1、第五章 固相析出分离法目的：目的：(浓缩；浓缩；(初步纯化初步纯化 ；(将已纯化的将已纯化的产品由液态变成固态产品由液态变成固态，加以保存或进一步处理。，加以保存或进一步处理。固相析出法是最古老的分离和纯化生物物质的方法，但目前固相析出法是最古老的分离和纯化生物物质的方法，但目前仍广泛应用在工业上和实验室中。仍广泛应用在工业上和实验室中。概述n固相析出分离法：生化物质目的物经常作为溶质存在于溶液中，改变溶液条件，使它以固体形式从溶液中分离的操作技术。n 固相析出操作常在发酵液经过过滤和离心（除固相析出操作常在发酵液经过过滤和离心（除去不溶性杂质及细胞碎片）以后进行，得到的沉去不溶性杂质及细胞碎
2、片）以后进行，得到的沉析物可直接干燥制得成品或经进一步提纯，如透析物可直接干燥制得成品或经进一步提纯，如透析、超滤、层析或结晶制得高纯度生化产品。析、超滤、层析或结晶制得高纯度生化产品。固相析出法不仅用于实验室中，因其不需专门设备，且固相析出法不仅用于实验室中，因其不需专门设备，且易于放大，也广泛用于生产的制备过程，易于放大，也广泛用于生产的制备过程，是分离纯化生物大分子，特别是制备蛋白质和酶时最常是分离纯化生物大分子，特别是制备蛋白质和酶时最常用的方法。用的方法。盐析法 有机溶剂沉淀法固相析出法 等电点沉淀法 结晶法 其它多种沉淀法n结晶法：析出物为晶体。n沉淀法：析出物为无定形固体。固相析
3、出法分类固相析出法分类n第一节 盐析法n第二节 有机溶剂沉淀法n第三节 其它沉淀方法n第四节 结晶第一节 盐析法n一、基本原理n二、影响因素n三、盐析操作定义：盐析法是利用各种生物定义：盐析法是利用各种生物分子分子在浓盐溶液中溶解度的在浓盐溶液中溶解度的差异差异，通过向溶液中引入一，通过向溶液中引入一定数量的中性盐，使定数量的中性盐，使目的物目的物或或杂蛋白杂蛋白以沉淀以沉淀析出析出，达到，达到纯化目的的方法。纯化目的的方法。优点：简单、经济、较少变性优点：简单、经济、较少变性缺点：分辨率不高；沉淀含大缺点：分辨率不高；沉淀含大量盐析剂，要除盐；产生氨量盐析剂，要除盐；产生氨的恶臭的恶臭7两种
4、现象：两种现象：盐溶盐溶：低盐情况，：低盐情况，盐离子强度的增盐离子强度的增高，蛋白质溶解高，蛋白质溶解度增大度增大盐析盐析：高盐，盐离：高盐，盐离子强度增加，蛋子强度增加，蛋白质白质溶解度减小溶解度减小82023-2-6南京农业大学南京农业大学 生命科学学院生命科学学院92023-2-6南京农业大学南京农业大学 生命科学学院生命科学学院10一、基本原理一、基本原理11盐析作用（salting out）原理n破坏双电层：q在高盐溶液中，带大量电荷的盐离子能中和蛋白质表面的电荷，使蛋白质分子之间电排斥作用相互减弱而能相互聚集起来。n破坏水化层：q中性盐的亲水性比蛋白质大，盐离子在水中发生水化而使
5、蛋白质脱去了水化膜，暴露出疏水区域，由于疏水区域的相互作用，使其沉淀。loglogS S=-K Ks s S S蛋白质溶解度蛋白质溶解度，g/Lg/L；盐离子强度盐离子强度,C Ci ii i离子浓度，离子浓度，mol/Lmol/L；Z Zi ii i离子化合价；离子化合价；常数常数,为纵坐标上的截距为纵坐标上的截距;K Ks s盐析常数盐析常数。132.52.01.51.00.50-0.5-1.0-1.51 2 3 4 5 6logSS0 盐析和盐析和K KS S盐析盐析右图示：盐离子浓度与蛋白质溶解度关系曲线，在盐析区，符合公式n两种类型：两种类型：（1 1）在一定的）在一定的pHpH和温
