1、影响目的基因在大肠杆菌中影响目的基因在大肠杆菌中表达的因素表达的因素 外源基因在宿主中的表达受许多因素外源基因在宿主中的表达受许多因素影响的，所以在建立表达体系时要综影响的，所以在建立表达体系时要综合考虑各种因素的作用，建立一个合合考虑各种因素的作用，建立一个合适的表达体系，从而使外源基因得到适的表达体系，从而使外源基因得到最大的表达量，获得最多的表达产物。最大的表达量，获得最多的表达产物。2020/11/31*外源基因的拷贝数外源基因的拷贝数 外源基因是克隆到载体上的，所以外源基因是克隆到载体上的，所以载体在宿主中的拷贝数就直接与外载体在宿主中的拷贝数就直接与外源基因的表达相关，应将外源基因
2、源基因的表达相关，应将外源基因克隆到高拷贝的质粒载体上，这对克隆到高拷贝的质粒载体上，这对于提高外源基因的总体表达水平非于提高外源基因的总体表达水平非常有利。常有利。2020/11/32*外源基因的表达效率外源基因的表达效率n启动子的强弱启动子的强弱n核糖体接合位点的有效性核糖体接合位点的有效性nSD序列和起始密码序列和起始密码ATG的间距的间距n密码子组成密码子组成2020/11/33*表达产物的稳定性表达产物的稳定性 n利用大肠杆菌的信号肽或某些真核多肽中利用大肠杆菌的信号肽或某些真核多肽中自身的信号肽，把真核基因产物运输到胞自身的信号肽，把真核基因产物运输到胞浆周质的空隙中，而使外源蛋白
3、不易被酶浆周质的空隙中，而使外源蛋白不易被酶降解；降解；n组建融合基因，产生融合蛋白；组建融合基因，产生融合蛋白；n采用位点特异性突变的方法，改变真核蛋采用位点特异性突变的方法，改变真核蛋白二硫键的位置，从而增加蛋白质的稳定白二硫键的位置，从而增加蛋白质的稳定性；性；n选用蛋白酶缺陷型大肠杆菌为宿主细胞。选用蛋白酶缺陷型大肠杆菌为宿主细胞。2020/11/34*细胞的代谢负荷细胞的代谢负荷 n外源基因的表达产物属于异己物质，并可能对宿主细外源基因的表达产物属于异己物质，并可能对宿主细胞有毒性。调节表达物质的积累与细胞的生长和代谢胞有毒性。调节表达物质的积累与细胞的生长和代谢之间的平衡有利于外源
4、基因的高效表达。之间的平衡有利于外源基因的高效表达。n另外通过将细胞的生长和外源基因的表达分成两另外通过将细胞的生长和外源基因的表达分成两个阶段，或将宿主细胞的生长与重组质粒的复制个阶段，或将宿主细胞的生长与重组质粒的复制分开两种手段也可以减轻细胞代谢的负荷。分开两种手段也可以减轻细胞代谢的负荷。n形成不溶性的包含体可以降低表达产物对宿主细形成不溶性的包含体可以降低表达产物对宿主细胞的毒害作用。胞的毒害作用。2020/11/35*工程菌的培养条件工程菌的培养条件n除宿主、载体和克隆基因三者之间的除宿主、载体和克隆基因三者之间的关系影响外源基因的高水平表达外，关系影响外源基因的高水平表达外，培养
5、条件亦是非常值得研究的因素。培养条件亦是非常值得研究的因素。n优化培养条件使外源基因大量表达。优化培养条件使外源基因大量表达。2020/11/36*真核基因在大肠杆菌中的表达形式真核基因在大肠杆菌中的表达形式 三种表达形式：三种表达形式：n 融合蛋白融合蛋白n 非融合蛋白非融合蛋白n 分泌型。分泌型。2020/11/37*融合蛋白形式表达药物基因融合蛋白形式表达药物基因n融合蛋白的氨基端是原核序列，羧基端是融合蛋白的氨基端是原核序列，羧基端是真核序列，这样的蛋白质是由一条短的原真核序列，这样的蛋白质是由一条短的原核多肽和真核蛋白结合在一起的。核多肽和真核蛋白结合在一起的。n优点：操作简便，表达
