1、真菌检验操作规程真菌感染检验l 按其侵犯人体组织和器官的不同，临床上将真菌分为引起皮肤和软组织按其侵犯人体组织和器官的不同，临床上将真菌分为引起皮肤和软组织感染的真菌和引起侵袭性感染的真菌两大类。皮肤和软组织感染的真菌，感染的真菌和引起侵袭性感染的真菌两大类。皮肤和软组织感染的真菌，又称为又称为浅部真菌（浅部真菌（superficial fungisuperficial fungi），），主要侵犯机体皮肤、毛发和主要侵犯机体皮肤、毛发和指（趾）甲，寄生和腐生于表皮、毛发和甲板的角质组织中。指（趾）甲，寄生和腐生于表皮、毛发和甲板的角质组织中。深部感染深部感染真菌真菌主要侵袭深部组织和内脏以及全
2、身。主要侵袭深部组织和内脏以及全身。全国临床检验操作规程真菌病原学检验程序l 临床标本直接检查葡聚糖甘露聚糖PAS分离培养检测抗体检测抗原动物实验病理组织标本HE沙氏培养基25C37C观察菌落酵母型菌丝型生化反应小培养镜检直接镜检分子生物学检测KOH法毛发指甲皮屑脓汁痰液墨汁法染色法经固定标本染色法：亚甲蓝染色法、革兰染色法、PAS、荧光染色法。痰液脓汁脑脊液全国临床检验操作规程（第四版）783页图4-6-1 2015年3月第一版真菌鉴定程序标本的采集、运送和保存l 合适采集、运送与处理标本合适采集、运送与处理标本以及遵守真菌实验检测与鉴定程序是保证真以及遵守真菌实验检测与鉴定程序是保证真菌感
3、染的实验检测结果正确的前提。菌感染的实验检测结果正确的前提。l 所有标本均应在密封无菌容器运送和处理，运送时间越短越好；不能用所有标本均应在密封无菌容器运送和处理，运送时间越短越好；不能用厌氧转运或厌氧容器。粪便不推荐作为真菌检验的标本。厌氧转运或厌氧容器。粪便不推荐作为真菌检验的标本。标本l毛发毛发、皮屑皮屑、指（趾）甲指（趾）甲l脓液、伤口、创伤及软组织脓液、伤口、创伤及软组织l血液、骨髓血液、骨髓l导管头导管头l结膜结膜、角膜刮片角膜刮片、玻璃体、前房穿刺液玻璃体、前房穿刺液l前列腺液前列腺液、阴道分泌物阴道分泌物l尿液尿液l下呼吸道标本（痰、支气管肺泡灌洗液、支气管保护性毛刷）下呼吸道
4、标本（痰、支气管肺泡灌洗液、支气管保护性毛刷）l上呼吸道标本上呼吸道标本l无菌体液（脑脊液、心包液，腹膜液和滑膜液）无菌体液（脑脊液、心包液，腹膜液和滑膜液）l组织组织l l 深部感染真菌检验深部感染真菌因常引起全身性感染又称为深部感染真菌因常引起全身性感染又称为系统性感染真菌系统性感染真菌，包括，包括致病致病性真菌和条件致病性真菌性真菌和条件致病性真菌两类。两类。致病性真菌主要有致病性真菌主要有荚膜组织胞浆菌（荚膜组织胞浆菌（HistoplasmaHistoplasma）、球孢子菌）、球孢子菌(CoccidioidesCoccidioides)、副球孢子菌、副球孢子菌(Paracoccidi
