1、第二节第二节 菌种来源菌种来源微生物工程工业生产水平微生物工程工业生产水平的三个决定要素的三个决定要素:生产菌种的性能生产菌种的性能发酵和提取工艺条件发酵和提取工艺条件生产设备生产设备获得优良的生产菌种是实现获得优良的生产菌种是实现高水平微生物工程工高水平微生物工程工业生产业生产的第一环节的第一环节.一、菌种分离与筛选工作程序一、菌种分离与筛选工作程序 发酵工业上使用的微生物菌种，最初都是从自然界发酵工业上使用的微生物菌种，最初都是从自然界中分离筛选出来的。中分离筛选出来的。分离与筛选菌种的具体做法一般分分离与筛选菌种的具体做法一般分4 4个步骤：个步骤：样品采集样品采集增殖培养增殖培养纯种分
2、离纯种分离生产性能测定生产性能测定 调查研究（包括资料查阅）调查研究（包括资料查阅）试验方案设计试验方案设计 采样采样第一次增殖培养第一次增殖培养第一次平板分离第一次平板分离第二次增殖培养第二次增殖培养第二次平板分离第二次平板分离增殖条件探索增殖条件探索根据实际情况进根据实际情况进行定量或半定量行定量或半定量测定测定第一次原种斜面第一次原种斜面第二次原种斜面第二次原种斜面初筛初筛（1 1株株1 1瓶）瓶）定量或半定量测定定量或半定量测定筛筛 选选 工工 作作 程程 序序第三次平板分离第三次平板分离第三次原种斜面第三次原种斜面复筛复筛第四次平板分离第四次平板分离不纯不纯第四次原种斜面第四次原种斜
3、面再复筛再复筛种子培养种子培养初步工艺条件摸索初步工艺条件摸索较优菌株较优菌株1 1株株3-53-5瓶瓶保藏及进一步做生产性能试保藏及进一步做生产性能试验或作为育种的出发菌株验或作为育种的出发菌株某些必要试验和毒性试验某些必要试验和毒性试验第三次菌种保藏第三次菌种保藏二、分离与筛选的设计要求二、分离与筛选的设计要求在筛选所需菌株时应考虑以下一些重要指标：在筛选所需菌株时应考虑以下一些重要指标：1 1、菌的营养特征、菌的营养特征一般要求采用廉价的培养基或使用来源丰一般要求采用廉价的培养基或使用来源丰富的原料富的原料2 2、菌的生长温度、菌的生长温度3 3、菌的稳定性、菌的稳定性4 4、菌的产物得
4、率和产物在培养液中的浓度、菌的产物得率和产物在培养液中的浓度5 5、菌对所采用的设备和生产过程的适应性、菌对所采用的设备和生产过程的适应性6 6、容易从培养液中回收产物、容易从培养液中回收产物3-63-6是用来衡量菌种的生产性能，如能满足这几条，是用来衡量菌种的生产性能，如能满足这几条，便有希望成为效益高的生产菌株便有希望成为效益高的生产菌株三、含微生物样品的采集三、含微生物样品的采集较复杂；应根据分离目的灵活掌握较复杂；应根据分离目的灵活掌握土壤土壤（丰富、丰富、5-25cm5-25cm、土质、酸碱度、植被状况、地理条件、季节）、土质、酸碱度、植被状况、地理条件、季节）食品食品 、海水、动物
5、、植物、极端环境、海水、动物、植物、极端环境 根据微生物的营养类型采样根据微生物的营养类型采样森林土中有相当多枯枝落叶和腐烂的木头，富含纤维素，适合利用纤维素作碳源的纤维素酶产生菌生长。肉类加工厂附近、饭店排污沟，易分离到蛋白酶和脂肪酶肉类加工厂附近、饭店排污沟，易分离到蛋白酶和脂肪酶产生菌。产生菌。面粉加工厂等场所易分离到产淀粉酶、糖化酶的菌面粉加工厂等场所易分离到产淀粉酶、糖化酶的菌根据微生物的生理特性采样根据微生物的生理特性采样筛选高温酶产生菌通常从温泉、火山爆发处、堆肥等采样筛选高温酶产生菌通常从温泉、火山爆发处、堆肥等采样；筛选产低温酶的微生物，可从冰窖、南极、深海等采样分离耐高渗透