6、蛋白在菌体内稳定，优点：操作简便，表达蛋白在菌体内稳定，易实现高效表达。易实现高效表达。n缺点：只能作抗原用。原核多肽序列可能缺点：只能作抗原用。原核多肽序列可能会影响真核蛋白的免疫原性。可再切割成会影响真核蛋白的免疫原性。可再切割成两个多肽链。两个多肽链。2020/11/38*非融合蛋白形式表达药物基因非融合蛋白形式表达药物基因n非融合蛋白指在大肠杆菌中表达的非融合蛋白指在大肠杆菌中表达的蛋白质以真核蛋白的蛋白质以真核蛋白的mRNA的的AUG为起始，在其氨基端不含细菌多肽为起始，在其氨基端不含细菌多肽序列。序列。n优点：保持原有蛋白活性。优点：保持原有蛋白活性。n缺点：易被蛋白酶破坏。缺点：
7、易被蛋白酶破坏。2020/11/39*分泌型表达药物基因分泌型表达药物基因n将外源基因接到信号肽之后，使之在胞质将外源基因接到信号肽之后，使之在胞质内有效地转录和翻译，当表达的蛋白质进内有效地转录和翻译，当表达的蛋白质进入细胞外膜和细胞内膜之间的周质后时，入细胞外膜和细胞内膜之间的周质后时，被信号肽酶识别切割，从而释放出有生物被信号肽酶识别切割，从而释放出有生物活性的外源基因表达产物。活性的外源基因表达产物。n优点：在周质中稳定，有活性，不优点：在周质中稳定，有活性，不 含蛋氨含蛋氨酸残基。酸残基。n缺点：产量不高，缺点：产量不高，信号肽不被切割。信号肽不被切割。2020/11/310*酵母中
8、的基因表达酵母中的基因表达载体：载体：n酵母载体是可以携带外源基因在在酵母细酵母载体是可以携带外源基因在在酵母细胞内保存和复制，并随酵母分裂传递到子胞内保存和复制，并随酵母分裂传递到子代细胞的代细胞的DNA DNA 或或RNARNA单位。单位。n从大肠杆菌中制备质粒要比从酵母中容易从大肠杆菌中制备质粒要比从酵母中容易得多，因此酵母质粒的加工和制备大部分得多，因此酵母质粒的加工和制备大部分是通过大肠杆菌进行的，只有在最后阶段是通过大肠杆菌进行的，只有在最后阶段在转入酵母中。在转入酵母中。2020/11/311*载体的复制系列载体的复制系列 分四类：分四类：nYep类（类（yeast episom
9、al plasmid，酵母附加体质粒），酵母附加体质粒）nYRp类（类（yeast replication plasmid，酵母复制型质，酵母复制型质粒）粒）nYCp类（类（yeast centromeric plasmid，酵母着丝粒质粒），酵母着丝粒质粒）nYIp类（类（yeast integrative plasmid，酵母整合型质粒），酵母整合型质粒）2020/11/312*表达载体表达载体n普通表达载体普通表达载体：只能方便地引入外源基因并进行：只能方便地引入外源基因并进行表达，对表达产物的组成，特别是对其氮末端氨基表达，对表达产物的组成，特别是对其氮末端氨基酸是否有增减并无严格要求