6、度下改变离子强度（盐浓度）和温度下改变离子强度（盐浓度）进行盐析，称作进行盐析，称作KsKs盐析法盐析法。由于蛋白质对离子强度的变化非常敏感，易产生由于蛋白质对离子强度的变化非常敏感，易产生共沉淀现象，因此常用于提取液的前处理。共沉淀现象，因此常用于提取液的前处理。（2 2）在一定离子强度下仅改变）在一定离子强度下仅改变pHpH和温度进行盐析，和温度进行盐析，称作称作盐析法盐析法。由于溶质溶解度变化缓慢，且变化幅度小，因此由于溶质溶解度变化缓慢，且变化幅度小，因此分辨率更高，后期分离（结晶）分辨率更高，后期分离（结晶）14二、影响盐析的因素二、影响盐析的因素1.无机盐的种类在相同离子强度下，盐
7、的种类对蛋白质溶解度的影响有在相同离子强度下，盐的种类对蛋白质溶解度的影响有一定差异，一般的规律为：半径小的高价离子的盐析作一定差异，一般的规律为：半径小的高价离子的盐析作用较强，半径大的低价离子作用较弱用较强，半径大的低价离子作用较弱阴离子盐析效果阴离子盐析效果 ：柠檬酸柠檬酸POPO4 43-3-SOSO4 42-2-CHCH3 3COOCOO-ClCl-NONO3 3-SCNSCN-阳离子盐析效果：阳离子盐析效果：NHNH4 4+K K+NaNa+高价阳离子高价阳离子阴离子的影响大于阳离子阴离子的影响大于阳离子l盐析用盐的选择盐析中常用的盐：硫酸铵、硫酸钠、磷酸钾、磷酸钠盐析中常用的盐：
8、硫酸铵、硫酸钠、磷酸钾、磷酸钠硫酸铵是最常用的蛋白质盐析沉淀剂硫酸铵是最常用的蛋白质盐析沉淀剂u（1 1）价廉价廉 ；u（2 2）溶解度大，温度系数小，许多蛋白质可以盐析出来；溶解度大，温度系数小，许多蛋白质可以盐析出来；u（3 3）硫酸铵分段盐析效果也比其他盐好，）硫酸铵分段盐析效果也比其他盐好，u（4 4）不易引起蛋白质变性。）不易引起蛋白质变性。n缺点：n（1）水解变酸；n（2）高pH 释氨，腐蚀；n（3）残留产品有影响。n不同种类蛋白质所需的无机盐量不同n先后加入不同量无机盐分级沉淀蛋白质2.溶质（蛋白质等）种类：Ks、血 纤 维蛋 白 原碳 氧 血红 蛋 白血 清 白蛋 白拟 球 蛋
9、 白碳 氧 肌红 蛋 白0.500-0.50-1.000 2 4 6 8 10log S不同蛋白溶解度与离子强度的关系盐析分布曲线盐析分布曲线19n蛋白质浓度不同：所需无机盐用量不同n蛋白质浓度高：所需无机盐量少n制成品：可适当高浓度，但浓度过高，易共沉淀n重叠蛋白分级：适当稀释，共沉淀小，但回收率降低。3.溶质（蛋白质等）浓度：23%-d dSP10987654321040 50 60 70 80P30g/L 3g/L不同浓度碳氧肌红蛋白的盐析分布曲线n无机或稀盐溶液：T蛋白质溶解度n高盐溶液：T蛋白质溶解度n蛋白质：室温盐析n对温度敏感的酶，0C4C4.温度：210log S2 3 4 2
10、50pH6.6温度对溶解度的影响5.pH：nPl盐析n注意高盐下pl的偏移：与负离子结合向低pH偏移，与正离子结合向高pH偏移n利用蛋白质pl的不同：可分级沉淀蛋白质卵清蛋白碳氧血红蛋白765432103 4 5 6 7 8pH三、盐析操作三、盐析操作1.盐析用盐的浓度表示硫酸铵的加入有以下几种方法：硫酸铵的加入有以下几种方法：1 1）加入固体盐法）加入固体盐法 用于要求饱和度较高而不增大溶液体积的情况；用于要求饱和度较高而不增大溶液体积的情况；工业上常采用这种方法，加入速度不能太快，应分批加入，并充分搅工业上常采用这种方法，加入速度不能太快，应分批加入，并充分搅拌，使其完全溶解和防止局部浓度