6、压酵母菌，可到甜果、蜜饯、甘蔗渣堆积处采样杨尺蠖赤松毛虫侧柏毛虫四、含微生物样品的富集培养四、含微生物样品的富集培养富集富集(enrichment)培养培养 是在目的微生物含量较少时，根据微生物的生理特点，设计一种选择性培养基，创造有利的生长条件，使目的微生物在最适的环境下迅速地生长繁殖，数量增加，由原来自然条件下的劣势种变成人工环境下的优势种，以利分离到所需的菌株。其要领是提供一些有利于所需菌株生长或不利于其他其要领是提供一些有利于所需菌株生长或不利于其他菌型生长的条件。包括菌型生长的条件。包括：控制培养基的营养成分；控制控制培养基的营养成分；控制培养条件；抑制不需要的菌类等培养条件；抑制不
7、需要的菌类等。控制氧可将好氧微生物和厌氧微生物分开；控制氧可将好氧微生物和厌氧微生物分开；高温下培养可将嗜热微生物和非嗜热微生物分开；高温下培养可将嗜热微生物和非嗜热微生物分开；控制控制pHpH可分离嗜酸或嗜碱微生物；可分离嗜酸或嗜碱微生物；高糖或高盐培养基可分离耐高渗透压微生物；高糖或高盐培养基可分离耐高渗透压微生物；根据微生物对环境因子的根据微生物对环境因子的耐受范围具有可塑性耐受范围具有可塑性的特点，可通过连续富集培养的方法分离降解的特点，可通过连续富集培养的方法分离降解高浓度污染物的高浓度污染物的环保菌环保菌。如降解苯胺的微生物分离。可以苯胺为唯一碳源对样品如降解苯胺的微生物分离。可以
8、苯胺为唯一碳源对样品进行富集培养，待底物完全降解后，再以一定接种量转进行富集培养，待底物完全降解后，再以一定接种量转接到新鲜的含苯胺的富集培养液中，如此连续移接培养接到新鲜的含苯胺的富集培养液中，如此连续移接培养次数。同时将苯胺浓度逐步提高，并可得到降解苯胺占次数。同时将苯胺浓度逐步提高，并可得到降解苯胺占优势的菌株培养液，采用稀释涂布法或平板划线法进一优势的菌株培养液，采用稀释涂布法或平板划线法进一步分离，即可得到能降解高浓度苯胺的微生物。步分离，即可得到能降解高浓度苯胺的微生物。需注意，所需菌型生长的结果有时会改变培养基的需注意，所需菌型生长的结果有时会改变培养基的性质，从而改变选择压力。
9、性质，从而改变选择压力。重复移植几次后接种少量已富集的培养物到固体培重复移植几次后接种少量已富集的培养物到固体培养基上。养基上。移植时间是关键，应在所需菌种确已占优势的情况移植时间是关键，应在所需菌种确已占优势的情况下进行。下进行。五、利用固体平板的生化反应进行分离五、利用固体平板的生化反应进行分离 利用特殊的分离培养对大量混杂微生物进行初利用特殊的分离培养对大量混杂微生物进行初步分离的方法。步分离的方法。分离培养基是根据目的微生物特殊的生理特性分离培养基是根据目的微生物特殊的生理特性或利用某些代谢产物生化反应来设计的。或利用某些代谢产物生化反应来设计的。可显著提高分离效率可显著提高分离效率
10、透明圈法透明圈法 变色圈法变色圈法 生长圈法生长圈法 抑菌圈法抑菌圈法 透明圈法透明圈法 分离分离水解酶产生菌水解酶产生菌时较多采用，如蛋白酶、淀粉时较多采用，如蛋白酶、淀粉酶、脂肪酶、核酸酶等；酶、脂肪酶、核酸酶等；在平板培养基中加入在平板培养基中加入溶解性较差的底物溶解性较差的底物，使，使培培养基混浊养基混浊；能能分解底物分解底物的微生物便会在的微生物便会在菌落周围产生透明菌落周围产生透明圈圈，圈的大小圈的大小初步反应菌株初步反应菌株利用底物的能力利用底物的能力。土壤经巴氏消毒，以减少不产芽孢的微生物；然后铺在土壤经巴氏消毒，以减少不产芽孢的微生物；然后铺在pH8-9的琼脂培养基（含有均匀
