1、第七节第七节 双水相萃取双水相萃取萃取新技术之萃取新技术之一、概述一、概述 双水相萃取（双水相萃取（Two-aqueous phase extraction）又称水溶液两相分配技术）又称水溶液两相分配技术（Partion of two aqueous phase system）是近年来出现的引人注目、极有）是近年来出现的引人注目、极有前途的新型分离技术。前途的新型分离技术。其特点是能够保留产物的活性，操作其特点是能够保留产物的活性，操作可连续化，能耗低，处理容量大。可连续化，能耗低，处理容量大。双 水 相 萃 取 现 象 最 早 是双 水 相 萃 取 现 象 最 早 是 1 8 9 6 年 由
2、年 由Beijerinck在琼脂与可溶性淀粉或明胶在琼脂与可溶性淀粉或明胶混合时发现的，被称为混合时发现的，被称为“聚合物的不相聚合物的不相溶性溶性”。2 0 世 纪世 纪 6 0 年 代 瑞 典年 代 瑞 典 L u n d 大 学 的大 学 的Albertsson P A及其同事们最先提出双水及其同事们最先提出双水相萃取技术并做了大量工作。相萃取技术并做了大量工作。1989年年Diamond等推导出生物分子在双等推导出生物分子在双水相体系中的分配模型，但尚有局限。水相体系中的分配模型，但尚有局限。由于成本方面的原因，双水相萃取技术由于成本方面的原因，双水相萃取技术上的优势被削弱，真正工业化
3、的例子很上的优势被削弱，真正工业化的例子很少。少。70年代中期西德的年代中期西德的Kula M R和和Kroner K H等人首先将双水相系统应用于从细胞等人首先将双水相系统应用于从细胞匀浆液中提取酶和蛋白质，大大改善了匀浆液中提取酶和蛋白质，大大改善了胞内酶的提取效果。胞内酶的提取效果。二、双水相体系的形成二、双水相体系的形成 典型的例子如在水溶液中的聚乙二醇典型的例子如在水溶液中的聚乙二醇（PEG）和葡聚糖（）和葡聚糖（DEX），各溶质均为），各溶质均为低浓度时，可得到单相匀质液体；当溶质低浓度时，可得到单相匀质液体；当溶质浓度增加时，溶液变得浑浊，静止形成双浓度增加时，溶液变得浑浊，静止
4、形成双液层：上层富集液层：上层富集PEG，下层富集葡聚糖。，下层富集葡聚糖。葡聚糖本质上是一种几乎不能形成偶葡聚糖本质上是一种几乎不能形成偶极现象的球形分子，而极现象的球形分子，而PEG是一种具有共是一种具有共享电子对的高密度直链聚合物。各个聚合享电子对的高密度直链聚合物。各个聚合物分子都倾向于在其周围有相同形状、大物分子都倾向于在其周围有相同形状、大小和极性的分子，同时，由于不同类型分小和极性的分子，同时，由于不同类型分子间的斥力大于同它们的亲水性有关的相子间的斥力大于同它们的亲水性有关的相互吸引力，因此聚合物发生分离，形成二互吸引力，因此聚合物发生分离，形成二个不同的相，这就是所谓的个不同
5、的相，这就是所谓的“聚合物不相聚合物不相溶性溶性”。三、双水相系统的重要特征三、双水相系统的重要特征两相的黏度：萃取相在两相的黏度：萃取相在210mPa.s范围范围内，而发酵液匀浆相在内，而发酵液匀浆相在10010000mPa.s 范围内。范围内。双水相系统呈现出低的界面张力。双水相系统呈现出低的界面张力。四、双水相体系的类型四、双水相体系的类型聚丙二醇聚丙二醇聚乙二醇、聚乙烯醇、葡聚糖、羟丙基葡聚糖聚乙二醇、聚乙烯醇、葡聚糖、羟丙基葡聚糖聚乙二醇聚乙二醇聚乙烯醇、聚乙烯吡咯烷酮、葡聚糖、聚蔗糖聚乙烯醇、聚乙烯吡咯烷酮、葡聚糖、聚蔗糖硫酸葡聚糖钠盐硫酸葡聚糖钠盐羧基甲基葡聚糖钠盐羧基甲基葡聚糖
6、钠盐聚丙烯乙二醇聚丙烯乙二醇甲基纤维素甲基纤维素羧甲基葡聚糖钠盐羧甲基葡聚糖钠盐羧甲基纤维素钠盐羧甲基纤维素钠盐聚乙二醇聚乙二醇磷酸钾、硫酸铵、硫酸钠、硫酸镁、酒石酸钾钠磷酸钾、硫酸铵、硫酸钠、硫酸镁、酒石酸钾钠表表1 几种典型双水相体系几种典型双水相体系五、双水相萃取的理论基础五、双水相萃取的理论基础相平衡关系相平衡关系图图1 PEG/DEX体系相图体系相图生物大分子在两相中的分配仍服从分配定生物大分子在两相中的分配仍服从分配定律。律。物质在两相中的分配物质在两相中的分配btcck六、双水相系统中物质分配的影响因素六、双水相系统中物质分配的影响因素系统聚合物组成系统聚合物组成系统物化性质系统