11、过高；拌，使其完全溶解和防止局部浓度过高；2 2）加入饱和溶液法）加入饱和溶液法 用于要求饱和度不高而原来溶液体积不大的情用于要求饱和度不高而原来溶液体积不大的情况；况；它可防止局部过浓，但加量较多时，料液会被稀释。它可防止局部过浓，但加量较多时，料液会被稀释。3 3）透析平衡法）透析平衡法 先将盐析的样品装于透析袋中，然后浸入饱和硫酸铵先将盐析的样品装于透析袋中，然后浸入饱和硫酸铵中进行透析，袋内饱和度逐渐提高，达到设定浓度后，目的蛋白析出。中进行透析，袋内饱和度逐渐提高，达到设定浓度后，目的蛋白析出。该法优点在于硫酸铵浓度变化有连续性，盐析效果好，但程序烦琐，该法优点在于硫酸铵浓度变化有连
12、续性，盐析效果好，但程序烦琐，故多用于结晶。故多用于结晶。盐析用盐量的盐析用盐量的表征表征-饱和度：饱和度：u目标蛋白质的盐析沉淀操作之前，所需的硫酸铵浓度目标蛋白质的盐析沉淀操作之前，所需的硫酸铵浓度或饱和浓度可通过实验确定。或饱和浓度可通过实验确定。u对多数蛋白质，当达到对多数蛋白质，当达到85%85%饱和度时，溶解度都小于饱和度时，溶解度都小于 0.l mg0.l mgL L，通常为兼顾收率与纯度，饱和度的操作，通常为兼顾收率与纯度，饱和度的操作范围在范围在40%-60%40%-60%之间。之间。调整硫酸铵溶液饱和度计算表调整硫酸铵溶液饱和度计算表n盐析方法：l1）分步盐析法(不同的盐浓
13、度)l2）重复盐析法l高蛋白质浓度下共沉淀重复盐析提高纯度l3）反抽提法(相同盐浓度)2、盐析方法和注意事项n分级盐析法n不断提高盐浓度：不同蛋白质分级沉淀n低饱和度：除杂蛋白，高饱和度：沉淀目的物血清血清球蛋白球蛋白清蛋白清蛋白(NH(NH4 4)2 2SOSO4 450%50%饱和度饱和度饱和饱和析出析出析出析出单酶盐析曲线双酶盐析曲线n反抽提法n共沉淀较低浓度盐溶液溶杂蛋白大肠杆菌RNA聚合酶的制备n防止“局部过浓”：慢加，搅拌n温度：不宜过低，室温1025C，易失活：010Cn时间：沉淀需经一段老化时间（1小时）后分离注意事项：第二节 有机溶剂沉淀法一、基本原理二、影响沉淀效果的因素l
14、有机溶剂对于许多蛋白质（酶）、核酸、多糖有机溶剂对于许多蛋白质（酶）、核酸、多糖和小分子生化物质都能发生沉淀作用，是较早和小分子生化物质都能发生沉淀作用，是较早使用的沉淀方法之一。使用的沉淀方法之一。l优点：优点：l1 1）分辨能力比盐析法高，即蛋白质等只在一个比较）分辨能力比盐析法高，即蛋白质等只在一个比较窄的有机溶剂浓度下沉淀；窄的有机溶剂浓度下沉淀；l2 2）溶剂易除去）溶剂易除去l3 3）沉淀不用脱盐，过滤较为容易；）沉淀不用脱盐，过滤较为容易；l缺点：缺点：l1 1）对具有生物活性的大分子容易引起变性失活，）对具有生物活性的大分子容易引起变性失活，l2 2）操作要求在低温下进行。）操
15、作要求在低温下进行。l3 3）成本高，）成本高，需需防火防爆防火防爆l总体来说，蛋白质和酶的有机溶剂沉淀法不如总体来说，蛋白质和酶的有机溶剂沉淀法不如盐析法普遍。盐析法普遍。一、基本原理n1、降低了介质的介电常数，使溶质分子之间的静电引力增加，聚集形成沉淀。n 2、水溶性有机溶剂本身的水合作用降低了自由水的浓度，压缩了亲水溶质分子表面原有水化层的厚度，降低了它的亲水性，导致脱水凝集。n脱水作用比静电作用强一些溶剂的介电常数一些溶剂的介电常数 35二、影响沉淀效果的因素1.有机溶剂种类及用量n能与水无限混溶n介电常数小、沉淀强n变性小n毒性小，挥发性适中常用：乙醇、丙酮（挥发肝毒性着火点低）和甲