11、的不溶性蛋白质）表面；的琼脂培养基（含有均匀的不溶性蛋白质）表面；碱性蛋白酶产生菌能消化平板上的碱性蛋白酶产生菌能消化平板上的不溶性蛋白质不溶性蛋白质，产生，产生一透明圈。一透明圈。例如用此法分离产生碱性蛋白酶的芽孢杆菌例如用此法分离产生碱性蛋白酶的芽孢杆菌 分离某种分离某种产生有机酸产生有机酸的菌株时，也通常采用透明圈法的菌株时，也通常采用透明圈法初筛初筛 在选择培养基中加入在选择培养基中加入碳酸钙碳酸钙，使平板呈混浊状，产酸，使平板呈混浊状，产酸菌能够把菌落周围的碳酸钙水解，形成清晰的透明圈菌能够把菌落周围的碳酸钙水解，形成清晰的透明圈聚赖氨酸产生菌聚赖氨酸产生菌 （利用产正电分泌物的菌株
12、和美蓝之（利用产正电分泌物的菌株和美蓝之间的静电作用而形成独特的透明圈间的静电作用而形成独特的透明圈,从而灵敏地筛选得从而灵敏地筛选得到产聚赖氨酸产生菌的菌株到产聚赖氨酸产生菌的菌株)将待测菌株接种于蛋黄培养基平板上培养，在菌落周围产将待测菌株接种于蛋黄培养基平板上培养，在菌落周围产生晕圈（溶脂圈和透明圈）的菌株作为定性筛选解有机磷生晕圈（溶脂圈和透明圈）的菌株作为定性筛选解有机磷细菌的判断依据，以晕圈直径与菌落直径比例的大小作为细菌的判断依据，以晕圈直径与菌落直径比例的大小作为解磷能力大小初筛的判定指标解磷能力大小初筛的判定指标 溶脂圈溶脂圈 透明圈透明圈 如何筛选磷细菌？如何筛选磷细菌？透
13、明圈的大小透明圈的大小不能完全作为不能完全作为选择高产菌的依据选择高产菌的依据，因为在深层培养中的产酶单位与平板上圈的大小之因为在深层培养中的产酶单位与平板上圈的大小之间并不完全成正比。间并不完全成正比。但作为但作为初筛的手段初筛的手段是有意义的是有意义的2 2、抑菌圈法、抑菌圈法 常用于抗生素产生菌的分离筛选常用于抗生素产生菌的分离筛选据估计，筛选据估计，筛选1 1万个菌株才能得到万个菌株才能得到1 1株有用的抗生素株有用的抗生素产生菌；因此，设计一个准确、快速的筛选模型十产生菌；因此，设计一个准确、快速的筛选模型十分重要。分重要。抑菌圈法是常用的初筛方法抑菌圈法是常用的初筛方法 工具菌采用
14、抗生素的敏感菌工具菌采用抗生素的敏感菌若被检菌能分泌某些抑制菌生长的物质，如抗生素等，若被检菌能分泌某些抑制菌生长的物质，如抗生素等，便会在该菌落周围形成工具菌不能生长的抑菌圈便会在该菌落周围形成工具菌不能生长的抑菌圈3 3、生长因子产生菌的分离、生长因子产生菌的分离 通过观察分离菌能否促进营养缺陷型菌株的生长，通过观察分离菌能否促进营养缺陷型菌株的生长，来检测生长因子产生菌。来检测生长因子产生菌。分离培养基上培养分离培养基上培养被杀死的菌落周围有被杀死的菌落周围有无检测菌的生长圈无检测菌的生长圈影印到能支持生长因子产影印到能支持生长因子产生菌生长的培养基上生菌生长的培养基上UvUv照射杀死菌
15、落照射杀死菌落铺上一层含相应生铺上一层含相应生长因子缺陷型菌株长因子缺陷型菌株第三节菌种选育第三节菌种选育菌种选育菌种选育 应用微生物遗传和变异理论，用人工方法应用微生物遗传和变异理论，用人工方法(或自然或自然)造成造成变异，再经过筛选以得到人们所需菌种的过程变异，再经过筛选以得到人们所需菌种的过程 。菌种选育的目的是为了不断菌种选育的目的是为了不断提高发酵工业产品的产量提高发酵工业产品的产量和质量和质量，增加新产品和适应工艺改革的要求。，增加新产品和适应工艺改革的要求。菌种选育的方向是选育菌种选育的方向是选育“吃粗粮吃粗粮”、耐高温、生长快、耐高温、生长快、代谢旺、产量高、质量好、无毒性代谢
