1、1 1 1 1 遗传变异的物质基础基因突变和诱变育种基因重组和杂交育种（自学）基因工程菌种的衰退复壮和保藏内容提要内容提要1 第七章第七章 微生物的遗传变异和育种微生物的遗传变异和育种遗传遗传（heredity inheritance）：亲代与子代相似亲代与子代相似变异变异（variation）：亲代与子代、子代间不同个体不完全相同亲代与子代、子代间不同个体不完全相同遗传遗传（inheritance）和和变异变异（variation）是生命的最本质特性之一是生命的最本质特性之一（1）遗传型遗传型（genotype）生物的全部遗传因子及基因生物的全部遗传因子及基因 又称又称基因型基因型，指某一生
2、物个体所含有的全部遗传因子即，指某一生物个体所含有的全部遗传因子即基因组基因组（genome）所携带的遗传信息。遗传型是一种内在可所携带的遗传信息。遗传型是一种内在可能性或潜力，其实质是遗传物质上所负载的能性或潜力，其实质是遗传物质上所负载的 特定遗传信息特定遗传信息（2）表型表型（phenotype）具有一定遗传型的个体，在特定环境条件下通过生长发具有一定遗传型的个体，在特定环境条件下通过生长发育所表现出来的形态等生物学特征的总和。育所表现出来的形态等生物学特征的总和。又称又称 表现型表现型，指某一生物体所具有的一切外表特征和指某一生物体所具有的一切外表特征和内在特性的总和，是其遗传型在合适
3、环境下通过代谢和发育内在特性的总和，是其遗传型在合适环境下通过代谢和发育而得到的具体表现。而得到的具体表现。表型是由遗传型所决定，但也和环境有关。表型是由遗传型所决定，但也和环境有关。（3）变异变异遗传型变异遗传型变异（基因变异、基因突变基因变异、基因突变）：指生物体在某种外因或内因的作用下所引起的遗传物质结构或指生物体在某种外因或内因的作用下所引起的遗传物质结构或数量的改变，亦即遗传型的改变。数量的改变，亦即遗传型的改变。遗传物质改变，导致表型改变遗传物质改变，导致表型改变特点：特点：遗传性、群体中极少数个体的行为遗传性、群体中极少数个体的行为（自发突变频率通常为（自发突变频率通常为1010
4、-5-5-10-10-10-10）表型饰变：表型饰变：指不涉及遗传物质结构改变而只发生在转录、转译水平指不涉及遗传物质结构改变而只发生在转录、转译水平上的表型变化。上的表型变化。表型的差异只与环境有关表型的差异只与环境有关特点：特点：暂时性、不可遗传性、表现为全部个体的行为暂时性、不可遗传性、表现为全部个体的行为橘生淮南则为橘，生于淮北则为枳。橘生淮南则为橘，生于淮北则为枳。（4）饰变饰变（modification）表表 型型 饰饰 变：变：表型的差异只与环境有关表型的差异只与环境有关暂时性、不可遗传性、表现为全部个暂时性、不可遗传性、表现为全部个体的行为体的行为例如：例如：粘质沙雷氏菌：粘质
5、沙雷氏菌：2525下培养，产生深下培养，产生深红色的灵杆菌素；红色的灵杆菌素；3737下培养，不产生下培养，不产生色素；色素；重新将温度降重新将温度降2525，又恢复产色素的能力。又恢复产色素的能力。斜面培养斜面培养液体培养液体培养微生物是遗传学研究中的明星微生物是遗传学研究中的明星：t 微生物细胞结构简单，营养体一般为单倍体，方便建立纯系微生物细胞结构简单，营养体一般为单倍体，方便建立纯系t 很多常见微生物都易于人工培养，快速、大量生长繁殖。很多常见微生物都易于人工培养，快速、大量生长繁殖。t 对环境因素的作用敏感，易于获得各类突变株，操作性强。对环境因素的作用敏感，易于获得各类突变株，操作
6、性强。第一节第一节 遗传变异的物质基础遗传变异的物质基础n种质连续理论：种质连续理论：1883188318891889年间年间WeissmannWeissmann提出。认提出。认为遗传物质是一种具有特定分子结构的化合物。为遗传物质是一种具有特定分子结构的化合物。F CrickF Crick在研究在研究DNADNA双螺旋结构双螺旋结构n基因学说：基因学说：19331933年摩尔根（年摩尔根（Thomas Hunt MorganThomas Hunt Morgan）发现了发现了染色体，并证明基因在染色体上呈直线排列，提出了基因学染色体，并证明基因在染色体上呈直线排列，提出了基因学说，使得遗传物质基