10、。酸是否有增减并无严格要求。n精确表达载体精确表达载体：要求在启动子或前导肽编码序列：要求在启动子或前导肽编码序列的适当部位有内切酶位点，以利于接入外源基因，并的适当部位有内切酶位点，以利于接入外源基因，并使它在表达和加工后氮末端氨基酸序列与天然产物相使它在表达和加工后氮末端氨基酸序列与天然产物相同，既无多余的氨基酸，也无缺失的氨基酸。同，既无多余的氨基酸，也无缺失的氨基酸。2020/11/313*影响目的基因在酵母菌中表达的因素影响目的基因在酵母菌中表达的因素n外源基因的拷贝数外源基因的拷贝数 n外源基因的表达效率外源基因的表达效率 n外源蛋白的糖基化外源蛋白的糖基化n宿主菌株的影响宿主菌株
11、的影响 2020/11/314*外源基因的拷贝数外源基因的拷贝数 拷贝数要适当，高拷贝数的质粒拷贝数要适当，高拷贝数的质粒载体可使外源基因高效表达，但载体可使外源基因高效表达，但会引起细胞生长量的降低，单拷会引起细胞生长量的降低，单拷贝的质粒载体对细胞的最大生长贝的质粒载体对细胞的最大生长没有影响，能达到较高效的表达。没有影响，能达到较高效的表达。2020/11/315*外源基因的表达效率外源基因的表达效率 n要使外源基因在酵母中表达必须将外源基因克隆到酵母要使外源基因在酵母中表达必须将外源基因克隆到酵母军表达载体的军表达载体的启动子启动子和和终止子终止子之间，构成表达框架。之间，构成表达框架
12、。n分泌信号分泌信号包括信号肽部分以及前导肽部分的编码序包括信号肽部分以及前导肽部分的编码序列，它帮助后面的表达产物分泌出酵母细胞，并在列，它帮助后面的表达产物分泌出酵母细胞，并在适当的部位由胞内蛋白酶加工切断表达产物与前导适当的部位由胞内蛋白酶加工切断表达产物与前导肽之间的肽键，产生正确的表达产物。肽之间的肽键，产生正确的表达产物。n终止序列终止序列保证了转录产物在适当的部位终止和加上多保证了转录产物在适当的部位终止和加上多聚腺苷酸尾巴，这样形成的聚腺苷酸尾巴，这样形成的mRNA可能比较稳定并被可能比较稳定并被有效地翻译。有效地翻译。2020/11/316*外源蛋白的糖基化外源蛋白的糖基化n
13、外源蛋白在酵母细胞中可发生外源蛋白在酵母细胞中可发生N-糖糖苷键和苷键和O-糖苷键连接的两种不同的糖苷键连接的两种不同的糖基化。糖基化。n外源蛋白经糖基化后可以以有效的外源蛋白经糖基化后可以以有效的活性型分泌到培养基中。活性型分泌到培养基中。n某些蛋白质糖基化后更加稳定，便某些蛋白质糖基化后更加稳定，便于分离精制。于分离精制。2020/11/317*宿主菌株的影响宿主菌株的影响 n 菌体生长力强菌体生长力强n 菌体内源蛋白酶要较弱菌体内源蛋白酶要较弱n 菌体性能稳定菌体性能稳定n 分泌能力强分泌能力强2020/11/318*动物细胞中的基因表达动物细胞中的基因表达 优点优点：n哺乳动物细胞外源
14、基因表达产物可由重组哺乳动物细胞外源基因表达产物可由重组转化的细胞分泌到培养转化的细胞分泌到培养 液中，使产物易液中，使产物易纯化。纯化。n基因产物糖基化接近天然产物。基因产物糖基化接近天然产物。2020/11/319*动物细胞中的基因表达动物细胞中的基因表达缺点：缺点：n细胞生长慢，生产率低细胞生长慢，生产率低n条件刻苛，费用高条件刻苛，费用高n培养液浓度较小培养液浓度较小n表达的外源细胞均为传代细胞表达的外源细胞均为传代细胞n表达产物是否致癌尚有疑问表达产物是否致癌尚有疑问2020/11/320*主要基因工程表达体系比较主要基因工程表达体系比较表达体系表达体系 产产 物物 产生部位产生部位