16、醇（口服毒性）介电常数：无水乙醇24，甲醇33，丙酮22乙醇：沉析作用强，挥发性适中，无毒，常用于蛋白质、核酸、多糖等生物大分子的沉析；丙酮：沉析作用更强，用量省，但毒性大，应用范围不广；用量：（了解）2.pH的影响nPl附近、稳定性n控制溶液pH时务必使溶液中大多数蛋白质分子带有相同电荷，勿使目的物与杂质带异电荷导致共沉淀。n严格控制低温 有机溶剂与水混合时产生放热反应q预冷（有机溶剂-10以下，蛋白质0左右），q在冰盐浴中进行，q加入有机溶剂时必须缓慢且不断搅拌以免局部过浓变性，并散热。n温度影响有机溶剂对蛋白质的沉淀能力，一般温度越低，沉淀越完全。3.温度n低浓度缓冲液（0.01-0.0
17、5mol/L），0.2mol/L）：盐溶，增大蛋白质在有机溶剂水溶液中的溶解度，会增加溶媒用量，沉淀物中可能夹带盐，需除盐q常用的中性盐为醋酸钠、醋酸铵、氯化钠等。4.无机盐的含量5.某些金属离子的助沉淀作用nZn、Cu等与呈阴离子状态的蛋白质形成复合物，而活性不变，有助于沉淀，降低有机溶剂用量。n胰岛素精制：胰岛素精制：6.样品浓度n较稀：溶剂量，收率，稀释变性n较高：共沉淀，分辨率，溶剂量，回收率，变性小n蛋白质初浓度：0.5%2%n粘多糖：12%举例：固体发酵生产举例：固体发酵生产-淀粉酶的提取工艺研究淀粉酶的提取工艺研究 -淀粉酶（米曲霉）菌体淀粉酶（米曲霉）菌体+水水 过滤过滤 水抽
18、提清液水抽提清液 加乙醇（加乙醇（70%）搅拌）搅拌 -淀粉酶淀粉酶*pH影响影响 收率收率%酶活酶活 收率收率 酶活酶活 6.5 pH *适宜的适宜的pH 5.6 6.0 *温度影响温度影响 收率收率%酶活酶活 酶活酶活 收率收率 10 20 T *适宜的温度适宜的温度10 20 第三节 其它沉淀方法n一、等电点沉淀n二、成盐沉淀法n三、亲和沉淀n四、高分子聚合物沉淀法n五、表面活性剂沉淀法一、等电点沉淀法原理：nPl时分子表面静电荷为零，双电层及水化膜的削弱或破坏，分子间引力增加，溶解度降低。n常与盐析法、有机溶剂沉淀法或其他沉淀剂一起配合使用。n主要：去除杂蛋白，而不用于沉淀目的物。二、
19、成盐沉淀法n1.金属离子沉淀n所用的金属离子，包括MnMn2+2+、FeFe2+2+、CoCo2+2+、NiNi2+2+、ZnZn2+2+、CaCa2+2+、BaBa2+2+、MgMg2+2+等。n蛋白质和酶分子中因为含有羟基、氨基、咪唑基和硫氢基等，均可以和上述金属离子作用形成盐复合物。n分离沉淀复合物分解除金属离子（离子交换或金属螯合剂EDTA）n应用：目的蛋白分离，去杂质n缺点：有时复合物分解较困难，蛋白质易变性2.有机酸类复合盐 含氮有机酸如苦味酸、苦桐酸和鞣酸等能够与有机分子的碱性功能团形成复合物而沉淀析出。工业上用此法制备蛋白质时，需采取较温和的条件，有时还加入一定的稳定剂，以防止
20、蛋白质变性。n单宁：结合后牢固，竞争结合法分解n雷凡诺：不影响蛋白质活性n三氯乙酸（TCA）：变性，除杂蛋白雷凡诺雷凡诺 n 猪心提取液猪心提取液 洗脱液洗脱液 上清液上清液 上清上清 细胞色素细胞色素C C 沉淀（去除）沉淀（去除）吸附人造沸石盐析45%饱和硫酸铵沉淀TCA透析三、亲和沉淀法n配基+可溶性载体偶联成载体-配基复合物（亲和沉淀剂）n可选择性地与蛋白质结合而沉淀出来u它是利用蛋白质与特定的生物合成分子（免疫配它是利用蛋白质与特定的生物合成分子（免疫配位体、基质、辅酶等）之间高度专一的相互作用位体、基质、辅酶等）之间高度专一的相互作用而设计出来的一种特殊选择性的分离技术。而设计出来