7、础的范围缩小到染色体上。说，使得遗传物质基础的范围缩小到染色体上。nDNADNA是遗传变异的物质基础的证明：是遗传变异的物质基础的证明：19441944年以后，先后年以后，先后有利用微生物为实验对象进行的三个著名实验有利用微生物为实验对象进行的三个著名实验n肺炎球菌的转化试验肺炎球菌的转化试验n噬菌体感染试验噬菌体感染试验n病毒的拆开与重建试验病毒的拆开与重建试验 人们普遍接受核人们普遍接受核酸才是真正的遗传物质。酸才是真正的遗传物质。一、一、3 3个经典实验个经典实验 （一）（一）经典转化试验经典转化试验 最早进行最早进行 转化转化（transformation）实验的是实验的是F.Grif
8、fith（1928年）年），他以，他以Streptococcus pneumoniae（肺炎链球菌，旧称（肺炎链球菌，旧称“肺炎双球菌肺炎双球菌”）作为研究对）作为研究对象。象。光滑型（光滑型（S S）粗糙型（粗糙型（R R）有有 荚荚 膜膜菌落光滑菌落光滑分泌毒素分泌毒素致致 病病无无 荚荚 膜膜菌落粗糙菌落粗糙无无 毒毒不不 致致 病病实验材料：实验材料：肺炎双球菌肺炎双球菌转化实验转化实验说明说明：加热杀死的加热杀死的 S 型细菌中有一种具有遗传型细菌中有一种具有遗传转化能力的物质，它通过某种方式进入转化能力的物质，它通过某种方式进入 R 型细胞，型细胞，并使并使 R 型细菌获得表达型细
9、菌获得表达 S 型荚膜形状的遗传特性型荚膜形状的遗传特性1928年年Griffith进行的细菌转化实验进行的细菌转化实验（1 1）动物实验动物实验（2 2）细菌培养试验细菌培养试验（3 3）S S型菌的无细胞抽提液试验型菌的无细胞抽提液试验AveryAvery在四十年代以更精密的实验设计重复了以上实验在四十年代以更精密的实验设计重复了以上实验（1 1）从活的）从活的S S菌中抽提各种细胞成分（菌中抽提各种细胞成分（DNADNA，蛋白质，荚膜多糖等），蛋白质，荚膜多糖等）（2 2）对各组分进行转化试验）对各组分进行转化试验只有只有S型细菌的型细菌的DNA才能将才能将S.pneumoniae的的R
10、型转化为型转化为S型型且且DNA纯度越高，转化效率也越高。纯度越高，转化效率也越高。说明：说明：S型菌株转移给型菌株转移给R型菌株的型菌株的DNA是遗传因子。是遗传因子。19521952年，年，A.D.HersheyA.D.Hershey和和M.ChaseM.Chase发表了证发表了证明明DNADNA是噬菌体的遗传物质基础的著名实验是噬菌体的遗传物质基础的著名实验 噬菌体感染实验噬菌体感染实验（二）噬菌体感染实验（二）噬菌体感染实验（p188）蛋白质蛋白质 只含只含S不含不含PDNA只含只含P不含不含S原理原理步骤步骤1：用含同位素：用含同位素35,P32的培养基分别培养大肠杆菌的培养基分别培
11、养大肠杆菌2：让：让T2感染上述大肠杆菌使其打上感染上述大肠杆菌使其打上S35、P32标记标记3535S S蛋白质外壳的噬菌体蛋白质外壳的噬菌体3232P PDNADNA核心的噬菌体核心的噬菌体在在DNADNA中存在着包括合成中存在着包括合成蛋白质外壳在内的整套蛋白质外壳在内的整套遗传信息。遗传信息。（二）噬菌体感染实验（二）噬菌体感染实验Hershey（1）含）含32P-DNA的一组：放射性的一组：放射性85%在沉淀中在沉淀中10分钟后分钟后用捣碎器用捣碎器使空壳脱离使空壳脱离吸附吸附离心离心沉淀细胞进一步培沉淀细胞进一步培养后，可产生大量养后，可产生大量完整的子代噬菌体完整的子代噬菌体上清
12、液中含上清液中含15%放射性放射性沉淀中含沉淀中含85%放射性放射性沉淀中含沉淀中含25%放射性放射性以以3 35 5S S标记蛋白质外壳做噬菌体感染实验标记蛋白质外壳做噬菌体感染实验（2）含）含35S-蛋白质的一组：放射性蛋白质的一组：放射性75%在上清液中在上清液中10分钟后分钟后用捣碎器用捣碎器使空壳脱离使空壳脱离吸附吸附离心离心沉淀细胞进一步培沉淀细胞进一步培养后，可产生大量养后，可产生大量完整的子代噬菌体完整的子代噬菌体上清液中含上清液中含75%放射性放射性 为了证明核酸是遗传物质，为了证明核酸是遗传物质，H.Fraenkel-Conrat（19561956）用含）用含RNARNA的
13、的 烟草花叶病毒烟草花叶病毒（TMVTMV）进行了著名的进行了著名的 植物病毒重建实验植物病毒重建实验。（三）植物病毒的重建实验（三）植物病毒的重建实验（p189）植物病毒蛋白质和RNA可以人为地分开,同时又可把它们重新组合成具感染性的病毒.植物病毒的重建实验植物病毒的重建实验 甲乙甲乙r r 感染症状同甲病毒；分离得到甲病毒感染症状同甲病毒；分离得到甲病毒 乙甲乙甲r r 感染症状同乙病毒；分离得到乙病毒感染症状同乙病毒；分离得到乙病毒 TMVHRVHRVTMV原始株原始株 拆拆 开开 重重 建建 感感 染染 分离纯化分离纯化 植物病毒的重建实验植物病毒的重建实验 遗传物质类型核染色体核染色
