苷酸2-氟腺嘌呤腺苷酸葡萄糖2-脱氧葡萄糖b-葡萄糖苷酶蔗糖,麦芽糖2-脱氧棉子糖蔗糖酶纤维二糖,葡萄糖 甘油纤维素酶（二）组成型酶突变株的筛选（二）组成型酶突变株的筛选1、诱导型酶在生产上的缺点、诱导型酶在生产上的缺点诱导物往往价格昂贵诱导物往往价格昂贵受诱导物种类，浓度及分解产物的影响受诱导物种类，浓度及分解产物的影响2、筛选原理、筛选原理 通过诱变处理，使调节基因发生突变，不通过诱变处理，使调节基因发生突变，不产生有活性的阻遏蛋白，或者操纵基因发生突产生有活性的阻遏蛋
49、白，或者操纵基因发生突变不再能与阻遏物相结合，从而使诱导型酶变变不再能与阻遏物相结合，从而使诱导型酶变为组成型酶。为组成型酶。3、筛选方法、筛选方法 创造一种有利于组成型菌株生长而不利于创造一种有利于组成型菌株生长而不利于诱导型菌株生长的培养条件，造成对诱导型菌株生长的培养条件，造成对组成型的组成型的选择优势选择优势或者适当的或者适当的识别两类菌落识别两类菌落的方法，从的方法，从而把组成型突变株选择出来。而把组成型突变株选择出来。恒化器法恒化器法 以诱导物作底物，浓度低于起诱导作用浓度，以诱导物作底物，浓度低于起诱导作用浓度，诱导型菌株生长极弱，而变异株由于能产分解诱导型菌株生长极弱，而变异株
50、由于能产分解底物的酶，则能分解底物而得以生长，通过连底物的酶，则能分解底物而得以生长，通过连续不断加入新鲜基质，使变异株数量逐渐增多，续不断加入新鲜基质，使变异株数量逐渐增多，最后达到能分离的浓度。最后达到能分离的浓度。循环培养法循环培养法不含诱导物培养基不含诱导物培养基 含诱导物培养基含诱导物培养基(普通碳源或氮源）普通碳源或氮源）（诱导物作唯一碳源或氮源）（诱导物作唯一碳源或氮源）两菌都能生长，但组两菌都能生长，但组成型变异株已能合成成型变异株已能合成特定的酶，亲株不能特定的酶，亲株不能变异株调整期短，亲株调变异株调整期短，亲株调整期长，短时间培养后，整期长，短时间培养后，变异株所占比例增