21、的一种特殊选择性的分离技术。u所以所以其沉淀原理不是依据蛋白质溶解度的差异，其沉淀原理不是依据蛋白质溶解度的差异，而是依据而是依据“吸附吸附”有特殊蛋白质的聚合物的溶解有特殊蛋白质的聚合物的溶解度的大小。度的大小。亲亲 和和 沉沉 淀淀 过程过程n亲和过程提供了一个从复杂混合物中分离提取单亲和过程提供了一个从复杂混合物中分离提取单一产品的有效方法。一产品的有效方法。初始阶段，将一个目标初始阶段，将一个目标蛋白质蛋白质与键合在可溶性载与键合在可溶性载体上的体上的亲合配位体亲合配位体络和形成沉淀；络和形成沉淀；所得沉淀物用一种适当的缓冲溶液进行洗涤，所得沉淀物用一种适当的缓冲溶液进行洗涤，洗洗去去
22、可能存在的可能存在的杂质杂质；用一种适当的试剂将用一种适当的试剂将目标蛋白质目标蛋白质从配位体中离解从配位体中离解出来。出来。四、高分子聚合物沉淀法n水溶性非离子型高分子聚合物能使蛋白质水合作用减弱而发生沉淀。nPEG、壬苯乙烯化氮（NPEO)、葡聚糖n双水相或单高聚物q其中应用最多的是聚乙二醇。n无毒，对产品的影响小，但不易除去56五、表面活性剂沉淀法nCTAB（十六烷基三甲基季胺溴化物）、CPC(十六烷基氯化吡啶)：沉淀酸性多糖n与多糖上的阴离子形成形成季铵络合物，降低离子强度，络合物析出。nSDS：分离胰蛋白或核蛋白q目的是使核酸和蛋白质分离，蛋白质变性沉淀，核酸则存在于水溶液中。讨论：
23、咸鸭蛋煮熟了，蛋黄里会有油，这是什么缘故？n熟鸭蛋蛋黄中脂肪的含量高达熟鸭蛋蛋黄中脂肪的含量高达3131，为什么看，为什么看不到一点油？可是在熟咸蛋的蛋黄中，却经常不到一点油？可是在熟咸蛋的蛋黄中，却经常可以看到黄色的油滴往外流？可以看到黄色的油滴往外流？n蛋黄中除了脂肪以外，还含有丰富的蛋白质，蛋白质蛋黄中除了脂肪以外，还含有丰富的蛋白质，蛋白质就是一种高明的乳化剂，它能够把蛋黄中的脂肪分散就是一种高明的乳化剂，它能够把蛋黄中的脂肪分散成很小的油滴，这样就骗过了我们的眼睛和舌头。成很小的油滴，这样就骗过了我们的眼睛和舌头。n在盐渍过程中，作为乳化剂的蛋白质被盐析出来，乳在盐渍过程中，作为乳化
24、剂的蛋白质被盐析出来，乳浊液被破坏了，那些原来分散成极小的油滴，彼此就浊液被破坏了，那些原来分散成极小的油滴，彼此就互相聚集起来，变成大油液，使得整个蛋黄变成油滋互相聚集起来，变成大油液，使得整个蛋黄变成油滋滋的，甚至流出油来了。滋的，甚至流出油来了。第四节 结晶n定义：溶液中的溶质在一定条件下因分子有规则的排列而结合成晶体。q只有同类分子或离子才能排列成晶体，因此结晶过程有良好的选择性。q通过结晶，溶液中的大部分杂质会留在母液中，经过滤、洗涤可得到纯度高的晶体。一、结晶过程 二、过饱和溶液的形成 三、提高晶体质量的途径n饱和溶液：当溶液中溶质浓度等于该溶质在同等条件下的饱和溶解度时，该溶液称
25、为饱和溶液；n过饱和溶液：溶质浓度超过饱和溶解度时，该溶液称之为过饱和溶液；n溶质只有在过饱和溶液中才能析出；一、结晶过程1.概念n推动力：q形成新相（固体）需要一定的表面自由能。因此，溶液浓度达到饱和溶解度时，晶体尚不能析出，只有当溶质浓度超过饱和溶解度后，才可能有晶体析出。n晶核：q最先析出的微小颗粒是以后晶体的中心，称为晶核。q首先形成晶核，微小的晶核具有较大的溶解度。实质上，在饱和溶液中，晶核是处于一种形成溶解再形成的动态平衡之中，只有达到一定的过饱和度以后，晶核才能够稳定存在。2.晶体的形成结晶是指溶质自动从过饱和溶液中析出，形成新相的过程。条件：过程：n形成过饱和溶液n晶核形成n晶
26、体生长3.结晶曲线n稳定态：不沉淀结晶n亚稳定态：不自动生产结晶，加入晶体能诱导结晶。控制条件，让晶体缓慢长大。n不稳定态：自动沉淀结晶，大量细小结晶结晶操作通常都在亚稳区中进行结晶操作通常都在亚稳区中进行4.起晶方法自然起晶自然起晶 n把溶液蒸发把溶液蒸发浓缩至过饱浓缩至过饱和区（不稳和区（不稳定区），则定区），则有大量晶核有大量晶核自然形成。自然形成。n但晶核数量但晶核数量难以控制，难以控制，晶粒小。晶粒小。刺激起晶刺激起晶n把溶液蒸发至接近过饱和把溶液蒸发至接近过饱和线后把溶液放出，使溶液线后把溶液放出，使溶液突然冷却，进入过饱和区突然冷却，进入过饱和区形成大量晶核。形成大量晶核。n当晶