7、物化性质盐及缓冲液盐及缓冲液温度温度 当两种不同聚合物的溶液混合时，可能存当两种不同聚合物的溶液混合时，可能存在三种情况：在三种情况：完全混溶性（匀相溶液）；完全混溶性（匀相溶液）；物理的不相溶性（相分离）；物理的不相溶性（相分离）；复杂的凝聚（相分离）。复杂的凝聚（相分离）。1、双水相中聚合物组成的影响、双水相中聚合物组成的影响eg.离子和非离子型聚合物都可使用在双水离子和非离子型聚合物都可使用在双水相系统的构成上，但当这两种聚合物是离相系统的构成上，但当这两种聚合物是离子化合物并带有相反电荷时，它们相互吸子化合物并带有相反电荷时，它们相互吸引并发生复杂的凝聚。引并发生复杂的凝聚。图图2 2
8、00C聚乙二醇聚乙二醇4000/葡聚糖系统双节点曲线，葡聚糖系统双节点曲线，比较三种不同类型的葡聚糖比较三种不同类型的葡聚糖 虽然葡聚糖虽然葡聚糖T500和水解过的葡聚糖和水解过的葡聚糖相对分子量在同一相对分子量在同一数量级，但二者的数量级，但二者的双节线离得远，这双节线离得远，这种差别是由于聚合种差别是由于聚合度分布性效应造成度分布性效应造成的。的。蛋白质蛋白质相对分子相对分子量量葡聚糖组成葡聚糖组成葡聚糖葡聚糖40葡聚糖葡聚糖70葡聚糖葡聚糖220葡聚糖葡聚糖500葡聚糖葡聚糖2000细胞色素细胞色素123840.18 0.140.150.170.21牛血清蛋白牛血清蛋白690000.18
9、0.230.310.340.41乳酸脱氢酶乳酸脱氢酶1400000.060.050.090.160.10过氧化氢酶过氧化氢酶2500000.110.230.400.791.15磷酸果糖磷酸果糖 激酶激酶8000000.010.010.010.020.03表表2 葡聚糖分子对不同相对分子量蛋白质分配系数的影响葡聚糖分子对不同相对分子量蛋白质分配系数的影响蛋白质蛋白质相对分相对分子量子量体系的组成体系的组成D-500（9%）/P-4000(7.1%)D-500（8%）/P-6000(6%)D-500（8%）/P-20000(6%)D-500（8%）/P-40000(6%)细胞色素细胞色素12384
10、0.170.170.130.12牛血清蛋白牛血清蛋白690000.520.340.140.11乳酸脱氢酶乳酸脱氢酶1400000.130.080.050.03过氧化氢酶过氧化氢酶2500000.820.380.160.10表表3 PEG分子对不同相对分子量蛋白质分配系数的影响分子对不同相对分子量蛋白质分配系数的影响 由表由表2、表、表3可见，蛋白质的分配系数随着可见，蛋白质的分配系数随着葡聚糖相对分子量的增加而增加，随着葡聚糖相对分子量的增加而增加，随着PEG相对分子量的增加而降低。相对分子量的增加而降低。葡聚糖也可葡聚糖也可由其他多糖代替，由其他多糖代替，可得到类似的结可得到类似的结果，如右
11、图所示。果，如右图所示。图图4 200C聚乙二醇聚乙二醇/羟丙基淀粉羟丙基淀粉和聚乙二醇和聚乙二醇/葡聚糖系统的相图葡聚糖系统的相图2、双水相系统物理化学性质的影响、双水相系统物理化学性质的影响 双水相系统的性质主要取决于下列物理双水相系统的性质主要取决于下列物理参数：密度（参数：密度（）和两相间密度差、黏度）和两相间密度差、黏度（）和两相间黏度差、表面张力（）和两相间黏度差、表面张力（）。）。PEG/质质量分数量分数%Dextran/质量分数质量分数%界面宽度界面宽度/质量分数质量分数%VT/VB/(Kg/m3)/(mPa.s)g/(mPa.s)/(mN/m)6.05.86.21.5184.
