1、第十章第十章 基因工程基本原理简介基因工程基本原理简介 本章的重点内容：1.什么是基因工程？2.获得目的基因的方法有哪些？3.如何根据蛋白质氨基酸序列获得其基因？4.基因工程中的最新技术。第一节第一节 基因工程原理简介基因工程原理简介 一、基因工程的定义 本义：根据人们的意愿，利用工程设计的方法，在体外将克隆获得的目的基因与适当的载体进行切割和连接，构建成正确的重组表达载体，再应用物理的、化学的或生物学的方法将该表达载体导入到细菌、动植物细胞或受精卵中，使目的基因在宿主体内以瞬时方式或稳定方式进行表达，借此研究目的基因/DNA片段的结构与功能，或获得该基因的表达产物。这一过程就是基因工程。广义
2、：转基因动物；克隆；基因打靶；基因组计划等均属于基因工程的范畴。目的基因获得 表达载体构建 基因的导入 表达的鉴定 核酸鉴定：PCR;Southern and Northern blot.蛋白鉴定：SDS-PAGE;HPLC;Western blot.功能检测：机体生理生化功能、性状的改变。原核:包涵体,分泌型 真核:文库 合成 PCR 基因组文库cDNA文库 细菌：氯化钙；电穿孔;细胞：磷酸钙；脂质体；电穿孔；微注射；V;动物：微注射；电穿孔；精子；ESC；RT-V；载体 质粒(plasmid)粘粒(cosmid)噬菌体()第二节 基因工程的基本步骤和方法 第三节第三节 基因工程中的通用技术
3、基因工程中的通用技术 一、核酸的提取纯化与定量 包括RNA、DNA及plasmid DNA 的提取纯化技术 二、核酸电泳技术 1.琼脂糖凝胶电泳 2.SDS-PAGE 500 2000 1000 750 100 200 1 DL2000 marker 2 BamH1和EcoRI双切 3 BamH1单切 4 Hind单切 5 重组质粒pVAX1/ABPS1 1 2 3 4 5 三、核酸探针（probe）1.原理；2.标记物；3.种类；4.应用 Dot blot、Southern blot：DNA、Northern blot：RNA 四、四、Western blot:Protein 一、获得目的基
4、因的方法 基因文库（cDNA文库和基因组文库），化学合 成，PCR 等方法。还有DD-PCR 以及基因芯片等技 术。（一）基因组文库 目的：种质资源的保护；基因组测序；基因组 基因或调控序列的克隆等。第四节 基因工程中的常用技术 家蝇部分基因组文库构建、卵黄蛋白基因家蝇部分基因组文库构建、卵黄蛋白基因启动子克隆与初步应用研究启动子克隆与初步应用研究 Cloning and initial application of functional promoter of Musca domestica yolk protein gene 启动子克隆一般思路 启动子区 杂交 增强子 调控启动子 核心启动
5、子 基因 3 5 转录起始点 探针+50-40 ATG-4000-500 功能 分析 克隆启动子 实验一、家蝇部分基因组文库的构建 1 材料与方法?1.1 家蝇基因组DNA的提取?2.1 基因组DNA的部分酶切?3.1 EMBL3 载体臂的制备?4.1 连接与包装?5.1 基因组文库鉴定 Bcl I随机酶切 左臂 基因组DNA 右臂 left arm（20kb）central stuff 14kb right arm 9kb EcoR I BamH I Sal I BamH Sal I EcoR I 基因组DNA BamH I+CIP Bcl I Bcl I BamH I BamH I 包 装
6、 转化 KW251 噬菌斑 1023kb 包装蛋白 实验一、技术路线图 重组噬菌体 收集 噬菌体液 基因组文库 1.Genomic DNA 2.Lamba DNA Fig.1 electrophoresis of genomic DNA 图1.基因组DNA电泳 1 2 48.5kb 实验一结果?2.1 基因组DNA的提取?提取的基因组 DNA 大于50kb Fig.2 Digestion of genomic DNA by Bcl I 1.5U/ugDNA Bcl I，2.2.5U/ugDNA Bcl I 3.1.25 U/ugDNA Bcl I 4.Lamba DNA/Hind Marker