15、 培养方式培养方式 提提 纯纯 产物活性产物活性 潜在危险性潜在危险性大肠杆菌大肠杆菌 多肽蛋白质多肽蛋白质 菌体内菌体内 容易容易 一般一般 对原核好对原核好 不大不大 融合蛋白质融合蛋白质 部分高产部分高产 对真核差对真核差 酵酵 母母 多肽蛋白质多肽蛋白质 菌体内菌体内 容易容易 菌体内菌体内 真核的接近真核的接近 不大不大 糖基化蛋白糖基化蛋白 外分泌外分泌 可高产可高产 稍复杂稍复杂 天然产物天然产物 哺乳动物哺乳动物 完完 整整 外分泌外分泌 较难成本高较难成本高 简单简单 可达天然可达天然 需注意需注意 糖基化蛋白糖基化蛋白 可高产可高产 产物产物 致癌致癌2020/11/321
16、*五、基因工程菌的稳定性五、基因工程菌的稳定性n基因工程菌在传代过程中常出现质粒不稳基因工程菌在传代过程中常出现质粒不稳定的现象。定的现象。n分裂不稳定分裂不稳定：是指工程菌分裂时出现一定：是指工程菌分裂时出现一定比例不含质粒子代菌的现象；比例不含质粒子代菌的现象；n结构不稳定结构不稳定：是指外源基因从质粒上丢失：是指外源基因从质粒上丢失或碱基重排、缺失所致工程菌性能的改变。或碱基重排、缺失所致工程菌性能的改变。2020/11/322*质粒不稳定产生的原因质粒不稳定产生的原因 常见的是分裂不稳定，与两个因素有关：常见的是分裂不稳定，与两个因素有关：n含质粒菌产生不含质粒子代菌的频含质粒菌产生不
17、含质粒子代菌的频率；率；n这两种菌的比生长速率差异的大小。这两种菌的比生长速率差异的大小。2020/11/323*质粒不稳定产生的原因质粒不稳定产生的原因n 对同一工程菌控制不同的比生长数率可对同一工程菌控制不同的比生长数率可改变质粒的拷贝数：改变质粒的拷贝数：n 低拷贝质粒工程菌产生不含质粒子代菌低拷贝质粒工程菌产生不含质粒子代菌频率高如增加工程菌质粒拷贝数可提高频率高如增加工程菌质粒拷贝数可提高稳定性；稳定性；n 高拷贝质粒工程菌产生不含质粒子代菌高拷贝质粒工程菌产生不含质粒子代菌频率低但对稳定性不利。频率低但对稳定性不利。2020/11/324*质粒稳定性的分析方法质粒稳定性的分析方法
18、样品样品不含抗性标记抗不含抗性标记抗生素平板培养基生素平板培养基稀释稀释培养培养1012h随机挑选随机挑选100个菌落个菌落含抗性标记抗含抗性标记抗生素平板培养基生素平板培养基接种接种统计长出的统计长出的菌落数菌落数培养培养1012h计算比值计算比值重复三次重复三次2020/11/325*提高质粒稳定性的方法提高质粒稳定性的方法 为了提高质粒稳定性，工程菌培养采用两为了提高质粒稳定性，工程菌培养采用两阶段培养法：阶段培养法：n 先使菌体生长至一定密度先使菌体生长至一定密度n 再诱导外源基因的表达再诱导外源基因的表达2020/11/326*提高质粒稳定性的方法提高质粒稳定性的方法n由于第一阶段外
19、源基因未表达，减小由于第一阶段外源基因未表达，减小了重组菌与质粒丢失菌的生长速率的了重组菌与质粒丢失菌的生长速率的差别，增加了质粒稳定性。差别，增加了质粒稳定性。n在培养基中加入抗菌素抑制质粒丢失菌在培养基中加入抗菌素抑制质粒丢失菌的生长，提高质粒稳定性。的生长，提高质粒稳定性。n调控环境参数如温度、调控环境参数如温度、pH、培养基组、培养基组分和溶解氧浓度。分和溶解氧浓度。2020/11/327*提高质粒稳定性的方法提高质粒稳定性的方法n有些含质粒菌对发酵环境的改变比不有些含质粒菌对发酵环境的改变比不含质粒菌反应慢，间歇改变培养条件含质粒菌反应慢，间歇改变培养条件以改变两种菌比生长速率，可改