16、旺、产量高、质量好、无毒性的优良菌株。的优良菌株。自然选育自然选育诱变育种诱变育种杂交育种杂交育种 (有性、准性有性、准性)原生质体融合育种原生质体融合育种基因工程育种基因工程育种一、自然选育一、自然选育 在生产过程中，不经过人工处理，利用菌种的自发突在生产过程中，不经过人工处理，利用菌种的自发突变而进行菌种筛选的过程叫自然选育。变而进行菌种筛选的过程叫自然选育。自发突变自发突变(spontaneous mutation)(spontaneous mutation)，也称自然突变，指，也称自然突变，指某些微生物在没有人工参与下所发生的那些突变，但这决不某些微生物在没有人工参与下所发生的那些突变
17、，但这决不意味着这种突变是没有原因的。意味着这种突变是没有原因的。一般认为引起自然突变有两个原因：即多因素低剂量的诱一般认为引起自然突变有两个原因：即多因素低剂量的诱变效应和互变异构效应。变效应和互变异构效应。多因素低剂量的诱变效应是指自然突变实际上是由一些多因素低剂量的诱变效应是指自然突变实际上是由一些原因不详的低剂量诱变因素引起的长期综合效应，例如充满宇原因不详的低剂量诱变因素引起的长期综合效应，例如充满宇宙空间的各种短波辐射、自然界中普遍存在的一些低浓度诱变宙空间的各种短波辐射、自然界中普遍存在的一些低浓度诱变物质以及微生物自身代谢活动中所产生的一些诱变物质（如过物质以及微生物自身代谢活
18、动中所产生的一些诱变物质（如过氧化氢等）氧化氢等）自然突变两种情况：自然突变两种情况：生产上所不希望的：生产上所不希望的：菌种的衰退和生产质量下菌种的衰退和生产质量下 降降 对生产有益的：对生产有益的：生产性能提高生产性能提高制备单孢子（单细胞）悬液制备单孢子（单细胞）悬液 适当稀释适当稀释在固体平板上分离在固体平板上分离挑取部分单菌落进行生产能力测定挑取部分单菌落进行生产能力测定经反复筛选以确定生产能力更高的菌株替代原来的菌株经反复筛选以确定生产能力更高的菌株替代原来的菌株自然选育的一般程序：自然选育的一般程序：自然选育简单易行，可以达到自然选育简单易行，可以达到纯化菌种、防止菌纯化菌种、防
19、止菌种衰退、稳定生产、提高产量种衰退、稳定生产、提高产量等目的。等目的。自然选育的最大缺点是自然选育的最大缺点是效率低、进展慢，很难效率低、进展慢，很难使生产水平大幅度提高使生产水平大幅度提高。二、二、诱变育种诱变育种诱变育种诱变育种就是人为地利用就是人为地利用物理或化学等物理或化学等因素，使诱变因素，使诱变对象细胞内的遗传物质发生变化，引起突变，并通过筛选对象细胞内的遗传物质发生变化，引起突变，并通过筛选获得符合要求的变异菌株获得符合要求的变异菌株的一种育种方法。的一种育种方法。诱变育种不仅可以诱变育种不仅可以提高菌种的生产能力提高菌种的生产能力，且可，且可改进产品改进产品质量质量、扩大品种
20、和简化生产工艺扩大品种和简化生产工艺。目前发酵工业中应用的生产菌株大部分是诱变育种得来的。目前发酵工业中应用的生产菌株大部分是诱变育种得来的。以青霉素为例，以青霉素为例，19431943年开始生产时的效价仅为年开始生产时的效价仅为20U/ml20U/ml，通过多，通过多次诱变育种现已达次诱变育种现已达50000-100000U/ml50000-100000U/ml。虽然遗传工程等新的育种方法迅速发展，但诱变育种仍是虽然遗传工程等新的育种方法迅速发展，但诱变育种仍是目前广泛使用的育种手段。目前广泛使用的育种手段。诱变育种的一般步骤诱变育种的一般步骤原始菌株（出发菌株）原始菌株（出发菌株）细胞或孢