5、oidesParacoccidioides)和芽生菌和芽生菌(BlastomycesBlastomyces)。此类真菌在正常人体内不存在，一旦侵入机体即可此类真菌在正常人体内不存在，一旦侵入机体即可致病。在临床上比较少见，一般呈地方性流行。致病。在临床上比较少见，一般呈地方性流行。深部感染真菌检验条件致病性真菌条件致病性真菌主要有主要有念珠菌属（念珠菌属（CandidaCandida）、）、隐球菌隐球菌(CryptococcusCryptococcus)、曲霉曲霉(AspergillusAspergillus)、毛霉毛霉(MucorMucor)、卡氏肺孢菌、卡氏肺孢菌(Pneumocystis
6、 carinii,PCPneumocystis carinii,PC)和和马内菲青霉（马内菲青霉（Penicillium marneffeiPenicillium marneffei）等，此类真菌属于人体正等，此类真菌属于人体正常菌群，通常情况下不致病，只有在菌群失调、免疫力低下等一定常菌群，通常情况下不致病，只有在菌群失调、免疫力低下等一定条件下才会致病。是目前临床上深部真菌感染最常见的病原菌，且条件下才会致病。是目前临床上深部真菌感染最常见的病原菌，且呈增长趋势。呈增长趋势。深部感染真菌检验曲霉曲霉属属(AspergillusAspergillus)l 广泛分布于自然界，如土壤、腐败有机物
7、、粮食和饲料等，有时也存在广泛分布于自然界，如土壤、腐败有机物、粮食和饲料等，有时也存在于正常人体的皮肤和粘膜表面。于正常人体的皮肤和粘膜表面。l（一）分类和命名（一）分类和命名l 其中大多数曲霉只发现了无性阶段，它们归属于半知菌亚门、丝孢菌纲、其中大多数曲霉只发现了无性阶段，它们归属于半知菌亚门、丝孢菌纲、丝孢菌目、丛梗孢科，少数种具有性阶段归入子囊菌亚门、不整子囊菌丝孢菌目、丛梗孢科，少数种具有性阶段归入子囊菌亚门、不整子囊菌纲、散囊菌目、散囊菌科。其中对人致病的曲霉主要有纲、散囊菌目、散囊菌科。其中对人致病的曲霉主要有烟曲霉烟曲霉(A.fumigatusA.fumigatus)、黄曲霉、
8、黄曲霉(A.flavusA.flavus)、黑曲霉、黑曲霉(A.nigerA.niger)、土曲霉、土曲霉（A.terreusA.terreus）和构巢曲霉）和构巢曲霉(A.nidulansA.nidulans)，临床上以烟曲霉最为常见。临床上以烟曲霉最为常见。深部感染真菌检验曲霉属(Aspergillus)l（二）（二）临床意义临床意义l曲霉是曲霉是条件致病菌条件致病菌，在人体免疫功能降低时继发感染引起疾病，如长期使用广谱抗，在人体免疫功能降低时继发感染引起疾病，如长期使用广谱抗生素、免疫抑制剂、肾上腺皮质激素，放疗、化疗，各种恶性肿瘤、糖尿病、生素、免疫抑制剂、肾上腺皮质激素，放疗、化疗，
9、各种恶性肿瘤、糖尿病、AIDSAIDS等可诱发曲霉病。等可诱发曲霉病。l曲霉可侵犯机体许多部位，尤其是曲霉可侵犯机体许多部位，尤其是呼吸系统，引起肺曲霉病呼吸系统，引起肺曲霉病。曲霉可局限在肺内感。曲霉可局限在肺内感染也可播散到其他器官，甚至引起染也可播散到其他器官，甚至引起全身性感染全身性感染。曲霉还可诱发超敏反应引起过敏性。曲霉还可诱发超敏反应引起过敏性支气管肺曲霉病支气管肺曲霉病。l有些曲霉可产生毒素引起食物中毒，有的毒素如黄曲霉毒素、杂色曲霉素有致癌作有些曲霉可产生毒素引起食物中毒，有的毒素如黄曲霉毒素、杂色曲霉素有致癌作用，特别是黄曲霉毒素与人类用，特别是黄曲霉毒素与人类原发性肝癌原