20、善质以改变两种菌比生长速率，可改善质粒稳定性。粒稳定性。n通过间歇供氧和改变稀释数率，都通过间歇供氧和改变稀释数率，都可以提高质粒稳定性。可以提高质粒稳定性。2020/11/328*六、基因工程菌生长代谢的特点六、基因工程菌生长代谢的特点n菌体的生长通常用比生长速率来表示。菌体的生长通常用比生长速率来表示。n工程菌培养可通过选用不同的碳源控制工程菌培养可通过选用不同的碳源控制补料和稀释速率等方法来控制菌体的生补料和稀释速率等方法来控制菌体的生长。长。n控制菌体的生长对提高质粒的稳定性、控制菌体的生长对提高质粒的稳定性、减少代谢副产物积累、提高外源蛋白产减少代谢副产物积累、提高外源蛋白产率有重要
21、意义。率有重要意义。2020/11/329*基因工程菌生长代谢的特点基因工程菌生长代谢的特点n大肠杆菌的蛋白大肠杆菌的蛋白/菌体量的比值是基本恒菌体量的比值是基本恒定的，因而菌体的生长速度反映了蛋白定的，因而菌体的生长速度反映了蛋白质的合成速度。质的合成速度。n培养条件的改变，都会改变菌体的能培养条件的改变，都会改变菌体的能量代谢和小分子前体的供应，影响生量代谢和小分子前体的供应，影响生物大分子的和成和菌体的生长。物大分子的和成和菌体的生长。2020/11/330*菌体的生长与能量的关系菌体的生长与能量的关系n碳源物质是组成培养基的主要成分。碳源物质是组成培养基的主要成分。n碳源物质为细胞提供
22、能量，当菌体生长所碳源物质为细胞提供能量，当菌体生长所需能量大于菌体有氧代谢提供的能量时，需能量大于菌体有氧代谢提供的能量时，菌体会产生乙酸，导致培养基的菌体会产生乙酸，导致培养基的pH值下降，值下降，从而影响菌体的生长。从而影响菌体的生长。n适当提高适当提高pH，可减少乙酸的抑制作用。，可减少乙酸的抑制作用。2020/11/331*菌体的生长与能量的关系菌体的生长与能量的关系n分批培养中选择不同的碳源，连续分批培养中选择不同的碳源，连续培养中控制稀释速率等都能一定范培养中控制稀释速率等都能一定范围内控制菌体的生长，从而控制乙围内控制菌体的生长，从而控制乙酸的产生，减少它的抑制作用。酸的产生，
23、减少它的抑制作用。n加入蛋氨酸和酵母提取物都能减少乙加入蛋氨酸和酵母提取物都能减少乙酸的产生。酸的产生。2020/11/332*菌体的生长与能量的关系菌体的生长与能量的关系n大肠杆菌中克隆携带氧能力的大肠杆菌中克隆携带氧能力的VHB蛋白的基因可提高菌体生长速率。蛋白的基因可提高菌体生长速率。n采用磷酸乙酰化酶缺陷株作为宿主采用磷酸乙酰化酶缺陷株作为宿主细胞，阻止乙酸产生，可提高产量。细胞，阻止乙酸产生，可提高产量。2020/11/333*菌体生长与前体供应的关系菌体生长与前体供应的关系n在基础培养基中加入氨基酸能使菌体比生在基础培养基中加入氨基酸能使菌体比生长速率提高，使蛋白质合成增加。长速率
24、提高，使蛋白质合成增加。n由于菌体中小分子前体量和催化结构是有由于菌体中小分子前体量和催化结构是有限的，因而生物大分子的合成处于亚饱和限的，因而生物大分子的合成处于亚饱和状态，基因工程菌质粒的表达需与宿主细状态，基因工程菌质粒的表达需与宿主细胞竞争共同的前体和催化结构，限制了菌胞竞争共同的前体和催化结构，限制了菌体的比生长速率体的比生长速率2020/11/334*质粒存在对菌体代谢的影响质粒存在对菌体代谢的影响n同样培养基当中，工程菌的比生长速率同样培养基当中，工程菌的比生长速率低于其宿主细胞。低于其宿主细胞。n中等拷贝质粒（中等拷贝质粒（5656拷贝）的工程菌中与前拷贝）的工程菌中与前体合成
