1、病毒实验全册配套病毒实验全册配套教学课件教学课件2动物病毒学实验动物病毒学实验病毒学实验要求病毒学实验要求 做好生物防护做好生物防护1.白大褂白大褂+手套手套+口罩口罩2.所有实验废弃物集中处理，不能随意丢弃所有实验废弃物集中处理，不能随意丢弃 无菌操作无菌操作1.实验过程尽量不要说话，以免唾液污染实验材料实验过程尽量不要说话，以免唾液污染实验材料2.酒精灯使用：长时间不使用请熄灭酒精灯，长头发女生酒精灯使用：长时间不使用请熄灭酒精灯，长头发女生或男生请扎辫子或男生请扎辫子实验一实验一 鸡胚接种鸡胚接种病毒培养的宿主系统：病毒培养的宿主系统：本动物本动物 实验动物：家兔、小实验动物：家兔、小白
2、鼠、大白鼠、豚鼠白鼠、大白鼠、豚鼠 鸡胚鸡胚 组织细胞组织细胞是否有血丝？怎么辨别公鸡母鸡？怎么辨别公鸡母鸡？什么是鸡胚？（受精什么是鸡胚？（受精 还是未受精）还是未受精）鸡胚如何生产？鸡胚如何生产？如何判断鸡胚是活的？如何判断鸡胚是活的？二、实验目的二、实验目的 了解鸡胚的基本结构与功能，掌握常用的鸡了解鸡胚的基本结构与功能，掌握常用的鸡胚接种方法。胚接种方法。一、原理一、原理 鸡胚为活的动物机体，组织分化程度低，病毒易鸡胚为活的动物机体，组织分化程度低，病毒易于增殖，可选择不同的日龄和接种途径，感染病毒的于增殖，可选择不同的日龄和接种途径，感染病毒的组织和液体中含大量病毒。组织和液体中含大
3、量病毒。三、鸡胚的结构与功能三、鸡胚的结构与功能卵壳卵壳壳膜壳膜气室气室绒毛尿囊膜绒毛尿囊膜 尿囊腔尿囊腔羊膜与羊膜腔羊膜与羊膜腔卵黄卵黄卵白卵白卵壳卵壳壳膜壳膜上有细孔，进行气体交换上有细孔，进行气体交换使气体分子和液体分子在内外两方使气体分子和液体分子在内外两方面进行交换。面进行交换。气室气室 绒毛尿囊膜绒毛尿囊膜呼吸和调节压力呼吸和调节压力起胚胎呼吸器官的功能，氧气的交换起胚胎呼吸器官的功能，氧气的交换是在膜的血管内通过卵壳孔而进行的。是在膜的血管内通过卵壳孔而进行的。尿囊腔尿囊腔 胚胎的排泄器官，内含有尿囊液，初为透胚胎的排泄器官，内含有尿囊液，初为透明液体，是单纯生理盐溶液，以后尿囊
4、液明液体，是单纯生理盐溶液，以后尿囊液中尿酸盐迅速增加，胚胎发育到第中尿酸盐迅速增加，胚胎发育到第12-1312-13天后，尿囊液开始变混浊。天后，尿囊液开始变混浊。羊膜与羊膜腔羊膜与羊膜腔卵黄卵黄 卵白卵白其中盛有羊水，胎体浸泡于其中其中盛有羊水，胎体浸泡于其中在胚胎发育早期供给鸡胚营养。在胚胎发育早期供给鸡胚营养。在胚胎发育晚期供给鸡胚营养。在胚胎发育晚期供给鸡胚营养。四、材料四、材料1.1.鸡胚鸡胚 1010日龄日龄2.2.病毒病毒 鸡新城疫病毒（鸡新城疫病毒（NDVNDV）3.3.酒精棉球、碘酊棉球酒精棉球、碘酊棉球4.4.照蛋灯照蛋灯5.5.打孔器打孔器6.6.石蜡石蜡7.7.注射器
5、注射器8.8.蛋座蛋座十二指肠出血性溃疡十二指肠出血性溃疡腺胃乳头出血腺胃乳头出血小肠出血小肠出血产畸形蛋产畸形蛋五、受精卵的选择五、受精卵的选择最好是来自最好是来自SPFSPF鸡群，以降低母源抗体的影响鸡群，以降低母源抗体的影响受精卵的壳最好是白色的受精卵的壳最好是白色的受精卵必须新鲜，保存在受精卵必须新鲜，保存在5-205-20不要超过不要超过1010天，天，保存一个月的受精卵，孵化率将近于零。保存一个月的受精卵，孵化率将近于零。六、孵育六、孵育温度：温度：37.5-38.537.5-38.5相对湿度：相对湿度：50%-60%50%-60%新鲜空气流通，特别是在孵化新鲜空气流通，特别是在孵
6、化5-65-6天以后天以后翻卵：从孵育后第翻卵：从孵育后第3 3天开始，每天翻卵一次。天开始，每天翻卵一次。七、检卵七、检卵自孵育后的第自孵育后的第4 4天开始检卵，每天一次。天开始检卵，每天一次。孵育孵育4-54-5日于检卵灯上检查鸡胚受精与否及日于检卵灯上检查鸡胚受精与否及发育情况。发育情况。未受精卵：未受精卵：只见模糊的卵黄阴影，不只见模糊的卵黄阴影，不见血管和鸡胚痕迹见血管和鸡胚痕迹活胚：活胚：具有清晰的血管和鸡胚暗影，具有清晰的血管和鸡胚暗影，较大鸡胚还可见到胚动，但孵育较大鸡胚还可见到胚动，但孵育1414、1515天以后胚动不明显，甚至无胚动。天以后胚动不明显，甚至无胚动。死胚：死