10、发性肝癌的发生密切有关。的发生密切有关。深部感染真菌检验曲霉属(Aspergillus)l（三）（三）真菌真菌检验检验l 1.1.标本采集标本采集 标本主要有痰液、标本主要有痰液、脓液、分泌物、皮屑、耵聍、脓液、分泌物、皮屑、耵聍、尿、粪便等。尿、粪便等。l 2.2.直接显微镜检查直接显微镜检查 标本用氢标本用氢氧化钾涂片，镜检氧化钾涂片，镜检可见分枝有可见分枝有隔菌丝隔菌丝，有时可见，有时可见分生孢子梗、分生孢子梗、顶囊及小梗顶囊及小梗。若为有性期感染，。若为有性期感染，可见到闭囊壳。可见到闭囊壳。深部感染真菌检验曲霉属(Aspergillus)l（三）（三）真菌真菌检验检验l3.3.分离培
11、养分离培养 标本接种沙氏培养基，标本接种沙氏培养基，温度温度27271 1，耐高温的菌种，耐高温的菌种3737或或4545培养，培养，培培养时间养时间7-147-14天，天，观察观察菌落特征，尤其是颜色的变化菌落特征，尤其是颜色的变化。l4.4.鉴定鉴定 曲霉的鉴定主要依据菌落质地、颜色，显微镜检查所见如曲霉的鉴定主要依据菌落质地、颜色，显微镜检查所见如分生孢子头形状；分生孢子头形状；分生孢子梗：颜色、表面粗糙或光滑；分生孢子梗：颜色、表面粗糙或光滑；顶囊：形态、梗占据顶囊表面积的大小；顶囊：形态、梗占据顶囊表面积的大小；小梗：小梗：单层还是双层；单层还是双层；分生孢子：表面是否光滑及有无纹饰
12、分生孢子：表面是否光滑及有无纹饰；有无闭囊壳。有无闭囊壳。l分生孢子头分生孢子头是曲霉属具有特征性的结构之一，由顶囊、产孢细胞和分生孢子链组成，可以是曲霉属具有特征性的结构之一，由顶囊、产孢细胞和分生孢子链组成，可以是球形、放射形、圆柱形或棒形，且具有不同的颜色。是球形、放射形、圆柱形或棒形，且具有不同的颜色。l取菌落根部进行湿片镜检，未见典型菌体形态，需继续孵生长迅速，菌落初黄、后为烟绿色或黑褐色，背面无色或黄褐色，绒毛状。顶囊烧瓶状；单层小梗，布满顶囊表面顶囊烧瓶状；单层小梗，布满顶囊表面2/32/3；分生孢子近球形、；分生孢子近球形、表面粗糙；分生孢子头柱状；分生孢子梗绿色、光滑。表面粗
13、糙；分生孢子头柱状；分生孢子梗绿色、光滑。烟曲霉菌落烟曲霉菌落烟曲霉烟曲霉,光镜光镜 X400黄曲霉菌落黄曲霉菌落黄曲霉黄曲霉,光镜光镜 X200 菌落初黄、后为黄绿色，背面无色或微褐色，有放射沟纹，棉絮状、有时粉末状。顶囊近球形；单层和顶囊近球形；单层和/或双层小梗，布满顶囊表面；分或双层小梗，布满顶囊表面；分生孢子近球形或梨形、表面粗糙；分生孢子头放射状或圆柱状。孢子生孢子近球形或梨形、表面粗糙；分生孢子头放射状或圆柱状。孢子梗无色、粗糙。梗无色、粗糙。生长迅速，菌落初白、后为黑色或黑褐色，背面无色或略带黑褐色，生长迅速，菌落初白、后为黑色或黑褐色，背面无色或略带黑褐色，初为羊毛状、后呈粗