21、子悬液制备细胞或孢子悬液制备活细胞计数活细胞计数诱变剂处理诱变剂处理活细胞计数活细胞计数中间培养中间培养突变株分离突变株分离初筛初筛复筛复筛生产性能试验生产性能试验诱变预备处理诱变预备处理诱诱 变变 育育 种种 的的 工工 作作 程程 序序一）一）细菌杂交育种细菌杂交育种转导转导转化转化接合接合 三、杂交育种三、杂交育种二）二）放线菌杂交育种放线菌杂交育种 放线菌和细菌一样属于原核微生物，但却像放线菌和细菌一样属于原核微生物，但却像霉菌那样以菌丝形态生长，且形成分生孢子，所霉菌那样以菌丝形态生长，且形成分生孢子，所以就本质来说，放线菌的基因重组过程近似于细以就本质来说，放线菌的基因重组过程近似
22、于细菌，但就育种方法来说，却有许多与霉菌相似的菌，但就育种方法来说，却有许多与霉菌相似的方面。方面。放线菌杂交技术放线菌杂交技术混合培养法混合培养法玻璃纸法玻璃纸法平板杂交法平板杂交法三）酵母菌杂交育种三）酵母菌杂交育种酿酒酵母生活史酿酒酵母生活史 酵母菌可采用有性杂交育种酵母菌可采用有性杂交育种制备子囊孢子制备子囊孢子 杂交杂交 选择重组子选择重组子 四四)霉菌杂交育种霉菌杂交育种有性杂交有性杂交 (如根霉如根霉)准性杂交准性杂交 (如构巢曲霉、青霉等如构巢曲霉、青霉等)四、原生质体融合育种四、原生质体融合育种原生质体融合（原生质体融合（protoplast fusionprotoplast
23、 fusion）育种是杂交育种育种是杂交育种（基因重组）育种的一种特殊方式（基因重组）育种的一种特殊方式 通过基因重组可以使基因组成发生较大的改变，随之通过基因重组可以使基因组成发生较大的改变，随之使生物的性状发生变化。使生物的性状发生变化。但对微生物育种来说，有性重组的局限性很大。因为但对微生物育种来说，有性重组的局限性很大。因为迄今发现有性杂交现象的微生物为数不多，在有工业价值迄今发现有性杂交现象的微生物为数不多，在有工业价值的微生物中则更少；而且即使发生杂交，遗传重组的频率的微生物中则更少；而且即使发生杂交，遗传重组的频率也不高，这就妨碍了基因重组在微生物育种中作用；另外，也不高，这就妨
24、碍了基因重组在微生物育种中作用；另外，转化、转导等现象在微生物中亦不普遍。转化、转导等现象在微生物中亦不普遍。原生质体融合技术打破了这种不能充分利用遗原生质体融合技术打破了这种不能充分利用遗传重组的局面传重组的局面一）原生质体融合的概念一）原生质体融合的概念 就是把两个亲本的细胞分别去掉细胞壁，就是把两个亲本的细胞分别去掉细胞壁，获得原生质体，将两亲本的原生质体在高渗条件获得原生质体，将两亲本的原生质体在高渗条件下混合，由聚乙二醇（下混合，由聚乙二醇（PEGPEG）作为助融剂，使它们）作为助融剂，使它们互相凝集，发生细胞质融合，接着两亲本基因组互相凝集，发生细胞质融合，接着两亲本基因组由接触到