7、胚：血管昏暗模糊，没有胚动。血管昏暗模糊，没有胚动。八、接种前处理八、接种前处理用检卵灯再次检查鸡胚活力，用铅笔画出气室用检卵灯再次检查鸡胚活力，用铅笔画出气室和胚胎的位置，并在将要接种的部位做好记号。和胚胎的位置，并在将要接种的部位做好记号。对鸡胚进行消毒。对鸡胚进行消毒。九、鸡胚用于病毒培养的优缺点九、鸡胚用于病毒培养的优缺点组织分化程度低，病毒易于增殖组织分化程度低，病毒易于增殖可选择不同的日龄和接种途径可选择不同的日龄和接种途径感染病毒的组织和液体中含大量病毒感染病毒的组织和液体中含大量病毒容易采集和处理容易采集和处理来源充足来源充足设备和操作简便易行设备和操作简便易行（一）优点（一）
8、优点（二）缺点（二）缺点胚内可能污染细菌和病毒胚内可能污染细菌和病毒 沙门氏菌、禽白血病病毒、新城疫、禽脑沙门氏菌、禽白血病病毒、新城疫、禽脑脊髓炎病毒脊髓炎病毒母源抗体母源抗体许多病毒在鸡胚中增殖缺乏特异性的感染指针许多病毒在鸡胚中增殖缺乏特异性的感染指针十、接种途径十、接种途径1.1.尿囊腔接种尿囊腔接种绒毛尿囊膜接种绒毛尿囊膜接种卵黄囊接种卵黄囊接种眼球接种眼球接种羊膜腔接种羊膜腔接种 正粘病毒和副粘病毒正粘病毒和副粘病毒脑内接种脑内接种 狂犬病毒狂犬病毒静脉接种静脉接种 蓝舌病毒蓝舌病毒2.2.用碘酊和酒精消毒气室端用碘酊和酒精消毒气室端3.3.用钢锥在气室中央锥一小孔用钢锥在气室中央
9、锥一小孔（一）卵黄囊接种法（一）卵黄囊接种法主要用于虫媒披膜病毒以及鹦鹉热衣原体和立克主要用于虫媒披膜病毒以及鹦鹉热衣原体和立克次氏体等的分离和增殖。次氏体等的分离和增殖。方法一：方法一：1.1.取取6-86-8日龄鸡胚，用检卵灯照视画出气室和日龄鸡胚，用检卵灯照视画出气室和胚胎位置后，垂直放置在卵座上胚胎位置后，垂直放置在卵座上(大头向上大头向上)4.4.用注射器吸取病毒悬液，沿气室端所穿小孔用注射器吸取病毒悬液，沿气室端所穿小孔垂直刺入垂直刺入3cm3cm，注入，注入0.1-0.5ml0.1-0.5ml病毒液。病毒液。5.5.用熔化的石蜡封孔，置孵卵箱内继续孵育，用熔化的石蜡封孔，置孵卵箱
10、内继续孵育，每天翻卵每天翻卵1-21-2次，次，24h24h内死亡者废弃。内死亡者废弃。4.4.用钢锥打一小孔，将针头刺入约用钢锥打一小孔，将针头刺入约1.5cm1.5cm，注入病毒液，注入病毒液0.1-0.5ml0.1-0.5ml5.5.用熔化的石蜡封孔，置孵卵箱内用熔化的石蜡封孔，置孵卵箱内继续孵育，继续孵育，24h24h内死亡者废弃内死亡者废弃方法二：方法二：1.2.1.2.同方法一同方法一3.3.将卵横放在卵座上，胚胎位置将卵横放在卵座上，胚胎位置向下。在卵长径的向下。在卵长径的1/21/2处用碘处用碘酊和酒精消毒酊和酒精消毒（二）绒毛尿囊膜接种（二）绒毛尿囊膜接种 主要用于痘病毒和疱
11、疹病毒的分离和增殖。主要用于痘病毒和疱疹病毒的分离和增殖。方法一：方法一：1.1.取取10-1210-12日龄鸡胚，画出气室部，消毒日龄鸡胚，画出气室部，消毒2.2.在气室端的卵壳上开一在气室端的卵壳上开一1.51.51.5cm1.5cm的口的口3.3.用灭菌眼科镊子撕去一小片内壳膜用灭菌眼科镊子撕去一小片内壳膜4.4.滴入接种物滴入接种物5.5.用胶布或透明胶纸封闭切口用胶布或透明胶纸封闭切口方法二：（要造人工气室）方法二：（要造人工气室）1.1.在胚胎附近近气室处，选择血管较少的部在胚胎附近近气室处，选择血管较少的部位，用电烙器在卵壳上烙一个直径约位，用电烙器在卵壳上烙一个直径约3-3-4
12、mm4mm的烤焦圈。的烤焦圈。2.2.用碘酊和酒精消毒后，小心用刀尖撬起卵用碘酊和酒精消毒后，小心用刀尖撬起卵壳，造成卵窗。壳，造成卵窗。3.3.在气室中央钻一小孔。在气室中央钻一小孔。4.4.用针尖挑破卵窗中心的壳用针尖挑破卵窗中心的壳膜，切勿损伤其下的绒毛膜，切勿损伤其下的绒毛尿囊膜，滴加生理盐水于尿囊膜，滴加生理盐水于刺破处。刺破处。5.5.用橡皮乳头紧贴于气室中央小孔上吸气，造成用橡皮乳头紧贴于气室中央小孔上吸气，造成气室内负压，使卵窗部位的绒毛尿囊膜下陷而气室内负压，使卵窗部位的绒毛尿囊膜下陷而形成人工气室，此时可见滴于壳膜上的生理盐形成人工气室，此时可见滴于壳膜上的生理盐水迅速渗入
13、水迅速渗入6.6.用用1ml1ml注射器滴注射器滴2-32-3滴接种物于绒毛尿囊膜上。滴接种物于绒毛尿囊膜上。7.7.用透明胶纸封住卵窗，或用玻璃纸盖于卵窗中，用透明胶纸封住卵窗，或用玻璃纸盖于卵窗中，周围涂上熔化的石蜡密封，气室中央的小孔用周围涂上熔化的石蜡密封，气室中央的小孔用石蜡密封。石蜡密封。8.8.胚横卧于卵箱中，不许翻动，保持卵窗向上。胚横卧于卵箱中，不许翻动，保持卵窗向上。（三）（三）尿囊腔接种尿囊腔接种 主要用于正粘病毒和副粘病毒，如流感主要用于正粘病毒和副粘病毒，如流感病毒、新城疫病毒的分离和增殖。病毒、新城疫病毒的分离和增殖。1.1.选用选用10-1110-11日龄的鸡胚，