14、体核外染色体真核生物细胞器原核生物质粒二、遗传物质在微生物细胞内的存在部位和方式二、遗传物质在微生物细胞内的存在部位和方式核外核外DNA的种类的种类真核生物的真核生物的“质粒质粒”原核生物的原核生物的质粒质粒线粒体线粒体细胞质基因细胞质基因叶绿体叶绿体中心体中心体动动 体体共生生物：卡巴颗粒共生生物：卡巴颗粒酵母菌的酵母菌的2 m质粒质粒F因子因子R因子因子Col质粒质粒Ti质粒质粒巨大质粒巨大质粒降解性质粒降解性质粒（一）核酸存在的（一）核酸存在的 7 个水平个水平v细胞水平：细胞水平：存在于细胞核或核质体，单核或多核存在于细胞核或核质体，单核或多核v细胞核水平细胞核水平:原核与真核生物的细
15、胞核结构不同，核外原核与真核生物的细胞核结构不同，核外 DNAv染色体水平染色体水平:倍性倍性(真核真核)和染色体数和染色体数v核酸水平：核酸水平：在原核中同染色体水平、存在部分二倍体在原核中同染色体水平、存在部分二倍体 DNA或或RNA，复合或裸露，双链或单链复合或裸露，双链或单链v基因水平：基因水平：具自主复制能力的遗传功能单位，长度与信具自主复制能力的遗传功能单位，长度与信 息量，转息量，转录录翻译翻译v密码子水平：密码子水平：信息单位信息单位,起始和终止起始和终止,v核苷酸水平：核苷酸水平：突变或交换单位，四种碱基突变或交换单位，四种碱基（二（二)原核生物的质粒原核生物的质粒 （p19
16、4p194）功能：功能：带有一些基因，如产生毒素、抗药性、固氮、产生酶类、降带有一些基因，如产生毒素、抗药性、固氮、产生酶类、降解功能等，并可进行细胞间转移。解功能等，并可进行细胞间转移。结构与大小：结构与大小：质粒通常以共价闭合质粒通常以共价闭合环状的超螺旋双链环状的超螺旋双链DNADNA分子状态存在于分子状态存在于细胞中。细胞中。约为约为1 11000kb1000kb，上面携带有，上面携带有数个到数十个甚至上百个基因。数个到数十个甚至上百个基因。定义：定义：存在于细菌、真菌等微生物细存在于细菌、真菌等微生物细胞中，独立于染色体外，能进行自主胞中，独立于染色体外，能进行自主复制的遗传因子。复
17、制的遗传因子。质粒质粒 核外环状小型核外环状小型DNA独立复制稳定遗传独立复制稳定遗传F因子因子 与有性接合有关与有性接合有关种类种类 R因子因子 与抗药性有关与抗药性有关COL 编码免疫蛋白编码免疫蛋白Ti质粒质粒 诱癌质粒诱癌质粒降解性质粒：编码降解有害物质的酶降解性质粒：编码降解有害物质的酶用途用途 基因工程中作为目的基因载体基因工程中作为目的基因载体质粒质粒原核生物遗传物质原核生物遗传物质存在的另一种方式存在的另一种方式基 因 突 变突变与育种第二节第二节 基因突变和诱变育种基因突变和诱变育种一、基因突变一、基因突变（gene mutation）一个基因内部遗传结构或一个基因内部遗传结
18、构或DNA序列的任何改变序列的任何改变 简称简称 突变突变，是变异的一种，泛指细胞内（或病毒粒内，是变异的一种，泛指细胞内（或病毒粒内）遗传物质的）遗传物质的 分子结构分子结构 或或 数量数量 突然发生的可遗传的变化，突然发生的可遗传的变化，可自发或诱导产生。可自发或诱导产生。突变几率一般很低突变几率一般很低（1010-6-61010-9-9）从自然界分离到的菌株从自然界分离到的菌株，简称，简称 野生型野生型。野生型经突变后形成的带有新性状的菌株，野生型经突变后形成的带有新性状的菌株，又称又称突变体突变体 或或 突变型突变型。突变株突变株（mutant）野生型菌株野生型菌株（wild type
19、 strain）（一）突变类型（一）突变类型 凡能用凡能用选择性培养基选择性培养基（或其他选择性培养（或其他选择性培养条件）快速选择出来的突变株。条件）快速选择出来的突变株。选择性突变株选择性突变株（selective mutant）非选择性突变株非选择性突变株（non-selective mutant）反之。反之。突变株的表型突变株的表型非选择性突变株非选择性突变株选择性突变株选择性突变株抗性突变型（株）抗性突变型（株）营养缺陷型（株）营养缺陷型（株）条件致死突变型（株）条件致死突变型（株）形态突变型（株）形态突变型（株）抗原突变型（株）抗原突变型（株）产量突变型（株）产量突变型（株）1.1