27、核达到一定数量后，当晶核达到一定数量后，回升温度，使溶液进入介回升温度，使溶液进入介稳区，停止晶核产生，然稳区，停止晶核产生，然后再慢慢冷却，同时搅拌，后再慢慢冷却，同时搅拌，使晶核长大。使晶核长大。晶种起晶晶种起晶n将溶液浓缩到介稳定区将溶液浓缩到介稳定区的饱和浓度后，加入一的饱和浓度后，加入一定大小和数量的晶种，定大小和数量的晶种，同时均匀搅拌，使晶体同时均匀搅拌，使晶体长大。长大。n优点：控制方便，产品优点：控制方便，产品晶体大小均匀。晶体大小均匀。二、过饱和溶液的形成（结晶方法）1.蒸发法q蒸发除去部分溶剂，在常压或减压下加热除去一部分溶剂，以达到或维持过饱和度。q适用于小分子化合物的
28、结晶，受热变性的蛋白质或酶类不宜采用。2.温度诱导法n通过升高或降低温度，使溶液逐渐达到饱和，可缓慢析出晶体。n热盒技术n耐热生化物质高温溶解温度逐渐下降析出晶体3.盐析结晶法n固体盐粉末、饱和盐溶液（中性盐）n蛋白质及酶类药物制备中常用方法4.透析结晶法72使溶解度的变化连续又缓慢5.有机溶剂结晶 常用的有机溶剂有乙醇、丙酮、甲醇、丁醇、异丙醇、乙腈、2、4二甲基戊二醇（MPO）等。蛋白质变性 溶剂回收6.等电点结晶7.微量扩散法n通过气相扩散使样品中溶质达到饱和晶体8.化学反应结晶法n调pH或加反应剂生成新物质结晶其实质是利用化学反应，对待结晶的物质进行修饰，一方面可以调节其溶解特性，同时
29、也可以进行适当的保护；9.共沸蒸馏结晶n共沸物的共沸点n真空下共沸点n真空低温下进行共沸蒸馏结晶n常多种方法综合应用n工业上通常希望得到工业上通常希望得到粗大而均匀粗大而均匀的晶体，便于的晶体，便于过滤与洗涤。过滤与洗涤。n晶体质量包括三个方面的内容：晶体质量包括三个方面的内容：晶体大小、形状和纯度晶体大小、形状和纯度三、提高晶体质量的途径n1）过饱和度q过饱和度值应大至使结晶操作控制在过饱和度值应大至使结晶操作控制在亚稳区亚稳区内，又内，又保持较高的晶体生长速率，使结晶高产而优质。保持较高的晶体生长速率，使结晶高产而优质。n2）温度（缓慢冷却）1.1.晶体大小晶体大小 快速冷却或蒸发快速冷却
30、或蒸发 大量细小的晶体大量细小的晶体 缓慢冷却或蒸发缓慢冷却或蒸发 大而均匀的晶体大而均匀的晶体 n3）搅拌速度：适当，不宜太快 搅拌的作用搅拌的作用:加速溶液的热传导，加快生产过程。加速溶液的热传导，加快生产过程。加速溶质扩散过程的速率，有利于晶体成长。加速溶质扩散过程的速率，有利于晶体成长。使溶液的温度均匀，防止溶液局部浓度不均，结垢等。使溶液的温度均匀，防止溶液局部浓度不均，结垢等。使晶核散布均匀，防止晶体粘连在一起形成晶簇，降低产品质量使晶核散布均匀，防止晶体粘连在一起形成晶簇，降低产品质量。n4）晶种：诱导结晶，控制晶体形状大小均匀度2.2.晶体形状晶体形状n晶体生长速度n过饱和度n
31、溶剂npH：pH的变化，可以改变溶质分子的带电性质，是影响溶质分子溶解度的一个重要因素。一般结晶液所选用的pH 与沉淀大致相同。n杂质3.3.晶体纯度晶体纯度n母液中的杂质n晶体越细小，杂质越多n洗涤有利提高纯度n结晶速度过快，易产生“晶蔟”，包含杂质 杂质杂质对对晶体的成长晶体的成长速率的影响较为复杂，有的杂质能抑制晶体速率的影响较为复杂，有的杂质能抑制晶体的成长，有的能促进成长，有的能改变晶型。的成长，有的能促进成长，有的能改变晶型。4.4.晶体结块晶体结块n原因：n粒度不齐、空气湿度高、温度高、受压、贮存时间增长n措施：n控制粒度分布、良好外形、干燥密闭容器贮存5.5.重结晶重结晶n晶体