14、画出气室和胚位日龄的鸡胚，画出气室和胚位2.2.在气室接近胚体处用碘酊和酒精依次消毒在气室接近胚体处用碘酊和酒精依次消毒3.3.用钢锥穿一小孔用钢锥穿一小孔（右图哪种接种方式较好？）（右图哪种接种方式较好？）4.4.将注射器针头经小孔沿卵长轴方向插入将注射器针头经小孔沿卵长轴方向插入0.5-0.5-1.0cm1.0cm，注入，注入0.1-0.2ml0.1-0.2ml接种物接种物（插入部位的选择，（插入部位的选择，胚体、对面还是两侧？如果注射器打不起去说明什么？）胚体、对面还是两侧？如果注射器打不起去说明什么？）5.5.用石蜡封孔，并置孵卵箱中孵育，每天翻卵并用石蜡封孔，并置孵卵箱中孵育，每天翻
15、卵并检卵一次，检卵一次，24h24h内死亡者废弃内死亡者废弃十一、十一、NDVNDV接种鸡胚后对鸡胚的影响接种鸡胚后对鸡胚的影响 NDVNDV以尿囊腔接种于以尿囊腔接种于9-109-10日龄鸡胚，强毒株日龄鸡胚，强毒株在在30-60h30-60h死亡，弱毒株死亡，弱毒株3-6d3-6d死亡。死亡的鸡胚以死亡。死亡的鸡胚以尿囊液含毒量最高，胚胎全身出血，以头部、足尿囊液含毒量最高，胚胎全身出血，以头部、足趾、翅膀出血尤为明显。趾、翅膀出血尤为明显。十二、收毒十二、收毒 收毒前将鸡胚直立放置于收毒前将鸡胚直立放置于44冰箱半小时以上，冻冰箱半小时以上，冻死胚胎，防止出血。死胚胎，防止出血。根据接种
16、途径的不同，收获相应的材料根据接种途径的不同，收获相应的材料1.1.绒毛尿囊膜接种绒毛尿囊膜接种 收获接种部位绒毛尿囊膜收获接种部位绒毛尿囊膜2.2.尿囊腔接种尿囊腔接种 收获尿囊液（收获尿囊液（5-8ml5-8ml）3.3.卵黄囊接种卵黄囊接种 收获卵黄囊或胚体收获卵黄囊或胚体4.4.羊膜腔接种羊膜腔接种 收获羊水（收获羊水（0.5-1ml0.5-1ml）十三、试验报告作业十三、试验报告作业1.1.用于病毒培养的系统主要有哪些？用于病毒培养的系统主要有哪些？2.2.常用的鸡胚接种方法有哪些常用的鸡胚接种方法有哪些?3.3.简要说明鸡胚的结构及各部分结构的功能。简要说明鸡胚的结构及各部分结构的
17、功能。4.4.用鸡胚来进行病毒的培养要注意哪些问题用鸡胚来进行病毒的培养要注意哪些问题?5.5.如何区分无精卵、死胚、活胚？为什么最好如何区分无精卵、死胚、活胚？为什么最好选用白壳蛋？选用白壳蛋？6.6.卵黄囊接种与尿囊腔接种所用鸡胚日龄各卵黄囊接种与尿囊腔接种所用鸡胚日龄各是多少？为什么两者不一样？是多少？为什么两者不一样？7.7.在鸡胚接种后为什么每天要检卵，且在鸡胚接种后为什么每天要检卵，且24h24h内内死亡的鸡胚要废弃？死亡的鸡胚要废弃？8.8.收毒之前为什么要将鸡胚在收毒之前为什么要将鸡胚在44放置一段时放置一段时间？间？9.9.病毒接种鸡胚的目的或用途是什么？病毒接种鸡胚的目的或
18、用途是什么？实验报告撰写要求实验报告撰写要求（一）实验目的（一）实验目的（二）实验材料与步骤（二）实验材料与步骤（三）实验结果（三）实验结果（四）讨论与分析（四）讨论与分析每位同学都需要撰写试验报告，作为成每位同学都需要撰写试验报告，作为成绩的考核依据之一绩的考核依据之一实验室卫生实验室卫生 实验结果观察：周四下午3:50 走之前签到，不能代签 实验报告选择思考题中3题作答实验二实验二 原代细胞培养原代细胞培养（以鸡胚成纤维细胞为例）（以鸡胚成纤维细胞为例）成纤维细胞（成纤维细胞（fibroblastfibroblast）是疏松结）是疏松结缔组织的主要细胞成分。缔组织的主要细胞成分。结缔组织又
19、分为疏松结缔组织（如皮结缔组织又分为疏松结缔组织（如皮下组织）、致密结缔组织（如腱）、下组织）、致密结缔组织（如腱）、脂肪组织等。脂肪组织等。疏松结缔组织由少量多种细胞和大量疏松结缔组织由少量多种细胞和大量细胞间质组成。细胞包括成纤维细胞细胞间质组成。细胞包括成纤维细胞、浆细胞、巨噬细胞、肥大细胞等。、浆细胞、巨噬细胞、肥大细胞等。其中成纤维细胞数目最多。其中成纤维细胞数目最多。一、实验目的一、实验目的 了解不同原代细胞的了解不同原代细胞的形态，掌握鸡胚成纤维细形态，掌握鸡胚成纤维细胞的制备与培养方法。胞的制备与培养方法。ABA A 上皮细胞上皮细胞 B B 成纤维细胞成纤维细胞猪肺泡巨噬细胞