20、.营养缺陷型营养缺陷型（auxotroph）某一野生型菌株因发生基因突变而某一野生型菌株因发生基因突变而丧失丧失合成一种或几种生合成一种或几种生长因子、碱基或氨基酸的能力，长因子、碱基或氨基酸的能力，只有从周围环境或培养基中获只有从周围环境或培养基中获得这些得这些营养或其前体物营养或其前体物（precursor）才能才能正常生长繁殖的变正常生长繁殖的变异类型，称为异类型，称为营养缺陷型营养缺陷型。营养缺陷型突变株营养缺陷型突变株在遗传学、分子生物学、遗传育种在遗传学、分子生物学、遗传育种和遗传工程等研究中和遗传工程等研究中十分重要十分重要表型判断的标准：表型判断的标准：在基本培养基上能否生长在
21、基本培养基上能否生长营养缺陷型的表示方法：营养缺陷型的表示方法：基因型：基因型：所需营养物的前三个英文所需营养物的前三个英文小写斜体字母小写斜体字母表示：表示：hisC（组氨酸缺陷型，其中的大写字母（组氨酸缺陷型，其中的大写字母C同一表型中不同基因的突变）同一表型中不同基因的突变）表型：表型：同上，但同上，但第一个字母大写第一个字母大写，且不用斜体：，且不用斜体：HisCHisChisC缺陷型缺陷型hisC野生型野生型2.2.抗性突变型抗性突变型（resistant mutant）指野生型菌株因发生基因突变，指野生型菌株因发生基因突变，使菌株对使菌株对对某化对某化学药物或致死物理因子学药物或致
22、死物理因子，特别是抗生素，产生抗性，特别是抗生素，产生抗性的的 抗性变异类型抗性变异类型。特特 点：点：正选择标记正选择标记（突变株可直接从抗性平板上获得（突变株可直接从抗性平板上获得在加有相在加有相应抗生素的平板上，只有抗性突变能生长。所以应抗生素的平板上，只有抗性突变能生长。所以很容易分离得到。很容易分离得到。）表示方法：表示方法：所抗药物的所抗药物的前三个小写斜体英文字母前三个小写斜体英文字母加上加上“r”表示。表示。strr对链霉素的对链霉素的抗性抗性strs对链霉素的对链霉素的敏感性敏感性抗性突变菌株抗性突变菌株在遗传学、分子生物学、遗传育种在遗传学、分子生物学、遗传育种和遗传工程和
23、遗传工程等研究中等研究中极为重要极为重要3.3.条件致死突变型条件致死突变型（conditional lethal mutant）某菌株或病毒经基因突变后，在某种条件下某菌株或病毒经基因突变后，在某种条件下可可 正常正常地生长、繁殖并呈现其固有的表型，而地生长、繁殖并呈现其固有的表型，而在另一种条件下却在另一种条件下却 无法无法 生长、繁殖，这种突变生长、繁殖，这种突变类型称为类型称为条件致死突变型条件致死突变型。在在2525下可感染其下可感染其E.coli宿主宿主在在3737却不能感染却不能感染TsTs突变株突变株 即即 温度敏感突变株温度敏感突变株（temperature sensitiv
24、e mutant，Ts Ts mutant）是一类典型的条件致死突变株。是一类典型的条件致死突变株。E.coli的某些菌株的某些菌株在在3737下正常生长下正常生长不能在不能在4242下生长下生长某些某些T4T4噬菌体突变株噬菌体突变株产生产生TsTs突变的原因突变的原因在某特定的温度下具有功能在某特定的温度下具有功能在另一温度（一般为较高温度）下则无功能在另一温度（一般为较高温度）下则无功能突变使某些重要蛋白质的结构和功能发生改变，突变使某些重要蛋白质的结构和功能发生改变，4.4.形态突变型形态突变型（morphological mutant）指由于突变而引起的个体或菌落形态的指由于突变而引
25、起的个体或菌落形态的 非选择性变异非选择性变异。个体变异个体变异孢子有无、孢子颜色、孢子有无、孢子颜色、鞭毛有无或荚膜有无等的突变鞭毛有无或荚膜有无等的突变菌落变异菌落变异菌落表面光滑、粗糙、菌落表面光滑、粗糙、噬菌斑的大小或清晰度等的突变噬菌斑的大小或清晰度等的突变特点：特点：非选择性突变非选择性突变突变株和野生型菌株均可生长，但可从形突变株和野生型菌株均可生长，但可从形态特征上进行区分。态特征上进行区分。举例：举例：菌落颜色变化菌落颜色变化半乳糖苷酶基因的插入失活半乳糖苷酶基因的插入失活重组子菌落重组子菌落白色白色非重组子菌落非重组子菌落兰色兰色5.5.抗原突变型抗原突变型（antigen
