1、2.2、土壤中分解尿素细菌分离与计数、土壤中分解尿素细菌分离与计数（1）从土壤中分离出能够分解尿素的细菌；（2）统计每克土壤样品中究竟含有多少这样的细菌。（一）自然界中目的菌株筛选（一）自然界中目的菌株筛选实例：实例：PCR的自动化需要耐高温的自动化需要耐高温的的 DNA聚合酶，这种酶要能忍受聚合酶，这种酶要能忍受93左右的高温。左右的高温。根据它对生存条件的要求，到相应的环境中去寻找根据它对生存条件的要求，到相应的环境中去寻找提出的问题提出的问题 如何寻找如何寻找耐高温耐高温的酶？的酶？解决问题的思路解决问题的思路 寻找寻找耐高温耐高温环境；环境；原理原理 高温淘汰其他菌，选出耐高温细菌，高
2、温淘汰其他菌，选出耐高温细菌，耐高温菌种提取耐高温酶。耐高温菌种提取耐高温酶。（二）实验室中目的菌株筛选（二）实验室中目的菌株筛选原理：原理：（三）选择性培养基:加入青霉素的培养基加入青霉素的培养基:分离酵母菌、霉菌等真菌分离酵母菌、霉菌等真菌加入高浓度食盐的培养基加入高浓度食盐的培养基:分离金黄色葡萄球菌分离金黄色葡萄球菌不加氮源的无氮培养基不加氮源的无氮培养基:分离固氮菌分离固氮菌不加含碳有机物的无碳培养基不加含碳有机物的无碳培养基:分离自养型微生物分离自养型微生物加入青霉素等抗生素的培养基加入青霉素等抗生素的培养基:分离导入了目的基因的受体细胞分离导入了目的基因的受体细胞分解尿素细菌分离
3、设计分解尿素细菌分离设计:1直接计数法：直接计数法：最常用显微镜直接计数法。最常用显微镜直接计数法。先将待测样品制成悬液，然后取一定量的悬液先将待测样品制成悬液，然后取一定量的悬液放在显微镜下进行计数。根据在显微镜下观察到的放在显微镜下进行计数。根据在显微镜下观察到的微生物数目来计算出单位体积内的微生物总数。微生物数目来计算出单位体积内的微生物总数。优点优点：设备简单、能观察微生物的形态特征。：设备简单、能观察微生物的形态特征。缺点缺点：不能区分死菌和活菌；：不能区分死菌和活菌；难以计数微小的细菌。难以计数微小的细菌。一般用于纯培养悬浮液中各种单细胞菌体的计数。一般用于纯培养悬浮液中各种单细胞
4、菌体的计数。2间接计数法：间接计数法：最常用最常用稀释平板计数法稀释平板计数法。原理：原理：1个个活菌活菌1个个菌落菌落统计原则统计原则 选选 30300 个菌落的平板统计个菌落的平板统计 每个稀释度取每个稀释度取3个平板取个平板取其平均值其平均值注意：菌落计数偏差注意：菌落计数偏差1、统计的菌落数比活菌的实际数目、统计的菌落数比活菌的实际数目 低低。这是因为当。这是因为当两个或多个细胞两个或多个细胞在一起时，平板上观察到的只是在一起时，平板上观察到的只是 一个一个 菌落。因此，统计结果一般用菌落。因此，统计结果一般用 菌落数菌落数 来表示。来表示。2、显微镜直接计数活菌的实际数目、显微镜直接
5、计数活菌的实际数目 高高。这是因为。这是因为计数时连同计数时连同死亡菌体死亡菌体一同计数。一同计数。（CV）MC：某一稀释度下平板上生长的平均菌落数V：涂布平板时所用的稀释液的体积（ml)M：稀释倍数三、对照设置三、对照设置设置对照的主要目的设置对照的主要目的 是是排除实验组中非测试因素对实验结果排除实验组中非测试因素对实验结果的影响，提高实验结果的可信度的影响，提高实验结果的可信度。对照实验是指除了对照实验是指除了 被测试被测试 的条件外，其他条的条件外，其他条件都件都 相同相同 的实验。满足该条件的称为的实验。满足该条件的称为 对照对照组，未满足该条件的称为组，未满足该条件的称为 实验实验