20、猪肺泡巨噬细胞原代细胞原代细胞继代细胞（二倍体细胞株）继代细胞（二倍体细胞株）传代细胞传代细胞u根据细胞培养物的生物学特性不同分为根据细胞培养物的生物学特性不同分为:动物细胞培养的类型动物细胞培养的类型slides from CDC倒置显微镜倒置显微镜ABA A 上皮细胞上皮细胞 B B 成纤维细胞成纤维细胞猪肺泡巨噬细胞猪肺泡巨噬细胞体外培养的细胞按其形态可分为：体外培养的细胞按其形态可分为：成纤维型细胞成纤维型细胞上皮型细胞上皮型细胞游走型细胞游走型细胞多形型细胞多形型细胞CDABAdenovirus(腺病毒)Uninfected epithelial cells A.early infe
21、ction B.late infection slides from CDCRespiratory syncytial virus呼吸道合胞病毒呼吸道合胞病毒Herpes simplex virus单纯疱疹病毒单纯疱疹病毒Uninfected fibroblastic cellsA.early infection B.late infectionslides from CDCPoliovirus 脊髓灰质炎病毒脊髓灰质炎病毒二、原代细胞制备的原理二、原代细胞制备的原理 应用胰酶等分散剂将动物组织消应用胰酶等分散剂将动物组织消化成单个细胞悬液，适当洗涤以后，化成单个细胞悬液，适当洗涤以后，加入营
22、养液，通常可使其贴附于玻璃加入营养液，通常可使其贴附于玻璃瓶壁上，并生长增殖。瓶壁上，并生长增殖。三、材料三、材料1.9-121.9-12日龄鸡胚日龄鸡胚2.2.照蛋灯与蛋座照蛋灯与蛋座3.3.碘酊棉球与酒精棉球碘酊棉球与酒精棉球4.4.眼科剪、小镊子眼科剪、小镊子5.5.平皿、细菌瓶、吸管、吸球、细胞瓶平皿、细菌瓶、吸管、吸球、细胞瓶 6.0.25%6.0.25%胰酶胰酶7.7.基础培养液：基础培养液：DMEMDMEM或者生理盐水或者生理盐水 生长液：含生长液：含10%10%犊牛血清、犊牛血清、200U/ml200U/ml青霉素、青霉素、200200g/mlg/ml链霉素的链霉素的DMEMD
23、MEM 使精氨酸或赖氨酸的羧基和其他氨基酸使精氨酸或赖氨酸的羧基和其他氨基酸的氨基之间的多肽链发生水解，导致细胞间的氨基之间的多肽链发生水解，导致细胞间质水解而使细胞或组织块消化为分散的单个质水解而使细胞或组织块消化为分散的单个细胞。细胞。四、胰酶的作用机制四、胰酶的作用机制 五、血清五、血清1.1.血清的作用血清的作用 提供细胞生存、生长和增生所必须的生长调节因子提供细胞生存、生长和增生所必须的生长调节因子 补充基础培养液中没有或量不足的营养成分补充基础培养液中没有或量不足的营养成分 促进细胞贴壁促进细胞贴壁 提供载体蛋白，可结合维生素、脂质、金属离子等提供载体蛋白，可结合维生素、脂质、金属
24、离子等 中和毒性物质中和毒性物质 良好的缓冲系统良好的缓冲系统 提供蛋白酶抑制剂提供蛋白酶抑制剂2.2.血清的种类血清的种类 胎牛血清、新生犊牛血清、胎牛血清、新生犊牛血清、成年牛血清、成年牛血清、马血清、鸡血清、兔血清、羊血清、人血清马血清、鸡血清、兔血清、羊血清、人血清3.3.血清的处理血清的处理 无菌采集，过滤除菌。用前无菌采集，过滤除菌。用前5656灭活灭活30min30min。六、细胞培养的条件要求六、细胞培养的条件要求1 1）细胞密度）细胞密度原代细胞：原代细胞：4-64-610105 5个个/ml/ml传代细胞：传代细胞：2-32-310105 5个个/ml/ml2 2）pHpH
25、范围：最适范围：最适pH7.0-7.4pH7.0-7.4，耐受，耐受pH6.6-7.8pH6.6-7.83 3）培养温度）培养温度七、操作步骤七、操作步骤1.1.取取9-129-12日龄孵育良好的鸡胚，依次用碘酊和日龄孵育良好的鸡胚，依次用碘酊和酒精消毒气室部。酒精消毒气室部。2.2.无菌操作下用剪子去除气室部卵壳和壳膜，无菌操作下用剪子去除气室部卵壳和壳膜，穿破绒毛尿囊膜，夹住鸡胚颈部，取出鸡胚穿破绒毛尿囊膜，夹住鸡胚颈部，取出鸡胚放于灭菌平皿中。放于灭菌平皿中。3.3.用眼科剪、镊去除鸡胚头、四肢及内脏用眼科剪、镊去除鸡胚头、四肢及内脏（内脏（内脏颜色偏深）颜色偏深）。在平皿的一角加入。在