26、ic mutant）指由于基因突变引起的细胞抗原结构发生的变异类指由于基因突变引起的细胞抗原结构发生的变异类型，一般也属型，一般也属 非选择性突变非选择性突变。例如，例如，细胞壁缺陷变异（细胞壁缺陷变异（L L型细菌等）、型细菌等）、荚膜或鞭毛成分变异等。荚膜或鞭毛成分变异等。6.6.产量突变型产量突变型（metabolite quantitative mutant）通过基因突变而产生的在代谢产物产量上明显有别于通过基因突变而产生的在代谢产物产量上明显有别于原始菌株的突变株，称为原始菌株的突变株，称为 产量突变型产量突变型。“正变株正变株”（plus-mutant）产量产量 高于高于 原始菌株
27、原始菌株“负变株负变株”（minus-mutant）产量产量 低于低于 原始菌株原始菌株筛选高产正变株的工作对生产实践极其重要筛选高产正变株的工作对生产实践极其重要在育种实践上在育种实践上诱变育种诱变育种重组育种重组育种遗传工程育种遗传工程育种突突变变率率每一细胞在每一世代中发生某一性状突变的几率每一细胞在每一世代中发生某一性状突变的几率例如，突变率为例如，突变率为1010-8-8的，的，指该细胞在指该细胞在1 1亿次细胞分裂中，会发生亿次细胞分裂中，会发生1 1次突变。次突变。某一单位群体在每一世代（即分裂某一单位群体在每一世代（即分裂1 1次）中产生次）中产生突变株突变株（mutant，即
28、，即突变型突变型）的数目来表示的数目来表示例如，一个含例如，一个含10108 8个细胞的群体，当其分裂为个细胞的群体，当其分裂为2 210108 8个细胞时个细胞时，即可平均发生一次突变的突变率也是，即可平均发生一次突变的突变率也是1010-8-8。（二）突变率（二）突变率（mutation rate）基因突变的基因突变的 7 个共同点个共同点（1）自发性自发性各种性状的突变，各种性状的突变，可在无人为的诱变因素处理下自发地产生。可在无人为的诱变因素处理下自发地产生。（三)基因突变的特点（p200）（2）非对应性非对应性突变的性状与引起突变的原因间突变的性状与引起突变的原因间无直接的对应关系。
29、无直接的对应关系。这是突变的一个重要特点，也是容易引起争论的问题这是突变的一个重要特点，也是容易引起争论的问题（3）稀有性稀有性自发突变虽可随时发生，自发突变虽可随时发生，但其突变率却是极低和稳定的，一般在但其突变率却是极低和稳定的，一般在1010-6-61010-9-9间。间。某基因的突变率不受它种基因突变率的影响。某基因的突变率不受它种基因突变率的影响。（5）可）可诱变性诱变性自发突变的频率可因自发突变的频率可因 诱变剂诱变剂（mutagen）的影响而大的影响而大为提高（为提高（101010105 5倍）。倍）。（4）独立性独立性基因突变后的新遗传性状是稳定的、可遗传的。基因突变后的新遗传
30、性状是稳定的、可遗传的。野生型菌株某一性状可发生野生型菌株某一性状可发生 正向突变正向突变（forward mutation），也可发生相反的，也可发生相反的 回复突变回复突变（reverse mutation或或back mutation ，也称，也称回变回变）。（7）可逆性可逆性（6）稳定性稳定性诱发突变诱发突变 简称简称 诱变诱变，是指通过人为的方法，利用，是指通过人为的方法，利用物理、化学或生物因素显著提高基因自发突变频率的手段物理、化学或生物因素显著提高基因自发突变频率的手段1.1.诱发突变诱发突变（induced mutation）凡具有诱变效应的任何因素，都称凡具有诱变效应的任何
31、因素，都称 诱变剂诱变剂（mutagen）。（五）基因突变及机制（五）基因突变及机制 p202诱变机制 移码突变 染色体畸变 碱基的置换（1）碱基的置换）碱基的置换 直接引起置换的诱变剂直接引起置换的诱变剂HNO2CNH2腺嘌呤CO次黄嘌呤(Hk)A.THe.THk.THk.CA.THk.CG.CCOH次黄嘌呤(He)间接引起置换的诱变剂间接引起置换的诱变剂碱基的置换 COHT：烯醇式CT：酮式OA.TT.AG.CA.T酮式T.G烯醇式（2）移码突变 分子中缺失或增加少数几个碱基对而引起分子中缺失或增加少数几个碱基对而引起造成突变点以后全部遗传密码转录与转释发生错误造成突变点以后全部遗传密码转