12、1430.3*10-26.56.110.51.4323.61000.12*10-28.07.619.81.7644.33.32.0*10-29.08.524.81.9794.43644.1*10-2表表4 聚乙二醇聚乙二醇4000/葡聚糖葡聚糖PL500系统的物理化学常数系统的物理化学常数eg.PEG-(NH4)2SO4双水相系统萃取糖化酶双水相系统萃取糖化酶 (NH4)2SO4浓度固定不变时，增加浓度固定不变时，增加PEG400的浓度有利于酶在上相的分配，的浓度有利于酶在上相的分配，当当PEG400浓度在浓度在2527%时，分配系数高时，分配系数高达达47.3，浓度过高则不利于酶的分配。，浓
13、度过高则不利于酶的分配。PEG400浓度固定为浓度固定为26%时，增加时，增加(NH4)2SO4浓度，糖化酶的分配系数也增大。浓度，糖化酶的分配系数也增大。(NH(NH4 4)2 2SOSO4 4的最适浓度为的最适浓度为16%16%。酵母菌存在下酵母菌存在下肺炎克雷氏菌存在下肺炎克雷氏菌存在下图图5 细胞物质浓度对酶分配的影响细胞物质浓度对酶分配的影响3、盐和缓冲液的影响、盐和缓冲液的影响 水溶液中存在的离子会影响溶质在两水溶液中存在的离子会影响溶质在两相间的分配。因为阴阳离子的不均匀分配相间的分配。因为阴阳离子的不均匀分配会产生相界面电位，影响蛋白质、核酸等会产生相界面电位，影响蛋白质、核酸
14、等荷电大分子的分配。荷电大分子的分配。通常增加盐浓度可提通常增加盐浓度可提高酶的分配系数。高酶的分配系数。图图6 聚乙二醇聚乙二醇4000/硫酸铵系统中，支链淀硫酸铵系统中，支链淀粉酶的分配系数与硫酸铵总浓度的关系粉酶的分配系数与硫酸铵总浓度的关系 eg.在在PEG-DEX系统中加入系统中加入NaClO4或或KI，能增加上相对带正电物质的亲和效，能增加上相对带正电物质的亲和效应，并迫使带负电物质进入下相；若加应，并迫使带负电物质进入下相；若加入入Li3PO4，则与上述效应刚好相反。，则与上述效应刚好相反。因此，只要设法改变界面电位，就因此，只要设法改变界面电位，就能控制蛋白质等荷电大分子转入某
15、一相。能控制蛋白质等荷电大分子转入某一相。图图7 聚乙二醇葡聚糖系统中支链淀粉酶的分配与聚乙二醇葡聚糖系统中支链淀粉酶的分配与pH值的关系值的关系4、温度的影响、温度的影响 温度的变化温度的变化虽然影响液相物理虽然影响液相物理性质的变化，从而性质的变化，从而影响溶质在两相间影响溶质在两相间的分配，但总的来的分配，但总的来说，影响不敏感。说，影响不敏感。图图8 不同温度下葡聚糖不同温度下葡聚糖500/聚乙二醇聚乙二醇6000/水系统相图水系统相图七、双水相系统的应用七、双水相系统的应用食品工业食品工业生物行业生物行业表表5 双水相萃取在生物分离中的应用双水相萃取在生物分离中的应用酶的提取和纯化酶