7、 图2.基因组DNA Bcl I 酶切电泳 23kb 9.4kb 1 2 3 4 Fig.3 Electrophoresis of recover products of 1023kb DNA fragments 1.Bcl I 酶切纯化片段 2.Lamba DNA/Hind Marker 图3.1023kb DNA片段回收产物电泳 23kb 9.4kb 1 2 实验一结果?2.2 家蝇基因组DNA酶切和纯化 纯化了1023kb的Bcl I酶切DNA片段 实验二、家蝇卵黄蛋白基因组基因的克隆 和序列分析 特异性探针 噬菌斑原位杂交 鉴定 可疑阳性克隆 亚克 隆 文库液 转化 KW251 噬菌斑
8、 三次纯化 噬菌斑原位杂交-DNA 提 取 阳性克隆 单酶切和双酶切 Southern Blot Hind III XhoI 目的DNA片段 测序 序列分析 实验二、技术路线实验二、技术路线 实验二结果实验二结果 GCTCCCGGCCGCCATGGCCGCGGGATCGAA CAAGAAGTCA CCGTTTTCATCACCGGTCTG CCCCAGTCCTTGGAGGATGTGAAAAAGGCCAACACCAAATTGATCCAGTCCTACATTCAACGTTACAGCAAAAAACCCGAAGCACCCCAGGGTGAGGATCAATCGAAATGGGAAAATGAAAAACCTGTGG
9、GCGGTCATTTGGTTGTCATCGATTTGGGCCATGCCATCACCAATGTGGAACGTTATGCCACTTTGAATGTCAAGGAGACCGGTAAAATGATTGGCAAGACCTTGGCCGAGTTGGAGAGGGAAAGCAATGTCGATTTGGAAGATCTCCATGTCATTGGTCAGGGTATTGGTGCCAATGTTGCCGGTGCTGCTGGTAAGGCTTTCAAGGACATTACCACCCACAAATTGGATCGCATTACTGCCTTGGACCCTGCCAGCCAAATGGCCAAGGA TCCCAAAGTTTTGACCGGTTTGTCTCGT
10、GGCAGTGCCAAATTCGTTGATGCCATCCACACCTCCGCCTTGGGTATGGGCACCACCCGTCGTGTTGGTGATGTTGATTTCTTCCCCAATGGACCATGCCAAGGTGTTCCCGGTAGCCGCAATGCCATCGATGCCCAAGCTCGTGCCACACGTCTCTTTGCCGAAACAGTTCGTCCCGGTAACAGCCGCAATTTCCCTGCCGTTGAGGCCAGCTCTTTGAAACAGTACCGCAACAATGATGGCTATGGCAAACGCACCTACATGGGCATTGCCACCCATCGTGACATCTCCGGTGACTAC
11、ATGTTGGAGGTTAAATCACTAGTGCGGCCGCCTGCAGGTCGACCATATGGGAGAGCTCCCAACGCGTTGGATGCATAGC 卵黄蛋白基因部分DNA片段特异性探针序列?2.1 特异性探针制备 制备了大小为768bp的地高辛标记的DNA片段特异性探针，工作浓度为1：2000。实验二结果实验二结果?2.2 阳性克隆的筛选和纯化 1#positive clone（about 2000 plaques/plate）Fig.3 Screening result of 1st round situ hybridization 图3 第一次噬菌斑原位杂交筛选结果 YP1 2
12、#positive clone（about 200 plaques/plate）Fig.4 Screening result of 2nd round situ hybridization 图4 第二次噬菌斑原位杂交筛选结果 Numbers：11 positive clone（11 plaques/plate）Fig.5 Screening result of 3rd round situ hybridization 图5 第三次噬菌斑原位杂交筛选结果 获得了含家蝇卵黄蛋白基因的阳性克隆 2.0 2.3 4.4 6.6 9.4 23 1.4 1.6 2.0 3.5 4.3 5.0 21 1 2