32、录与转释发生错误ABC ABCABCABCABCABCABCABCAB+ABC ABCCBA CBA CBA CBA CBAABC BCA BCA BCABCABCABCABCA增添一个碱基增添一个碱基缺少一个碱基缺少一个碱基（3)染色体畸变 某些理化因子，如射线，紫外线，亚硝酸等，除能引起点突变外，还会引起DNA分子大损伤，包括染色体易位，倒位，缺失，重复等，即为染色体畸变。2.2.自发突变自发突变（spontaneous mutation）(p206)自发突变自发突变（spontaneous mutation）是指生物是指生物体在无人工干预下自然发生的低频率突变。体在无人工干预下自然发生的
33、低频率突变。自发突变的原因自发突变的原因（1 1）背景辐射和环境因素）背景辐射和环境因素（3 3）DNADNA复制过程中碱基配对错误复制过程中碱基配对错误（2 2）微生物自身有害代谢产物）微生物自身有害代谢产物一个一个1000bp1000bp的基因自发突变频率约为的基因自发突变频率约为1010-6-6例如，过氧化氢等例如，过氧化氢等例如，天然的宇宙射线等例如，天然的宇宙射线等（六）紫外线对（六）紫外线对DNADNA的损伤及其修复的损伤及其修复嘧啶（敏感性）嘌呤嘧啶（敏感性）嘌呤紫外线紫外线（ultraviolet ray，U.V.U.V.）嘧啶二聚体嘧啶二聚体（TTTT，TCTC，CCCC）和
34、水合物和水合物二、突变与育种（二、突变与育种（p208）（一）自发突变与育种1.从生产中选育2.定向培育优良品种（二）诱变育种 从青霉素产量看诱变育种诱变育种的基本环节诱变育种的原则（二）诱变育种（二）诱变育种（breeding by induced mutation）诱变育种诱变育种 是指利用物理、化学等诱变剂处理是指利用物理、化学等诱变剂处理均匀而分散的微生物细胞群，在促进其突变率显著均匀而分散的微生物细胞群，在促进其突变率显著提高的基础上，采用简便、快速和高效的提高的基础上，采用简便、快速和高效的 筛选方筛选方法法，从中挑选出，从中挑选出少数符合育种目的的突变株少数符合育种目的的突变株，
35、以，以供科学实验或生产实践使用。供科学实验或生产实践使用。筛选筛选诱变诱变诱诱变变育育种种定向的定向的更重要更重要随机的随机的 效价：指有效成分的浓度。1ug/ul称为1 单位1945时间1943194319431947195519711977目前发酵单位(u/ml)10025050085085080002万5万510万 从从 青青 霉霉 素素 产产 量量 看看 诱诱 变变 育育 种种可获得供工业和实验室应用的各种菌株；可获得供工业和实验室应用的各种菌株；提高有用代谢产物的产量；提高有用代谢产物的产量；减少杂质、提高产品质量、扩大品种和简化工艺等。减少杂质、提高产品质量、扩大品种和简化工艺等。
36、诱变育种具有重大的实践意义诱变育种具有重大的实践意义1.诱变育种的基本环节（p209）大多死亡大多死亡少数存活少数存活存活率存活率多数未变多数未变少数突变少数突变突变率突变率多数负变多数负变少数正变少数正变正变率正变率多数幅度小多数幅度小少数幅度大少数幅度大高产率高产率投产率投产率多数不宜投产多数不宜投产少数适宜投产少数适宜投产出发菌株出发菌株计算出计算出诱变诱变出发菌株出发菌株纯化、同步培养纯化、同步培养培养液培养液离心收集细胞，洗涤，制菌悬液玻璃珠打散，过滤离心收集细胞，洗涤，制菌悬液玻璃珠打散，过滤细胞或孢子悬液细胞或孢子悬液诱变处理诱变处理平板分离平板分离初筛初筛复筛复筛保藏及扩大试验
37、保藏及扩大试验活菌计数，诱变预备试验活菌计数，诱变预备试验存活细胞计数，致死率计算存活细胞计数，致死率计算变异率计算变异率计算2.诱变育种工作中应考虑的几个原则选优良的出发菌株选择简便有效的诱变剂处理单孢子（或单细胞）悬液选用最适剂量设计或采用高效筛选方案或方法利用复合处理的协同效应利用和创造形态，生理与产量间的相关指标（1）选择简便有效的诱变剂）选择简便有效的诱变剂出发菌株含诱变剂的液体培养基接种培养培养接种分离紫外线选择优良突变株S.t.his回变S.t.his 吸入滤纸片保温可疑“三致”试样 鼠肝匀浆（含羟化酶）阳性阴性 利用回变检测致癌剂利用回变检测致癌剂 艾姆斯试验法艾姆斯试验法（p
38、210）平板上无大量菌落出现，说明样品不含诱变剂；平板上无大量菌落出现，说明样品不含诱变剂；v 有抑制圈出现，并在外围长满大量菌落，说明浓度过高；有抑制圈出现，并在外围长满大量菌落，说明浓度过高；v 在滤紙片周围长满菌落说明浓度合适。在滤紙片周围长满菌落说明浓度合适。该法广泛用于监测食品饮料药物等试样中的致该法广泛用于监测食品饮料药物等试样中的致 癌物时间癌物时间3天，准确率天，准确率85%。（2）挑选优良的出发菌株（p211）生产中用过的自发变异菌株采用具有有利性状的菌株采用已发生其他变异的菌株采用前体或最终产物代谢高的菌株采用增变菌株（3）处理单孢子（或单细胞）悬液芽孢杆菌应处理芽孢放线菌