32、用合适溶剂溶解后再次结晶，提高纯度n用于生物物质重结晶的溶剂一般有蒸馏水、丙酮、石油醚、乙酸乙酯、低级醇等。n结晶是分离纯化蛋白质、酶等生化产品的结晶是分离纯化蛋白质、酶等生化产品的一种有效手段一种有效手段。变性蛋白质不能结晶，所。变性蛋白质不能结晶，所以凡结晶状态的蛋白质都能保持天然状态。以凡结晶状态的蛋白质都能保持天然状态。2023-2-6南京农业大学南京农业大学 生命科学学院生命科学学院842023-2-684南京农业大学南京农业大学 生命科学学院生命科学学院 谷氨酸结晶谷氨酸结晶固相析出法的应用固相析出法的应用例例1 1：尿激酶的沉淀分离：尿激酶的沉淀分离n尿激酶：分离方法包括沉淀法、
33、吸尿激酶：分离方法包括沉淀法、吸附法、层析法附法、层析法n沉淀法：沉淀法：q金属离子形成复合盐金属离子形成复合盐q脱盐脱盐q盐析盐析Zn Zn 离子沉淀尿激酶离子沉淀尿激酶低浓度时低浓度时，zn 能选择沉淀尿激酶。能选择沉淀尿激酶。在在3mM可得可得85-92 回收率，而沉回收率，而沉淀物的量并不多；淀物的量并不多；加大加大Zn 浓度浓度虽然能提高有限回收虽然能提高有限回收率，但沉淀物量大，纯度降低。率，但沉淀物量大，纯度降低。沉淀量沉淀量酶活酶活EDTA 溶出效应硫酸铵溶解尿激酶锌络合物n硫酸铵的选用硫酸铵的选用n1)1)它在低浓度时可能有盐溶作用，促进沉淀蛋它在低浓度时可能有盐溶作用，促进
34、沉淀蛋 白溶解；白溶解；n2)2)因为本身有因为本身有NHNH4 4+，与，与Zn Zn 2+2+有络合作用，有有络合作用，有 利利于沉淀物溶解；于沉淀物溶解；n3)3)硫酸铵为盐析所用，在最终盐析中，只需补硫酸铵为盐析所用，在最终盐析中，只需补 加规定量即可，而不引入其他成分。加规定量即可，而不引入其他成分。尿激酶盐析沉淀尿激酶盐析沉淀沉淀量沉淀量 回收率回收率 纯度纯度例例2：柠檬酸的生产：柠檬酸的生产n柠檬酸是一种重要的有机酸，它在食品、医药、化工、柠檬酸是一种重要的有机酸，它在食品、医药、化工、皮革、环保等工业部门都有广泛的用途。皮革、环保等工业部门都有广泛的用途。n目前柠檬酸极大多数
35、是通过微生物发酵法（黑曲霉）目前柠檬酸极大多数是通过微生物发酵法（黑曲霉）生产，生产，n提取工艺中，目前大多通过沉淀法制备（碳酸钙沉淀提取工艺中，目前大多通过沉淀法制备（碳酸钙沉淀及硫酸酸解）及硫酸酸解）标准沉淀法回收柠檬酸流程图标准沉淀法回收柠檬酸流程图加热到加热到70度度pH1.82.0 过滤例例3：胰蛋白酶的提取：胰蛋白酶的提取从动物胰脏中提取胰蛋白酶工艺从动物胰脏中提取胰蛋白酶工艺u胰蛋白酶原的溶解：酸性条件下稳定胰蛋白酶原的溶解：酸性条件下稳定u溶解液中含有大量的酸性杂蛋白（溶解液中含有大量的酸性杂蛋白（pI10.8)pI10.8)u浓缩分离胰蛋白酶原（盐析）浓缩分离胰蛋白酶原（盐析
36、）u溶解激活（酶原溶解激活（酶原-酶）酶）u胰蛋白酶的进一步分离：酶溶液中糜蛋白弹性蛋白等胰蛋白酶的进一步分离：酶溶液中糜蛋白弹性蛋白等与胰蛋白酶在不同的盐浓度下溶解度不同与胰蛋白酶在不同的盐浓度下溶解度不同胰蛋白酶的提取胰蛋白酶的提取（二）胰蛋白酶原激活（二）胰蛋白酶原激活A.A.滤饼溶解滤饼溶解,加入无水加入无水CaClCaCl2 2,边加边搅拌边加边搅拌,最终含有最终含有0.1M CaCl0.1M CaCl2 2；B.B.5MNaOH5MNaOH调调pHpH至至8.0,8.0,加极少量胰酶搅拌，于室温下活化加极少量胰酶搅拌，于室温下活化8 81010小时；小时；C.C.活化完成，用活化完