25、有关的酶增加，这些酶的基因大多体合成有关的酶增加，这些酶的基因大多受终产物的反馈调节。受终产物的反馈调节。n高拷贝质粒的工程菌（高拷贝质粒的工程菌（240240拷贝）中，生拷贝）中，生长速率和菌体总蛋白合成均减少。长速率和菌体总蛋白合成均减少。2020/11/335*七、基因工程菌发酵七、基因工程菌发酵 基因工程菌的培养过程包括基因工程菌的培养过程包括:n通过摇瓶操作基因工程菌生长的基础条通过摇瓶操作基因工程菌生长的基础条件件,如温度、如温度、pHpH、培养基各种组分、碳、培养基各种组分、碳氧比，分析表达产物的合成、积累对受氧比，分析表达产物的合成、积累对受体细胞的影响体细胞的影响;n通过培养
26、罐操作确定培养参数和控制方通过培养罐操作确定培养参数和控制方案以及顺序。案以及顺序。2020/11/336*微生物工业发酵过程图解微生物工业发酵过程图解 菌种菌种原种原种一级种子摇一级种子摇瓶扩大培养瓶扩大培养发酵培发酵培养基配制养基配制二级种子罐二级种子罐培养培养灭菌灭菌发酵发酵生产生产代谢产物代谢产物分离分离2020/11/337*基因工程菌的培养方式基因工程菌的培养方式 n补料分批培养补料分批培养 n连续培养连续培养 n透析培养透析培养 n固定化培养固定化培养 2020/11/338*补料分批培养补料分批培养n将种子接入反应器中后，培养一段时间，将种子接入反应器中后，培养一段时间，然后间
27、歇或连续补加新鲜培养基，使菌体然后间歇或连续补加新鲜培养基，使菌体进一步生长。进一步生长。n为保持基因工程菌生长所需的良好环境，为保持基因工程菌生长所需的良好环境，延长对数生长期，获得高密度菌体，通常延长对数生长期，获得高密度菌体，通常把溶氧控制和补料措施结合起来，根据生把溶氧控制和补料措施结合起来，根据生长规律来调节补料速率。长规律来调节补料速率。2020/11/339*连续培养连续培养 n将种子接入反应器后，培养一段时间，到将种子接入反应器后，培养一段时间，到一定菌浓，开动蠕动泵，同时进料和出料，一定菌浓，开动蠕动泵，同时进料和出料，控制一定稀释速率。控制一定稀释速率。n由于基因工程菌不稳
28、定，可将生长阶段和由于基因工程菌不稳定，可将生长阶段和基因表达阶段分开，进行两阶段连续培养。基因表达阶段分开，进行两阶段连续培养。n关键的控制参数是诱导水平、稀释率、细关键的控制参数是诱导水平、稀释率、细胞比生长速率胞比生长速率。2020/11/340*透析培养透析培养 n利用膜的半透性使代谢产物和培养利用膜的半透性使代谢产物和培养基分离。基分离。n通过去除培养液中的代谢产物来解通过去除培养液中的代谢产物来解除其对生产菌的不利影响除其对生产菌的不利影响 2020/11/341*固定化培养固定化培养 n基因工程菌固定化后，质粒的稳定基因工程菌固定化后，质粒的稳定性大大提高。性大大提高。n便于进行