39、，霉菌应处理孢子细菌指数期，放线菌霉菌要稍加萌发后使用出发菌株应制成均匀悬夜（4 4）选用最适剂量）选用最适剂量剂量以诱变剂浓度和处理时间来表示合适剂量：能扩大变异幅度又能促使 变异移向正变范围的剂量（5）充分利用复合处理的协同效应两种或多种诱变剂先后使用同种诱变剂重复使用两种或多种诱变剂同时使用（6）利用和创造形态，生理与产量间的相关指标淀粉酶变色圈试验变色圈大的为淀粉酶高产菌落在琼脂平板上，通过观察测定某突变菌落周围在琼脂平板上，通过观察测定某突变菌落周围蛋白酶水解圈蛋白酶水解圈的大小、的大小、淀粉酶变色圈淀粉酶变色圈（用碘液使淀粉显色）的大小，（用碘液使淀粉显色）的大小，氨基酸显色圈氨基
40、酸显色圈（将菌落用打孔机取下，转移到滤纸上，再用茚三酮（将菌落用打孔机取下，转移到滤纸上，再用茚三酮试剂显色）的大小，试剂显色）的大小，柠檬酸变色圈柠檬酸变色圈（可在厚滤纸上培养，用溴甲酚绿作指示剂）的大小（可在厚滤纸上培养，用溴甲酚绿作指示剂）的大小，抗生素抑制圈抗生素抑制圈的大小，的大小，指示菌生长圈指示菌生长圈的大小（测定生长因子产生），的大小（测定生长因子产生），纤维素酶对纤维素水解圈纤维素酶对纤维素水解圈（用刚果红染色）的大小，（用刚果红染色）的大小，外毒素的沉淀反应圈外毒素的沉淀反应圈的大小等，的大小等，均可为初筛工作中估计某突变株代谢产物量的均可为初筛工作中估计某突变株代谢产物量
41、的“形态形态”指标。指标。（7）设计或采用高效筛选方案或方法）设计或采用高效筛选方案或方法设计简便、高效的科学筛选方案。设计简便、高效的科学筛选方案。初筛初筛筛选工作筛选工作复筛复筛以量为主（选留较多有生产潜力的菌株）以量为主（选留较多有生产潜力的菌株）以质为主（对少量潜力大的菌株的代谢产物量作精确测定）以质为主（对少量潜力大的菌株的代谢产物量作精确测定）一个出发菌株诱变剂处理选出200个单 孢子菌菌株初筛（每株1瓶）选出50株复筛（每株4瓶）选出5 株第一轮第一轮第二轮第二轮五个出发菌株初筛（每株1瓶）选出50株复筛（每株4瓶）选出5 株40株40株40株40株40株诱变剂处理初初 筛筛复复
42、 筛筛对产量突变株生产性能的测定方法对产量突变株生产性能的测定方法粗测为主粗测为主在培养皿平板上在培养皿平板上在摇瓶中在摇瓶中（8 8）创造新型筛选方法）创造新型筛选方法较精确的测定较精确的测定摇瓶培养摇瓶培养oror台式自控发酵罐培养台式自控发酵罐培养3.3.突变株的筛选方法突变株的筛选方法(p212(p212）高产突变菌株的筛选方法 抗性突变体的筛选方法 营养缺陷型的的筛选方法 与突变株的筛选相关的几个概念（1 1）产量突变株的筛选）产量突变株的筛选 19711971年，国外有人报道了筛选春日霉年，国外有人报道了筛选春日霉素（素（kasugamycin，即，即“春雷霉素春雷霉素”）生产）生
43、产菌时所采用的一种菌时所采用的一种 琼脂块培养法琼脂块培养法，一年，一年内曾使该抗生素产量提高内曾使该抗生素产量提高1010倍。倍。此法的关键是用此法的关键是用打孔打孔器器取出含有一个小菌落的取出含有一个小菌落的琼脂块作分别培养。这样琼脂块作分别培养。这样，各琼脂块所含养料和接，各琼脂块所含养料和接触空气面积基本相同，且触空气面积基本相同，且产生的抗生素等代谢产物产生的抗生素等代谢产物不致扩散出琼脂块外。不致扩散出琼脂块外。数据精确，效率高数据精确，效率高（2 2）抗药性突变株的筛选）抗药性突变株的筛选 基因突变使菌株对某种或某几种药物，特别是抗生基因突变使菌株对某种或某几种药物，特别是抗生素
44、，产生抗性。素，产生抗性。特点：特点：正选择标记正选择标记（突变株可直接从抗性平板上获得（突变株可直接从抗性平板上获得-在加有相应抗生素在加有相应抗生素的平板上，只有抗性突变能生长。所以很容易分离得到。）的平板上，只有抗性突变能生长。所以很容易分离得到。）梯度平板法梯度平板法（gradient plate）是是 定向筛选抗定向筛选抗药性突变株药性突变株 的一种有效方法，通过制备琼脂表面存的一种有效方法，通过制备琼脂表面存在药物浓度梯度的平板、在其上涂布诱变处理后的在药物浓度梯度的平板、在其上涂布诱变处理后的细胞悬液、经培养后再从其上选取抗药性菌落等步细胞悬液、经培养后再从其上选取抗药性菌落等步