26、平皿的一角加入2ml2ml左右生理盐左右生理盐水冲冼鸡胚，同样方法重复一次。水冲冼鸡胚，同样方法重复一次。4.4.将冲洗后的鸡胚移入新的平皿中，在边角处用将冲洗后的鸡胚移入新的平皿中，在边角处用剪子充分剪碎，使其近于乳糜状剪子充分剪碎，使其近于乳糜状(至少至少10min10min以上）以上）（不能将胚体放在生理盐水中，否则很难剪（不能将胚体放在生理盐水中，否则很难剪碎）碎）5.5.将剪碎的组织块倒入细菌瓶中，加入将剪碎的组织块倒入细菌瓶中，加入5ml5ml生理生理盐水，振摇几次，静置盐水，振摇几次，静置2-32-3分钟，分钟，吸弃洗液。吸弃洗液。如此重复如此重复1 1次。次。6.6.加加5mL
27、5mL预热的胰酶，在预热的胰酶，在3737水浴中消化水浴中消化20-20-30min30min，每隔，每隔5min5min轻轻摇动轻轻摇动1 1次，使细胞消化完次，使细胞消化完全（组织块变松散，沉降渐变缓慢时即表示消全（组织块变松散，沉降渐变缓慢时即表示消化足够）。化足够）。7.7.消化好后，取出瓶子，静置约消化好后，取出瓶子，静置约2-32-3分钟，分钟，吸弃吸弃胰蛋白酶液。胰蛋白酶液。8.8.加加DMEMDMEM生长液生长液5ml5ml，轻轻摇动几次后，轻轻摇动几次后，静置静置2-2-3 3分钟吸去分钟吸去。如此重复一次。如此重复一次。9.9.加入生长液加入生长液5ml5ml，以粗口吸管吹
28、吸数次，使细，以粗口吸管吹吸数次，使细胞脱落分散，静置胞脱落分散，静置2-32-3分钟，使未消化好的组分钟，使未消化好的组织块下沉织块下沉（沉降时间不要过长）（沉降时间不要过长）。10.10.轻轻轻轻吸取上层细胞悬液于细胞培养瓶中吸取上层细胞悬液于细胞培养瓶中，每，每瓶约瓶约0.5-1ml0.5-1ml（根据鸡胚大小和消化程度确定）（根据鸡胚大小和消化程度确定），补加补加DMEMDMEM生长液至生长液至6ml6ml，使细胞量约为，使细胞量约为4-4-6 610105 5个个/ml/ml，盖上盖子，置于，盖上盖子，置于3737恒温箱中恒温箱中培养。培养。11.11.细胞计数方法细胞计数方法 取细
29、胞悬液取细胞悬液0.5ml+2ml 0.1%0.5ml+2ml 0.1%结晶紫结晶紫枸椽酸（枸椽酸（0.1mol/L0.1mol/L）溶液，室温或）溶液，室温或3737温箱中温箱中5-10min5-10min，充分，充分振荡后进行计数。振荡后进行计数。按白细胞计数法计算按白细胞计数法计算4 4角角4 4个大方格内的细胞总个大方格内的细胞总数（数（N N）。）。每每mlml悬液中的细胞数（悬液中的细胞数（n n）=N/4=N/41000010000K K（稀（稀释倍数）。释倍数）。血细胞计数板血细胞计数板表示可计数表示可计数表示不计数表示不计数八、实验思考题八、实验思考题吸管的使用。吸管的使用。
30、胰酶用于细胞消化的原理是什么胰酶用于细胞消化的原理是什么?鸡胚成纤维细胞制备过程中要注意哪些鸡胚成纤维细胞制备过程中要注意哪些事项？事项？血清用于细胞培养的优缺点？血清用于细胞培养的优缺点？细胞培养的基本条件细胞培养的基本条件?实验三实验三 传代细胞的培养与细胞活力检测传代细胞的培养与细胞活力检测（以猪肾细胞（以猪肾细胞IBRS-2IBRS-2为例）为例）了解不同传代细胞的形态以及传代方法了解不同传代细胞的形态以及传代方法 掌握掌握IBRS-2IBRS-2细胞的传代方法细胞的传代方法 掌握细胞活力测定的操作步骤、计算方掌握细胞活力测定的操作步骤、计算方法及含义法及含义 一、实验目的一、实验目的
31、细胞培养的基本概念细胞培养的基本概念 细胞在培养器皿中生长一定时间后，被分细胞在培养器皿中生长一定时间后，被分开接种到新的培养器皿中。培养细胞的开接种到新的培养器皿中。培养细胞的“一代一代”，不表示细胞分裂一次，而是指，不表示细胞分裂一次，而是指培养细胞从接种到再次转移培养的过程。培养细胞从接种到再次转移培养的过程。在一次传代培养中，细胞能倍增在一次传代培养中，细胞能倍增3-63-6次。次。培养细胞的特性培养细胞的特性 培养细胞的生长方式：培养细胞的生长方式：贴附生长：贴附生长：必须贴附于支持物表面才能生长。多必须贴附于支持物表面才能生长。多为各种实体瘤细胞为各种实体瘤细胞 悬浮生长：悬浮生长