16、的提取和纯化 菌体菌体酶酶双水相组双水相组成成细胞浓度细胞浓度/%分配系分配系数数收率收率/%Candida Boidinii过氧化氢过氧化氢酶酶PEG-粗粗Dex202.9581Saccharomgces Cerevisine已糖激酶已糖激酶PEG/盐盐308.292Escherichia Coli天冬氨酸天冬氨酸酶酶PEG1550/磷酸钾盐磷酸钾盐255.796表表6 从破碎的细胞中萃取分离酶从破碎的细胞中萃取分离酶7细胞组织的分离细胞组织的分离 用三甲胺用三甲胺PEG/Dextran 体系可分离含胆体系可分离含胆碱受体的细胞；碱受体的细胞；病毒的纯化：病毒的纯化：用用PEG/NaDS 体
17、系可对脊髓病毒和腺病体系可对脊髓病毒和腺病毒进行纯化毒进行纯化,回收率可达回收率可达90%生长激素的纯化：生长激素的纯化：用用PEG/盐体系可提盐体系可提纯人的生长激素纯人的生长激素,回收率回收率Y=60%；干扰素的分离：干扰素的分离：用用PEG-磷酸酯磷酸酯/盐体盐体系分离系分离-干扰素干扰素,Y=97%;从重组大从重组大肠杆菌匀浆中提取肠杆菌匀浆中提取-干扰素干扰素,Y=99.15%,纯度提高纯度提高25 倍倍生物小分子物质的分离：生物小分子物质的分离：双水相体系萃取分离技术对青霉素双水相体系萃取分离技术对青霉素G钠盐等钠盐等生物小分子物质的分离也可以取得理想效生物小分子物质的分离也可以取
18、得理想效果；果；药物的分离和提纯：药物的分离和提纯：如基因工程药物、抗菌素、动、植物药物如基因工程药物、抗菌素、动、植物药物的提取，也可以利用该技术开发我国传统的提取，也可以利用该技术开发我国传统的中草药；的中草药；在分析检测中的应用：在分析检测中的应用：液液-液分配层析液分配层析(LL PC)将一种聚合物连接在固体颗粒将一种聚合物连接在固体颗粒(支持物支持物)上，上，另一种聚合物的溶液作为流动相，这种柱另一种聚合物的溶液作为流动相，这种柱层析技术可分离蛋白质、核酸以及细胞混层析技术可分离蛋白质、核酸以及细胞混合物。合物。食品工业中用来从酸水解产物中提取风味食品工业中用来从酸水解产物中提取风味
19、物质：物质：二肽、氨基酸、核苷酸等二肽、氨基酸、核苷酸等八、双水相萃取的工艺流程双水相萃取的工艺流程目的产物的萃取目的产物的萃取PEG的循环的循环无机盐的循环无机盐的循环连续错流萃取回收酶的流程图连续错流萃取回收酶的流程图九、成相聚合物的回收九、成相聚合物的回收u膜处理膜处理u沉淀沉淀u离子交换和吸附离子交换和吸附u电泳或亲和分配和双水相萃取相结合电泳或亲和分配和双水相萃取相结合蛋白质分配在盐相：盐可用错流操作方式蛋白质分配在盐相：盐可用错流操作方式下，用超滤或渗析等膜过滤回收；下，用超滤或渗析等膜过滤回收；蛋白质积聚在蛋白质积聚在PEG中：加入盐使蛋白质重中：加入盐使蛋白质重新分配到盐相中。
20、新分配到盐相中。PEG的分离同样可用膜的分离同样可用膜分离来实现分离来实现。十、双水相萃取技术的进展十、双水相萃取技术的进展1、廉价双水相体系的开发、廉价双水相体系的开发体系体系优点优点缺点缺点PEG/DEX盐浓度低，活性盐浓度低，活性损失小损失小价格贵，黏度大，分价格贵，黏度大，分相困难相困难PEG/盐盐成本低，黏度小成本低，黏度小盐浓度高，活性损失盐浓度高，活性损失大，界面吸附多大，界面吸附多表表6 两种双水相体系的比较两种双水相体系的比较 可见，高聚物可见，高聚物-高聚物体系对活性物质高聚物体系对活性物质变性作用小，界面吸附少，但价格高。因变性作用小，界面吸附少，但价格高。因而寻找廉价的