14、绒状。初为羊毛状、后呈粗绒状。顶囊近球形；双层小梗，布满顶囊表面；顶囊近球形；双层小梗，布满顶囊表面；分生孢子球形、表面极度粗糙；分生孢子头放射状；孢子梗无色或分生孢子球形、表面极度粗糙；分生孢子头放射状；孢子梗无色或淡黄色、光滑。淡黄色、光滑。黑曲霉菌落黑曲霉菌落 黑曲霉黑曲霉,光镜光镜 X200生长迅速，菌落肉桂色或褐色，背面黄到褐色，有放射沟纹，绒毛状。顶囊半球形；双层小梗，布满顶囊表面顶囊半球形；双层小梗，布满顶囊表面2/32/3；分生孢子近球形、光滑；分生孢子近球形、光滑；分生孢子头紧密圆柱形；孢子梗无色、光滑。分生孢子头紧密圆柱形；孢子梗无色、光滑。土曲霉菌落土曲霉菌落 土曲霉，光
15、镜土曲霉，光镜 X200 生长迅速，菌落初灰白、后为暗绿色，背面紫红至紫黑，中央粉末状、边缘绒毛状。顶囊半球形；双层小梗，布满顶囊表面顶囊半球形；双层小梗，布满顶囊表面1/21/2；分生孢子；分生孢子球形、粗糙有刺；分生孢子头柱形；孢子梗褐色、光滑；闭囊壳紫色。球形、粗糙有刺；分生孢子头柱形；孢子梗褐色、光滑；闭囊壳紫色。构巢曲霉菌落构巢曲霉菌落 构巢曲霉构巢曲霉,光镜光镜 X400生长缓慢，菌落灰绿、浅黄或粉红色、逐渐变黑，背面无色或黄橙色，绒毛状。顶囊半椭圆或半球形；双层小梗，布满顶囊表面顶囊半椭圆或半球形；双层小梗，布满顶囊表面3/43/4；分生；分生孢子近球形、粗糙；分生孢子头疏松放射
16、状。孢子梗无色或微黄、光孢子近球形、粗糙；分生孢子头疏松放射状。孢子梗无色或微黄、光滑。滑。杂色曲霉菌落杂色曲霉菌落杂色曲霉杂色曲霉,光镜光镜 X400深部感染真菌检验曲霉属(Aspergillus)l（三）（三）真菌真菌检验检验l 5 5.抗原检测抗原检测 用竞争性用竞争性ELISAELISA测定病人血清中曲霉抗原，简单快速。测定病人血清中曲霉抗原，简单快速。l 6.6.抗体检测抗体检测 常用免疫扩散、对流免疫电泳、常用免疫扩散、对流免疫电泳、ELISAELISA及间接免疫荧光法及间接免疫荧光法等检测病人血清中抗曲霉抗体。菌丝和培养滤液可作抗原。等检测病人血清中抗曲霉抗体。菌丝和培养滤液可作
17、抗原。l 7.7.皮肤试验皮肤试验 对过敏性支气管肺炎病人可用曲霉抗原提取液作皮试。对过敏性支气管肺炎病人可用曲霉抗原提取液作皮试。2023-2-62424检测曲霉GM抗原的ELISA试验 半乳糖甘露聚糖(galactomanna，GM)是曲霉细胞壁的成分，曲霉通过生长菌丝释放到血液。半乳甘露聚糖由甘露聚糖和呋喃半乳糖组成，后者具有抗原性，被抗GM的单克隆抗体EB-A2 IgM识别。利用ELISA免疫方法检测侵袭性曲霉病患者体液中半乳甘露聚糖抗原成分以辅助诊断侵袭性曲霉病。痰液，肺泡灌洗液，支气管上分泌物都有送检痰液，肺泡灌洗液，支气管上分泌物都有送检至少至少3 3天以上，如有杂菌继续孵育天以上，如有杂菌继续孵育。真菌培养用沙氏平板真菌培养用沙氏平板统一放在温度统一放在温度2727度的孵度的孵箱，注意湿度。箱，注意湿度。取菌落根部进行湿片镜检，未见典型菌体形态，需继续取菌落根部进行湿片镜检，未见典型菌体形态，需继续孵育孵育谢谢