32、：于悬浮状态下即可生长，不需要贴附于悬浮状态下即可生长，不需要贴附于支持物表面。多为各种造血系统肿瘤细胞于支持物表面。多为各种造血系统肿瘤细胞 每代贴附生长细胞的生长过程：每代贴附生长细胞的生长过程：游离期；贴壁期；潜伏期；对数生长期；停止期游离期；贴壁期；潜伏期；对数生长期；停止期（平台期）（平台期）游离期：游离期：细胞接种后在培养基中呈悬浮状态，也称悬浮期。细胞接种后在培养基中呈悬浮状态，也称悬浮期。此时细胞质回缩，胞体呈圆球形。此时细胞质回缩，胞体呈圆球形。1010分钟分钟-5 5 小时。小时。贴壁期：贴壁期：细胞附着于底物上，游离期结束。大部分细胞株在细胞附着于底物上，游离期结束。大部
33、分细胞株在 1010分钟分钟5 5 小时内贴壁。小时内贴壁。潜伏期：潜伏期：此时细胞有生长活动，而无细胞分裂。细胞株潜伏此时细胞有生长活动，而无细胞分裂。细胞株潜伏期一般为期一般为6 62424小时。小时。对数生长期：对数生长期：细胞数随时间变化成倍增长，活力最佳，细胞数随时间变化成倍增长，活力最佳，最适最适合进行实验研究。合进行实验研究。停止期（平台期）：停止期（平台期）：细胞长满瓶壁后，细胞虽有活力但不再细胞长满瓶壁后，细胞虽有活力但不再分裂。分裂。细胞培养中的污染细胞培养中的污染1 1、细菌污染、细菌污染细菌污染是实验室细胞培养中常见的污染，即使在细菌污染是实验室细胞培养中常见的污染，即
34、使在细胞培养基中加入了抗生素，也可能因为操作不慎细胞培养基中加入了抗生素，也可能因为操作不慎而引起污染。而引起污染。培养细胞受细菌污染后，培养细胞受细菌污染后，会出现培养基变混浊会出现培养基变混浊，pHpH改变。污染后细胞发生病理改变，胞内颗粒增多、改变。污染后细胞发生病理改变，胞内颗粒增多、增粗，最后变圆脱落死亡。增粗，最后变圆脱落死亡。2 2、真菌污染、真菌污染真菌污染是细胞培养过程中最常见的一种，培养真菌污染是细胞培养过程中最常见的一种，培养细胞受真菌污染后，可见培养基中漂浮着白色或细胞受真菌污染后，可见培养基中漂浮着白色或浅黄色的小点，有的散在生长，浅黄色的小点，有的散在生长，培养基一
35、般不发培养基一般不发生混浊。生混浊。倒置显微镜下可见倒置显微镜下可见丝状、管状或树枝状的菌丝丝状、管状或树枝状的菌丝纵纵横交错在细胞之间或培养基中，有的呈链状排列。横交错在细胞之间或培养基中，有的呈链状排列。真菌污染后，细胞生长变慢，但最后由于营养耗真菌污染后，细胞生长变慢，但最后由于营养耗尽及毒性作用而使细胞脱落死亡。尽及毒性作用而使细胞脱落死亡。3 3、支原体污染、支原体污染4 4、病毒污染、病毒污染5 5、非同种细胞污染、非同种细胞污染 二、材料二、材料1.1.吸管、吸球吸管、吸球2.2.IBRS-2IBRS-2细胞一瓶细胞一瓶3.3.0.25%0.25%胰酶胰酶4.4.生长液（含生长液
36、（含10%10%血清）血清）5.5.台盼蓝（台盼蓝（0.4%0.4%）6.6.细胞计数板细胞计数板消化液消化液 (胰蛋白酶或者胰酶）胰蛋白酶或者胰酶）胰蛋白酶作用于与赖氨酸或精氨酸相连接的肽键，除去细胞间胰蛋白酶作用于与赖氨酸或精氨酸相连接的肽键，除去细胞间粘蛋白及糖蛋白，影响细胞之间以及细胞和底物的粘连，从而粘蛋白及糖蛋白，影响细胞之间以及细胞和底物的粘连，从而使细胞分离。使细胞分离。胰蛋白酶液浓度越高，作用越强，但超过一定限度会损伤细胞。胰蛋白酶液浓度越高，作用越强，但超过一定限度会损伤细胞。胰蛋白酶是一种黄白色粉末，用无胰蛋白酶是一种黄白色粉末，用无CaCa、MgMg离子的离子的PBS
37、PBS 缓冲液配缓冲液配制，常用的胰蛋白酶液浓度是制，常用的胰蛋白酶液浓度是0.25 0.25，0.22 0.22 m m滤膜过滤除菌。滤膜过滤除菌。胰蛋白酶液消化时间：细胞种类不同消化时间也不一样，一般胰蛋白酶液消化时间：细胞种类不同消化时间也不一样，一般是是1-10 1-10 分钟。含血清的培养基可以终止胰蛋白酶对细胞的消化分钟。含血清的培养基可以终止胰蛋白酶对细胞的消化作用。作用。血清血清 常用血清有胎牛血清、新生牛血清、小牛血清、兔血清、常用血清有胎牛血清、新生牛血清、小牛血清、兔血清、马血清等，其中以胎牛血清质量最好。马血清等，其中以胎牛血清质量最好。优质血清的标准：透明，淡黄色，无
38、沉淀物，无细菌、优质血清的标准：透明，淡黄色，无沉淀物，无细菌、支原体、病毒污染。支原体、病毒污染。非胎牛血清需要灭活以减少补体和支原体的影响：非胎牛血清需要灭活以减少补体和支原体的影响：5656，3030分钟。分钟。CO2培养箱 超净工作台 实验设备与器材实验设备与器材倒置显微镜滤 器超纯水仪培养瓶、培养板、培养皿 三、常用传代细胞的种类三、常用传代细胞的种类BHK-21BHK-21：仓鼠肾传代细胞：仓鼠肾传代细胞PK-15PK-15：猪肾传代细胞：猪肾传代细胞IBRS-2IBRS-2：猪肾传代细胞：猪肾传代细胞HelaHela：人的子宫瘤细胞：人的子宫瘤细胞VeroVero：非洲绿猴肾细胞