45、骤，就可定向筛选到相应抗药性突变株。骤，就可定向筛选到相应抗药性突变株。梯度平板法梯度平板法（gradient plate）是定向筛选抗药性突变株的一种有效方法。是定向筛选抗药性突变株的一种有效方法。表示方法：表示方法：所抗药物的前三个小写斜体英文字母加上所抗药物的前三个小写斜体英文字母加上“r”。strrstrs对链霉素的对链霉素的抗性抗性敏感性敏感性（3 3）营养缺陷型突变株的筛选）营养缺陷型突变株的筛选 营养缺陷型突变株营养缺陷型突变株（auxotrophic mutant）在生物学基础理论和应用研究以及生产实践上都有在生物学基础理论和应用研究以及生产实践上都有极其重要的意义。极其重要的
46、意义。营养缺陷型的表示方法：营养缺陷型的表示方法：基因型：基因型：所需营养物的前三个英文小写斜体字母表示：所需营养物的前三个英文小写斜体字母表示：hisC（组氨酸缺陷型，其中的大写字母（组氨酸缺陷型，其中的大写字母C同一表型中不同基因的突变）同一表型中不同基因的突变）表型：表型：同上，但第一个字母大写，且不用斜体：同上，但第一个字母大写，且不用斜体：HisC在具体使用时多用在具体使用时多用hisC-和和hisC+，分别表示缺陷型和野生型。，分别表示缺陷型和野生型。a.基本培养基基本培养基（MM，符号为），符号为）与筛选营养缺陷型突变株有关的与筛选营养缺陷型突变株有关的3类培养基类培养基 仅能满
47、足某微生物的野生型菌株生长所需的仅能满足某微生物的野生型菌株生长所需的最低成分的组合培养基，称最低成分的组合培养基，称MM。b.完全培养基完全培养基（complete medium，CM，符号为），符号为）凡可满足一切营养缺陷型菌株营养需要的天凡可满足一切营养缺陷型菌株营养需要的天然或半组合培养基，称为然或半组合培养基，称为CM。一般可在基本培养基中加入一些富含氨基酸、维生一般可在基本培养基中加入一些富含氨基酸、维生素、核苷酸和碱基之类的天然物质，如蛋白胨或酵母膏素、核苷酸和碱基之类的天然物质，如蛋白胨或酵母膏等配制而成。等配制而成。c.补充培养基补充培养基（supplemental medi
48、um，SM，符号，符号为为A或或B等）等）凡只能满足相应的营养缺陷型突变株生长需凡只能满足相应的营养缺陷型突变株生长需要的组合或半组合培养基，称为要的组合或半组合培养基，称为SM。在基本培养基上再添加对某一营养缺陷型突变株所在基本培养基上再添加对某一营养缺陷型突变株所不能合成的某相应代谢产物所组成，可专门选择相应的不能合成的某相应代谢产物所组成，可专门选择相应的突变株。突变株。原养型原养型（prototroph）与营养缺陷型突变有关的与营养缺陷型突变有关的3类遗传型个体类遗传型个体野生型野生型（wild type，wild strain）营养缺陷型营养缺陷型（auxotroph）从自然界分离到
49、的原始菌株（从自然界分离到的原始菌株（AB）经诱变剂处理后的突变株（经诱变剂处理后的突变株（AB）经回复突变或重组后产生的菌株（经回复突变或重组后产生的菌株（AB）营养缺陷型的筛选办法(p215)1.诱变剂处理2.淘汰野生型3.检出缺陷型夹层培养法限量补充培养法逐个检出法影印平板法4.鉴定缺陷型基本培养基基本培养基（MM）-：凡是能满足野生型菌株营养要求的凡是能满足野生型菌株营养要求的最低成分的合成培养基。最低成分的合成培养基。完全培养基完全培养基（CM）+：满足一切营养缺陷型菌株生长的天满足一切营养缺陷型菌株生长的天然或半合成培养基。然或半合成培养基。补充培养基补充培养基（SM）x：在在MM
50、中有针对性地加入一或几种中有针对性地加入一或几种营养成分以满足相应营养缺陷型菌株生长的合成培养基。营养成分以满足相应营养缺陷型菌株生长的合成培养基。与筛选与筛选营养缺陷型突变株相关的突变株相关的3 3类培养基类培养基三类遗传型三类遗传型野生型野生型 AA+B B+营养缺陷型型营养缺陷型型AA+B B-原养型原养型 AA+B B+与与营养缺陷型突变相关的突变相关的3 3类遗传型个体类遗传型个体 （p215p215）夹层培养法（p216）夹层培养法及结果小菌落是第二次长起来的（营养缺陷型）限量补充培养法 微量蛋白质的完全培养基上 小菌落是营养缺陷型突变株 逐个检出法涂布培养基本培养基上不长菌落完全