6、 组。组。思考思考6原因：原因：土样不同，土样不同，培养基污染或操作失误（或者是混入了其他的含氮物质培养基污染或操作失误（或者是混入了其他的含氮物质)请设计本实验的对照实验组：请设计本实验的对照实验组：方案方案1：其他同学用：其他同学用A同学的土样进行实验。同学的土样进行实验。方案方案2：A同学以不接种的培养基作为空白对照。同学以不接种的培养基作为空白对照。四、实验设计实验设计实验设计的内容包括实验设计的内容包括实验方案实验方案、材料用具材料用具、实施步骤实施步骤和和时间安排时间安排等。等。实验流程：实验流程：菌落计数菌落计数配制土壤溶液配制土壤溶液系列稀释系列稀释涂布平板与培养涂布平板与培养
7、1、土壤取样、土壤取样土壤微生物主要分布在距地表土壤微生物主要分布在距地表38cm的近的近中中性土壤中，性土壤中，约约7080为细菌。为细菌。2、样品稀释并涂布、样品稀释并涂布分离不同的微生物采用不同的稀释度，其分离不同的微生物采用不同的稀释度，其原因原因是是不同微生物在土壤中含量不同微生物在土壤中含量不同不同，其，其目的目的是是保证获得保证获得菌落数在菌落数在30300之间、适于计数之间、适于计数的平板。的平板。细菌稀释度为细菌稀释度为104、105、106，放线菌稀释度为放线菌稀释度为103、104、105，真菌稀释度为真菌稀释度为102、103、104。如果得到了如果得到了2个或个或2个
8、以上菌落数目在个以上菌落数目在30300的平板，的平板，则说明稀释操作比较成功，并能够进行菌落的计数，如则说明稀释操作比较成功，并能够进行菌落的计数，如果同一稀释倍数的三个重复的菌落数相差较大，表明试果同一稀释倍数的三个重复的菌落数相差较大，表明试验不精确，需要重新实验。验不精确，需要重新实验。3、微生物的培养与观察、微生物的培养与观察1）培养不同微生物往往需要不同培养温度。培养不同微生物往往需要不同培养温度。细菌一般在细菌一般在3037培养培养12d，放线菌一般在放线菌一般在2528培养培养57d，霉菌一般在霉菌一般在2528的温度下培养的温度下培养34d。2）在菌落计数时，每隔在菌落计数时
9、，每隔24h统计一次菌落数目。统计一次菌落数目。选取选取菌落数目稳定菌落数目稳定时的记录作为结果，以防止因时的记录作为结果，以防止因培养时间不足培养时间不足而导致遗漏菌落的数目。而导致遗漏菌落的数目。3）菌落的特征包括）菌落的特征包括 形状、大小、隆起程度、颜色形状、大小、隆起程度、颜色 等方面。等方面。注意：注意：菌种中有些菌体增殖快，有些菌体增值慢，菌种中有些菌体增殖快，有些菌体增值慢，所以培养时间要充足，使得每个菌体都能所以培养时间要充足，使得每个菌体都能形成肉眼可观察到的菌落。形成肉眼可观察到的菌落。关注菌落的形态、大小、边缘、突起、颜色、质关注菌落的形态、大小、边缘、突起、颜色、质地
10、等等，都是区分细菌的重要手段。地等等，都是区分细菌的重要手段。关注菌落的关注菌落的形态、大小、边缘、突起、颜色、质形态、大小、边缘、突起、颜色、质地地等等，都是区分细菌的重要手段。等等，都是区分细菌的重要手段。关注菌落的形态、大小、边缘、突起、颜色、质关注菌落的形态、大小、边缘、突起、颜色、质地等等，都是区分细菌的重要手段。地等等，都是区分细菌的重要手段。4 4、鉴定：、鉴定：筛选后必鉴定筛选后必鉴定鉴别培养基：不影响微生鉴别培养基：不影响微生物的生存物的生存 酚红培养基：酚红培养基：鉴定分解尿素的细菌鉴定分解尿素的细菌。原理：脲酶催化尿素分原理：脲酶催化尿素分解成氨解成氨培养基碱性增强培养基
11、碱性增强 酚红变红酚红变红脲酶阳性脲酶阳性五、实验过程注意五、实验过程注意1）取土样用的小铁铲和盛土样的的信封在使用前）取土样用的小铁铲和盛土样的的信封在使用前都要都要灭菌灭菌。2）应在）应在火焰火焰旁称取土壤旁称取土壤 10 g。将称好的土样倒入。将称好的土样倒入盛有盛有90mL无菌水的无菌水的锥形瓶锥形瓶中，塞好棉塞。中，塞好棉塞。3）在稀释土壤溶液的过程中，每一步都要在）在稀释土壤溶液的过程中，每一步都要在火焰火焰旁进行。旁进行。4）实验时要对）实验时要对培养皿培养皿作好标记。作好标记。注明注明培养基类型、培养时间、稀释度、培养物培养基类型、培养时间、稀释度、培养物等。等。5）为了提高效