39、：非洲绿猴肾细胞Marc-145Marc-145：来源于：来源于VeroVero细胞细胞MDCKMDCK：犬肾细胞：犬肾细胞TKTK-143143：胸苷激酶阴性细胞：胸苷激酶阴性细胞Sf9Sf9：昆虫细胞：昆虫细胞IBRS-2PK-15Marc-145BHK-21 四、传代细胞培养的条件要求四、传代细胞培养的条件要求细胞密度：细胞密度：2-32-310105 5个个/ml/mlpHpH范围：最适范围：最适pH7.0-7.4pH7.0-7.4，耐受，耐受pH6.6-7.8pH6.6-7.8培养温度培养温度 哺乳动物细胞一般为哺乳动物细胞一般为3737 昆虫细胞昆虫细胞28-3028-30 五、传
40、代细胞系培养方法五、传代细胞系培养方法第一次开始培养某种细胞时，一定要查清楚第一次开始培养某种细胞时，一定要查清楚关于该种细胞的详细信息关于该种细胞的详细信息，包括需要使用的，包括需要使用的培养基、血清、添加剂，通常的消化时间、培养基、血清、添加剂，通常的消化时间、传代时间等。传代时间等。IBRS-2IBRS-2细胞是猪肾传代细胞系，染色体已发细胞是猪肾传代细胞系，染色体已发生改变，不再保持原细胞的二倍体组型，可生改变，不再保持原细胞的二倍体组型，可以无限地传代以无限地传代贴壁较紧，消化时间较长贴壁较紧，消化时间较长1.1.取长满单层的细胞一瓶，倾去培养液。取长满单层的细胞一瓶，倾去培养液。2
41、.2.加入加入1ml 1ml 胰酶轻摇细胞瓶，静置胰酶轻摇细胞瓶，静置1min1min，洗掉漂浮，洗掉漂浮的和贴壁不紧的细胞，弃去胰酶；重复一次，将的和贴壁不紧的细胞，弃去胰酶；重复一次，将细胞瓶倒置放入温箱中消化细胞瓶倒置放入温箱中消化3.3.消化消化5min5min左右左右，加入，加入6ml6ml生长液，反复吹打几次，生长液，反复吹打几次，使细胞分散成单个细胞，丢掉部分细胞，使细胞分散成单个细胞，丢掉部分细胞，留下留下2ml2ml细胞（细胞（1:31:3传）传）4.4.加入生长液补足加入生长液补足6ml6ml，然后置，然后置3737培养箱培养，培养箱培养，培养培养2 2天天左右即可长成单层
42、。左右即可长成单层。操作步骤：操作步骤：在细胞群体中总有一些因各种原因而死亡的在细胞群体中总有一些因各种原因而死亡的细胞，总细胞中活细胞所占的百分比叫做细胞活细胞，总细胞中活细胞所占的百分比叫做细胞活力，力，细胞培养过程中有时需要测定细胞的活力以细胞培养过程中有时需要测定细胞的活力以了解细胞的生长状态。了解细胞的生长状态。此外，由组织中分离细胞此外，由组织中分离细胞一般也要检查活力，以了解分离的过程对细胞是一般也要检查活力，以了解分离的过程对细胞是否有损伤作用。复苏后的细胞也要检查活力，了否有损伤作用。复苏后的细胞也要检查活力，了解冻存和复苏的效果。解冻存和复苏的效果。六、细胞活力检测的原理六
43、、细胞活力检测的原理 细胞活力分析可以测定细胞悬液中存活细胞的百细胞活力分析可以测定细胞悬液中存活细胞的百分比。一般通过染料排除的染色方法实现，即具分比。一般通过染料排除的染色方法实现，即具有完整细胞膜的细胞能够将染料排除在外从而不有完整细胞膜的细胞能够将染料排除在外从而不被染色，而不具备完整细胞膜的细胞则能够吸收被染色，而不具备完整细胞膜的细胞则能够吸收染料而被染色。染料而被染色。用于排除染色法的染料通常用于排除染色法的染料通常选择台盼蓝，但是赤选择台盼蓝，但是赤藓红和萘黑也常被使用藓红和萘黑也常被使用。吸收染料的染色方法也可以用于测定细胞活力。吸收染料的染色方法也可以用于测定细胞活力。这种
44、情况下，染料被活细胞正常吸收，而死细胞这种情况下，染料被活细胞正常吸收，而死细胞则不会。则不会。七、细胞活力检测的步骤七、细胞活力检测的步骤1.1.吸取吸取100 uL100 uL重悬的细胞到重悬的细胞到1.5mlEP1.5mlEP管内，加入管内，加入100 uL100 uL台盼蓝染色液，台盼蓝染色液，轻轻混匀，染色轻轻混匀，染色3 3分钟分钟2.2.取洁净的血球计数板一块，在计数区上盖上一块盖玻取洁净的血球计数板一块，在计数区上盖上一块盖玻片。片。3.3.吸取少许染色后的细胞，吸取少许染色后的细胞，从计数板中间平台两侧的沟从计数板中间平台两侧的沟槽内沿盖玻片的下边缘滴入一小滴（槽内沿盖玻片的