25、交换，从而实现遗传重组。由接触到交换，从而实现遗传重组。1、大幅度提高亲本之间重组频率。、大幅度提高亲本之间重组频率。原生质体剥离了细胞壁，去除了细胞间物质交换的主要障碍，也避免了修复系统的制约；再加上促融剂的诱导作用，重组频率显著提高。2、扩大重组的亲本范围。、扩大重组的亲本范围。二）原生质体融合育种的优点二）原生质体融合育种的优点 如天蓝色链霉菌的种内重组频率可达20%去除了细胞壁的障碍，亲株基因组直接融合、交换，实现重组，不需要有已知的遗传系统。3、原生质体融合时亲本整套染色体参与交换，遗传物、原生质体融合时亲本整套染色体参与交换，遗传物质转移和重组性状较多，集中双亲优良性状机会更大。质
26、转移和重组性状较多，集中双亲优良性状机会更大。4、可以和其它育种方法相结合，把由其他方法得到的优、可以和其它育种方法相结合，把由其他方法得到的优良形状通过原生质体融合再组合到一个单株中。良形状通过原生质体融合再组合到一个单株中。一、菌种保藏原理一、菌种保藏原理 主要是根据菌种的生理生化特点，人工创造条件，使主要是根据菌种的生理生化特点，人工创造条件，使孢子或菌体的生长代谢活动尽量降低，以减少其变异。孢子或菌体的生长代谢活动尽量降低，以减少其变异。一般可通过保持培养基营养成分在最低水平、缺氧状一般可通过保持培养基营养成分在最低水平、缺氧状态、干燥和低温，使菌种处于态、干燥和低温，使菌种处于“休眠
27、休眠”状态，抑制其繁殖状态，抑制其繁殖能力。能力。第四节第四节 菌种保藏菌种保藏二、保藏方法二、保藏方法1 1、斜面冰箱保藏法、斜面冰箱保藏法 4 4 C C ；3-63-6个月个月2 2、沙土管保藏法、沙土管保藏法 产孢子或芽孢微生物，产孢子或芽孢微生物，1 1年年3 3、菌丝速冻法、菌丝速冻法 甘油或二甲基亚砜作为保护剂，甘油或二甲基亚砜作为保护剂，-20-20 C C 4 4、石蜡油封存法、石蜡油封存法 1 1年左右年左右5 5、真空冷冻干燥保藏法、真空冷冻干燥保藏法 任何微生物；一般任何微生物；一般5 5年以上年以上6 6、液氮超低温保藏法、液氮超低温保藏法 -196-196 C C；
28、保护剂；保存期长；保护剂；保存期长三、国内外重要菌种保藏机构三、国内外重要菌种保藏机构1 1、ATCC (American Type Culture Collection)ATCC (American Type Culture Collection)美国标准菌种收藏所，美国标准菌种收藏所，马里兰州，罗克维尔市马里兰州，罗克维尔市2 2、CSH (Cold Spring Harbor Laboratory)CSH (Cold Spring Harbor Laboratory)冷泉港研究室，冷泉港研究室，美国美国3 3、IAM (Institute of Applied IAM (Institut
29、e of Applied Microbiology,University of Tokyo)Microbiology,University of Tokyo)日本东京大学应用微生物研究所，日本东京大学应用微生物研究所，日本东京日本东京4 4、IFO (Institute for Fermentation,Osaka)IFO (Institute for Fermentation,Osaka)发酵研究所，日本大阪发酵研究所，日本大阪5 5、普通微生物菌种保藏管理中心、普通微生物菌种保藏管理中心 （CCGMC CCGMC）中科院微生物所，北京中科院微生物所，北京6 6、工业微生物菌种保藏管理中心、工业微生物菌种保藏管理中心 (CICC)(CICC)轻工部食品发酵工业科学研究所，北京轻工部食品发酵工业科学研究所，北京7 7、中国典型培养物保藏中心（、中国典型培养物保藏中心（CCTCCCCTCC）武汉大学，武汉武汉大学，武汉