29、连续培养，特别是对于分便于进行连续培养，特别是对于分泌型菌更为有利。泌型菌更为有利。2020/11/342*基因工程菌的发酵工艺基因工程菌的发酵工艺 n基因工程菌的发酵与传统的微生物发酵不同基因工程菌的发酵与传统的微生物发酵不同,基因工程基因工程菌带外源基因菌带外源基因,发酵的目的是使外源基因高效表达。发酵的目的是使外源基因高效表达。n它不仅涉及宿主载体和克隆基因之间的相互关系它不仅涉及宿主载体和克隆基因之间的相互关系还和环境有关。还和环境有关。n工艺要求：外源基因既高效表达，又有利于产品分离工艺要求：外源基因既高效表达，又有利于产品分离纯化纯化2020/11/343*对发酵影响较大的几个因素
30、对发酵影响较大的几个因素n培养基培养基n接种量接种量n温度温度n溶解氧溶解氧n诱导时机诱导时机npH2020/11/344*培养基的影响培养基的影响n培养基的组成既要提高工程菌的生长速率，培养基的组成既要提高工程菌的生长速率，又要保持工程菌的稳定性，使外源基因高又要保持工程菌的稳定性，使外源基因高效表达。效表达。n常用的碳源有：葡萄糖、甘油、乳糖、甘常用的碳源有：葡萄糖、甘油、乳糖、甘露糖、果糖等。露糖、果糖等。n常用的氮源有：酵母提取液、蛋白胨、酪常用的氮源有：酵母提取液、蛋白胨、酪蛋白水解物、玉米浆、氨水、硫酸铵、氯蛋白水解物、玉米浆、氨水、硫酸铵、氯化铵等。化铵等。n还有无机盐、维生素等
31、。还有无机盐、维生素等。2020/11/345*培养基的影响培养基的影响n不同的碳源对菌体的生长和外源基因表达不同的碳源对菌体的生长和外源基因表达有较大的影响。使用葡萄糖和甘油对菌体有较大的影响。使用葡萄糖和甘油对菌体比生长速率及呼吸强度相差不大。比生长速率及呼吸强度相差不大。n但使用甘油菌体得率较大，而使用葡萄糖但使用甘油菌体得率较大，而使用葡萄糖菌体产生的副产品较多。菌体产生的副产品较多。n葡萄糖对葡萄糖对laclac启动子有阻遏作用。乳糖对启动子有阻遏作用。乳糖对laclac启动子有利。启动子有利。2020/11/346*培养基的影响培养基的影响n在氮源中，酪蛋白水解物有利于产在氮源中，
32、酪蛋白水解物有利于产物的合成与分泌。色氨酸对物的合成与分泌。色氨酸对trptrp启启动子控制的基因有影响。动子控制的基因有影响。n无机磷在许多代谢反应中是一个效无机磷在许多代谢反应中是一个效应因子，磷浓度不同，影响菌体生应因子，磷浓度不同，影响菌体生长。长。2020/11/347*接种量的影响接种量的影响n接种量的大小影响发酵的产量和发酵周期。接种量的大小影响发酵的产量和发酵周期。n量小，延长菌体延迟期，不利于外源基因量小，延长菌体延迟期，不利于外源基因的表达。的表达。n量大，有利于对基质的利用，可以缩短生量大，有利于对基质的利用，可以缩短生长延迟期，并使产生菌能迅速占领整个培长延迟期，并使产
33、生菌能迅速占领整个培养环境，减少污染机会养环境，减少污染机会n但会使菌体生长过快，代谢产物累积过多，但会使菌体生长过快，代谢产物累积过多，反而会抑制后期菌体的生长。反而会抑制后期菌体的生长。2020/11/348*温度的影响温度的影响 n温毒对基因表达的调控作用发生在复制转温毒对基因表达的调控作用发生在复制转录翻译和小分子调节分子的合成等水平上。录翻译和小分子调节分子的合成等水平上。n温度对发酵过程的影响是多方面的。温度对发酵过程的影响是多方面的。n影响各种酶的反应速度。影响各种酶的反应速度。n改变菌体代谢产物的反应方向。改变菌体代谢产物的反应方向。n影响代谢调控机制。影响代谢调控机制。202