45、下边缘滴入一小滴（不宜过多不宜过多），），让让细胞悬液利用液体的表面张力充满计数区（细胞悬液利用液体的表面张力充满计数区（勿使气泡勿使气泡产生产生），并用吸水纸吸去沟槽中流出的多余细胞悬液。），并用吸水纸吸去沟槽中流出的多余细胞悬液。替代方法：替代方法：吸取少量经过染色的细胞，将细胞吸取少量经过染色的细胞，将细胞悬液滴入一小滴在计数区上（不要使计数区两边平悬液滴入一小滴在计数区上（不要使计数区两边平台沾上细胞悬液，以免加盖盖玻片后，造成计数区台沾上细胞悬液，以免加盖盖玻片后，造成计数区深度的升高），然后加盖盖玻片（勿使产生气泡）。深度的升高），然后加盖盖玻片（勿使产生气泡）。滴入一小滴细胞悬液
46、滴入一小滴细胞悬液滴入一小滴细胞悬液滴入一小滴细胞悬液4.4.计数时，先用低倍镜，光线要稍暗些，找到计数室的计数时，先用低倍镜，光线要稍暗些，找到计数室的格后，把中央的大方格置于视野之中，然后转用高倍格后，把中央的大方格置于视野之中，然后转用高倍镜。镜。5.5.计数区是由计数区是由1616个中方格组成，按对角线方位，数左上、个中方格组成，按对角线方位，数左上、左下、右上、右下的左下、右上、右下的4 4个区域的蓝色细胞和细胞总数。个区域的蓝色细胞和细胞总数。（计数时间不要太长，否则活计数时间不要太长，否则活 细胞也会死亡并开始吸收染料）细胞也会死亡并开始吸收染料）细胞存活率细胞存活率(细胞总数蓝
47、色细胞数细胞总数蓝色细胞数)/)/细胞总数细胞总数100%100%八、思考题八、思考题传代细胞传代的注意事项传代细胞传代的注意事项细胞活力检测的原理细胞活力检测的原理细胞培养过程中常见污染物，如何避免污染细胞培养过程中常见污染物，如何避免污染传代细胞的培养条件传代细胞的培养条件实验四实验四 病毒病毒TCID50的测定的测定 了解病毒感染力测定的几种方法了解病毒感染力测定的几种方法 掌握病毒接种方法及收毒方法掌握病毒接种方法及收毒方法 掌握半数细胞培养物感染量掌握半数细胞培养物感染量(TCID(TCID50 50)的的操作步骤、计算方法及含义操作步骤、计算方法及含义 一、实验目的一、实验目的 二
48、、材料二、材料1.1.吸管、吸球、吸管、吸球、9696孔细胞培养板、加样器、吸头孔细胞培养板、加样器、吸头2.2.PK-15PK-15细胞一瓶细胞一瓶3.3.0.25%0.25%胰酶胰酶4.4.生长液（含生长液（含10%10%血清）、维持液（含血清）、维持液（含2%2%血清）血清）5.5.伪狂犬病病毒液（伪狂犬病病毒液（PRVPRV）三、病毒在细胞中的培养三、病毒在细胞中的培养选长满单层的细胞，倒掉培养液。选长满单层的细胞，倒掉培养液。加入适量的病毒悬液加入适量的病毒悬液置温箱中感作（吸附）置温箱中感作（吸附）45min-1h45min-1h。取出瓶子，倒掉或不倒掉病毒液，补足维取出瓶子，倒掉
49、或不倒掉病毒液，补足维持液，置温箱中继续培养，直至细胞病变。持液，置温箱中继续培养，直至细胞病变。收毒：将病变的细胞置于收毒：将病变的细胞置于-20-20冰箱中，冰箱中，冻结后取出自然解冻，在解冻过程中要冻结后取出自然解冻，在解冻过程中要振摇几次，以使细胞完全从瓶壁上脱落振摇几次，以使细胞完全从瓶壁上脱落（尤其对于贴壁比较紧的细胞）。离心（尤其对于贴壁比较紧的细胞）。离心去除细胞碎片，然后将病毒液收集于盐去除细胞碎片，然后将病毒液收集于盐水瓶或其它容器中。低温贮藏备用。水瓶或其它容器中。低温贮藏备用。分离野毒：如果怀疑病料中有可能有细分离野毒：如果怀疑病料中有可能有细菌污染，建议收毒过程中过滤
50、除菌菌污染，建议收毒过程中过滤除菌A A 正常正常IBRS-2IBRS-2BAB B 消化的消化的IBRS-2IBRS-2AA A 正常正常PK-15 PK-15 B B 消化的消化的PK-15PK-15C C 感染感染PRVPRV的的PK-15PK-15CB接种接种PRVPRV后不同时间的后不同时间的PK-15PK-15BA 首先是细胞的透明度降低，随后质内颗粒增加且收缩，由梭形细胞逐渐变为圆形，细胞与细胞之间仅由纤细的细胞间桥连接，细胞单层呈网状结构，进一步细胞间桥也随之消失，细胞脱落。正常正常Marc-145Marc-145细胞细胞 消化的消化的Marc-145Marc-145细胞细胞