12、率，在操作时更加有条不紊，应当）为了提高效率，在操作时更加有条不紊，应当事先规划时间事先规划时间。六、结果分析与评价六、结果分析与评价1对分离的菌种作进一步的鉴定，还需对分离的菌种作进一步的鉴定，还需要借助要借助 生物化学生物化学 的方法。的方法。2在细菌分解尿素的化学反应中，细菌在细菌分解尿素的化学反应中，细菌合成的合成的 脲酶脲酶 将尿素分解成了将尿素分解成了 氨氨。氨会。氨会使培养基的碱性使培养基的碱性 增强增强，PH 升高升高。因此，。因此，我们可以通过检测培养基我们可以通过检测培养基 pH 变化来判变化来判断该化学反应是否发生。断该化学反应是否发生。3在以在以 尿素尿素 为唯一氮源的
13、培养基中加入为唯一氮源的培养基中加入 酚红酚红 指示剂。培养某种细菌后，如果指示剂。培养某种细菌后，如果PH升高，指示剂将变升高，指示剂将变 红红，说明该细菌，说明该细菌能够能够 分解尿素分解尿素。思考思考10测定饮水中大肠杆菌数量的方法是将一定体积的水测定饮水中大肠杆菌数量的方法是将一定体积的水用细菌过滤器过滤后，将滤膜放到用细菌过滤器过滤后，将滤膜放到 伊红美蓝伊红美蓝 培养基上培养，培养基上培养，大肠杆菌菌落呈现大肠杆菌菌落呈现 黑黑 色，通过记述得出水样中大肠杆菌的数色，通过记述得出水样中大肠杆菌的数量。你认为在该实验中至少应取量。你认为在该实验中至少应取 三三 个水样。个水样。及时训
14、练及时训练1、实验测定链霉素对、实验测定链霉素对3种种细菌的抗生素效应，用细菌的抗生素效应，用3种种细菌在事先准备好的琼脂块细菌在事先准备好的琼脂块平板上画平板上画3条等长的平行线条等长的平行线（3条线均与下图中的链霉素带接触），将平板置于条线均与下图中的链霉素带接触），将平板置于37条件下恒温培养条件下恒温培养3天，结果如图所示。从实验天，结果如图所示。从实验结果分析以下叙述，不正确的是结果分析以下叙述，不正确的是 （）A链霉素能阻止结核菌的生长链霉素能阻止结核菌的生长 B链霉素对结核菌比对霍乱菌更有效链霉素对结核菌比对霍乱菌更有效C链霉素对结核菌比对伤寒菌更有效链霉素对结核菌比对伤寒菌更有
15、效 D链霉素可以用于治疗伤寒病人链霉素可以用于治疗伤寒病人 D2、影响微生物生长的主要环境因素是、影响微生物生长的主要环境因素是A阳光、温度、水分阳光、温度、水分 B温度、水分、温度、水分、PH C水分、水分、PH、氧、氧 D温度、温度、PH、氧、氧3、可以鉴定出分解尿素的细菌的方法是：（、可以鉴定出分解尿素的细菌的方法是：（）A、以尿素为唯一氮源的培养基中加入酚红指示剂、以尿素为唯一氮源的培养基中加入酚红指示剂 B、以尿素为唯一氮源的培养基中加入二苯胺试剂、以尿素为唯一氮源的培养基中加入二苯胺试剂C、以尿素为唯一氮源的培养基中加入苏丹、以尿素为唯一氮源的培养基中加入苏丹试剂试剂 D、以尿素为唯一氮源的培养基中加入双缩脲试剂、以尿素为唯一氮源的培养基中加入双缩脲试剂4、可用于菌落数目统计的培养基是、可用于菌落数目统计的培养基是 （）A 固体培养基固体培养基 B液体培养基液体培养基 C半固体培养基半固体培养基 D天然培养基天然培养基DAA5 5、高压蒸气灭菌的原理是（、高压蒸气灭菌的原理是（）A A高压使细菌高压使细菌DNADNA变性变性 B B高温使细菌蛋白质凝固变性高温使细菌蛋白质凝固变性 C C高温烫死细菌高温烫死细菌 D D高温使细菌高温使细菌DNADNA变性变性BB