37、成，用2.5M H2.5M H2 2SOSO4 4调调pHpH至至2.5-3.02.5-3.0，抽滤除去，抽滤除去CaSOCaSO4 4沉淀。沉淀。（一）猪胰蛋白酶原的提取（一）猪胰蛋白酶原的提取1.1.胰脏绞碎加入胰脏绞碎加入2 2倍体积冷乙酸倍体积冷乙酸 (pH2.5)(pH2.5)低温搅拌低温搅拌2424小时，过滤；小时，过滤；2.2.滤液用滤液用2.5M H2.5M H2 2SOSO4 4调调pHpH至至2.52.53.03.0，放置，放置3 34 4小时后，用滤纸过滤；小时后，用滤纸过滤；3.3.滤液加入硫酸铵滤液加入硫酸铵,达达0.750.75饱和度放置过夜抽滤，得酶原粗制品。饱和
38、度放置过夜抽滤，得酶原粗制品。（三）胰蛋白酶的分离（三）胰蛋白酶的分离1.1.将激活溶液加入固体硫酸铵将激活溶液加入固体硫酸铵,达达0.40.4饱和度饱和度,数小时后抽滤弃滤饼。数小时后抽滤弃滤饼。2.2.滤液加入硫酸铵，饱度达到滤液加入硫酸铵，饱度达到0.750.75，放置数小时，抽滤弃滤液，即，放置数小时，抽滤弃滤液，即得胰蛋白酶粗品。得胰蛋白酶粗品。例例4：四环素的沉淀提取：四环素的沉淀提取l四环素由链霉菌发酵获得四环素由链霉菌发酵获得l四环素等电点四环素等电点pIpI=5=5。当。当溶液的溶液的pH pH 等于等电点等于等电点时，四环时，四环素易从水溶液中沉淀出来（游离碱），因此可用于
39、四环素易从水溶液中沉淀出来（游离碱），因此可用于四环素的提取。素的提取。l四环素又能与尿素形成四环素又能与尿素形成1 1：1 1的复盐的复盐，从水溶液中沉淀出，从水溶液中沉淀出来，该复盐溶于有机溶剂时，即分解成四环素和尿素。来，该复盐溶于有机溶剂时，即分解成四环素和尿素。l四环素与尿素的这一反应四环素与尿素的这一反应具有特异性具有特异性：金霉素，土霉素：金霉素，土霉素都不能与尿素形成复合物沉淀。利用这一性质，可精制都不能与尿素形成复合物沉淀。利用这一性质，可精制四环素。四环素。四环素发酵液预处理四环素发酵液预处理加加草酸酸化草酸酸化至至PH1.7-1.8PH1.7-1.8，分别加，分别加0.2
40、0.2(w/v(w/v)黄血盐、硫酸锌黄血盐、硫酸锌过滤过滤滤洗液滤洗液发酵液发酵液滤渣滤渣 0.5%0.5%草酸水顶洗草酸水顶洗 洗液洗液滤液滤液n第一步沉淀提取第一步沉淀提取沉淀沉淀粗碱粗碱滤液滤液 7000-9000 u/ml7000-9000 u/ml搅拌下慢慢加入浓氨水搅拌下慢慢加入浓氨水调调pH4.8pH4.8 10-15 10-15，搅拌，搅拌30min30min，过滤过滤第二步沉淀提取第二步沉淀提取溶于尿素盐酸溶液中溶于尿素盐酸溶液中（粗碱干重（粗碱干重:尿素尿素:水水:浓浓HCl1:2:2:0.25）粗碱粗碱粗碱尿素溶液粗碱尿素溶液沉淀沉淀四环素尿四环素尿素复盐素复盐丁醇清液丁醇清液丁醇悬浮溶液丁醇悬浮溶液 溶于酸性丁醇中溶于酸性丁醇中复盐干重复盐干重:丁醇丁醇:浓浓HCl1:10:0.3 (丁醇先，搅拌下滴加丁醇先，搅拌下滴加HCl)滤去不溶物滤去不溶物 浓氨水调浓氨水调pH4.64.8搅拌搅拌20min，过滤，过滤结晶结晶思考题1.沉淀与结晶有何不同？常用的沉淀方法包括哪些？2.何谓盐析？其原理是什么？常用的盐析方法有哪些？影响盐析的主要因素有哪些？盐析操作时常用的盐是什么？3.有机溶剂沉淀法的主要原理是什么？影响有机溶剂沉析的主要因素有哪些？4.什么是结晶？结晶过程包括哪些？在何种条件下，溶液中才有晶体析出？5.提高晶体质量的途径