34、0/11/349*温度的影响温度的影响n适宜的发酵温度是既适合菌体的生长，适宜的发酵温度是既适合菌体的生长，又适合代谢产物合成的温度。又适合代谢产物合成的温度。n高温或低温都会使发酵异常，影响终高温或低温都会使发酵异常，影响终产物的形成并导致减产。产物的形成并导致减产。n温度还影响蛋白质的活性和包含体的形温度还影响蛋白质的活性和包含体的形成。成。2020/11/350*溶解氧的影响溶解氧的影响n对于好氧发酵对于好氧发酵,溶解氧浓度是重要的参数。溶解氧浓度是重要的参数。n好氧微生物利用溶解于培养液中的氧气好氧微生物利用溶解于培养液中的氧气进行呼吸。进行呼吸。n若能提高溶氧速度和氧的利用率，则能若
35、能提高溶氧速度和氧的利用率，则能提高发酵产率。提高发酵产率。2020/11/351*溶解氧的影响溶解氧的影响n菌体在大量扩增过程中，进行耗氧的氧化菌体在大量扩增过程中，进行耗氧的氧化分解代谢。分解代谢。n外源基因的高效表达需要大量的能量，外源基因的高效表达需要大量的能量，促进细胞的呼吸作用，提高对氧的需求。促进细胞的呼吸作用，提高对氧的需求。n采用调节搅拌转速的方法可以改善培养过采用调节搅拌转速的方法可以改善培养过程中的氧供给，提高活菌产量。程中的氧供给，提高活菌产量。2020/11/352*诱导时机的影响诱导时机的影响n 一般在对数生长期或对数生长期后期升一般在对数生长期或对数生长期后期升温
36、诱导表达。温诱导表达。n 对数生长期，细胞快速繁殖，直到细对数生长期，细胞快速繁殖，直到细胞密度达到胞密度达到109个每毫升为止。个每毫升为止。n 这时菌群数目倍增，对营养和氧的需求这时菌群数目倍增，对营养和氧的需求量急增，营养和氧成了菌群旺盛代谢的量急增，营养和氧成了菌群旺盛代谢的限制因素。限制因素。2020/11/353*pH的影响的影响n pH pH对细胞的正常生长和外源蛋对细胞的正常生长和外源蛋白的高效表达都有影响。白的高效表达都有影响。n 应根据工程菌的生长和代谢情应根据工程菌的生长和代谢情况，对况，对pHpH进行适当的调节。进行适当的调节。2020/11/354*pH的影响的影响n
37、 如采取两段培养工艺，培养前如采取两段培养工艺，培养前期重点是优化工程菌的生长条期重点是优化工程菌的生长条件，其最佳件，其最佳pHpH在在6.86.87.47.4左右左右;n 培养后期重点是优化外源蛋白培养后期重点是优化外源蛋白的表达条件的表达条件,其最佳其最佳pHpH为为6.06.06.56.5。2020/11/355*建立工程菌发酵的最佳化建立工程菌发酵的最佳化工艺要求工艺要求n最快周期、最高产量。最快周期、最高产量。n最好质最好质 量、最低消耗。量、最低消耗。n最大安全性、最周全的废物处理效果。最大安全性、最周全的废物处理效果。n最佳速度和最低失败率等最佳速度和最低失败率等2020/11/356*基因工程菌的培养设备基因工程菌的培养设备n目前应用发酵罐大规模培养基因工程目前应用发酵罐大规模培养基因工程菌。菌。n不同于微生物发酵，微生物发酵目的是不同于微生物发酵，微生物发酵目的是为了获得初级或次级代谢产物，细胞生为了获得初级或次级代谢产物，细胞生长并非主要目标。长并非主要目标。n而基因工程发酵是为了获得最大量的基因而基因工程发酵是为了获得最大量的基因表达产物。表达产物。2020/11/357*