21、高聚物而寻找廉价的高聚物-高聚物体系是双水相高聚物体系是双水相萃取技术发展的一个重要方向。萃取技术发展的一个重要方向。目前比较成功的是用变性淀粉目前比较成功的是用变性淀粉PPT代替昂贵的代替昂贵的DEX。PPT-PEG体系已被用体系已被用于从发酵液中分离过氧化氢酶、于从发酵液中分离过氧化氢酶、-半乳半乳糖苷酶等。糖苷酶等。该体系具有很多优点：该体系具有很多优点：比比PEG-盐体系稳定，与盐体系稳定，与PEG-DEX体系体系相图相似；相图相似；蛋白质溶解度大；蛋白质溶解度大；黏度小；黏度小；价格便宜。价格便宜。2、双水相萃取技术同其他分离技术结合、双水相萃取技术同其他分离技术结合 .双水相体系同
22、生物转化相结合双水相体系同生物转化相结合图图10 利用双水相体系将木质纤维素转化为乙醇流程利用双水相体系将木质纤维素转化为乙醇流程利用葡萄糖和淀粉生产乙醇；利用葡萄糖和淀粉生产乙醇；利用葡萄糖生产丙酮丁醇；利用葡萄糖生产丙酮丁醇；利用淀粉和纤维素水解生产葡萄糖；利用淀粉和纤维素水解生产葡萄糖；水解酪蛋白；水解酪蛋白；发酵生产乳酸；发酵生产乳酸；将青霉素将青霉素G转化为氨基青霉烷酸等转化为氨基青霉烷酸等.双水相萃取技术同膜分离技术相合双水相萃取技术同膜分离技术相合萃取物萃取物内侧流内侧流体体外侧外侧流体流体分配系分配系数数内侧流内侧流速速/cm.s外侧流外侧流速速/cm.s传质系数传质系数/cm
23、/s细胞色素细胞色素C磷酸盐磷酸盐PEG0.1816.36.65.5*10-6肌红蛋白肌红蛋白 磷酸盐磷酸盐PEG0.0094.05.07.5*10-7尿激酶尿激酶磷酸盐磷酸盐PEG0.6516.35.02.0*10-4表表7 双水相萃取同膜分离结合的例子双水相萃取同膜分离结合的例子 .双水相萃取同亲和层析相结合双水相萃取同亲和层析相结合 在在PEG或或DEX上接上一定的亲和配基，上接上一定的亲和配基，这样不但使体系具有双水相处理量大的特这样不但使体系具有双水相处理量大的特点，而且具有亲和层析专一性高的特点。点，而且具有亲和层析专一性高的特点。亲亲和配基和配基亲和双水相亲和双水相亲和层析亲和层
24、析收率收率%处理量处理量u/ml染料浓染料浓度度umol.m收率收率%处理量处理量u/ml染料浓染料浓度度umol.mCibacron-Blue3GA90120202460202Procion-Rec HE-3B95100121585354表表10 亲和层析和亲和双水相比较亲和层析和亲和双水相比较 近年来亲和双水相发展极为迅速，仅近年来亲和双水相发展极为迅速，仅在在PEG上可接的配基就有十多种，分离产上可接的配基就有十多种，分离产物达到几十种，分配系数成百上千倍的提物达到几十种，分配系数成百上千倍的提高。高。思考:1 1、双水相体系是如何形成的？、双水相体系是如何形成的？2 2、双水相萃取的基本原理是什么？、双水相萃取的基本原理是什么？3 3、影响双水相萃取得率的因素有哪些？、影响双水相萃取得率的因素有哪些？4 4、试分析亲和双水相的分离机制。、试分析亲和双水相的分离机制。