13、 3 4 5 6 kb kb Fig.6 Digestion analysis of recombinant -DNA of positive plaque 图6 阳性克隆-DNA的酶切分析 实验二结果?2.3 mdYP基因组基因的克隆 1:Lambda DNA/Hind Marker 2:Xho,3:Xho/Hind,4:Hind,5:Sal 6:DNA/EcoR+Hind Marker 3.5 kb 1 2 4 1:Xho I，2:Hind 3:Xho/Hind Fig.7 Southern blot of recombinant -DNA of positive plaque with
14、mdYP1 DNA probe DIG-labeled 图7 阳性克隆-DNA的 Southern blot 实验二结果?2.3 mdYP基因组基因的克隆 1 ACAGAATTTGCTATTTAGGTCTTATATTTCTCAGAGCAAAGAGCTGGGCTGCAGAGAGATTTATGACAACGCCGTTGTGTGGTGTATGTATATAGAAAGA 100 101 ATAGAAGAATTACTTTNCTTAGTTGTTTTTTAAATAATCCTGTCCAACAAATGTGTCCAATCCAATTCTTGTTTTATTGGTTTTATCCCTCCTTAATATT 200 201 AA
15、TCTTTTTGGTCTTATTGAATAATTATTGATTGTGGTGATTGCTGTCTCTACTTCGTTTGGTTTGGTTTGGTTGTCAGTTGCGAACGTTGGAAACAAAA 300 301 ATGAAAAACGTCCCAACGAAACGAATATGAAGGCCACAAAGGAATACCCGATAAAAAATAAACAGAAAGCAAAGACTCCGGGTACTCTGTTGTTTACGAA 400 401 TGAGACATGAGAGAATTGAACATCTTCACTAAAGAGCTCGGAATTAGTTACAAATTAAATTGAATTCGACGGTGCGGTGGCGAC
16、ATGACAGACGGACGGGT 500 501 TGATGGATAGATAACGGCGTTGAGAGTGAATGTGTTGGCGTCTTGTCTCTATTGCAGGGTGATTCATATATTAGAAAATTTACAATGGAAAAGTGGTTAT 600 601 TTTAAATAAGAAATAATATATATATGATATATATGATGTTTGGGGAAAAAATATGAAAAGATTACACTCTTACCTCATTATCTTTACTAAAAAAGGTATT 700 701 TTATGTATAAAAGGCTTGCAAAGTCGAAGTCTATTCACAAAAGATTCGAAAACGGT
17、AATAAATGATCCTTCAGCAAAATATTATTGGACAGTATTGGACA 800 801 ATTCAACGATAAAAAAGTCACATTAAAAAGTGCTTTAAAAATAATGGCGGTTGACTTTTTTGCAGTTTTTTTTTTATCTTACCCTTTATGTCTAAAACGG 900 901 ACATTTTCAAAGGAACCTTATTCTAAAAATCTCAAAATATATGGAAGAGGGGGTAACTTTCCTCCTCTATTTAGGTTACTTTCCGATGTAAATTTTCAAA 1000 1001 ACGCCATTACATTTGTCTTCTATTTTT
18、AGCCCTACTTTCATAATCTACTAGATTATTTCAGTATTTTTTTGCACAGTGCAGGTGATGATATTGGATAATT 1100 1101 CTTATTGAGGAAAAAATTCCCCAGTAAGAATGGAGAATCGGGTTATGAAACAAGATTTTTTAATAATTTCATTAATTATTTATTTTTTGNTTCTATGATT 1200 1201 TTGTGTTTTTTTTTTTTTTTGAATATTATTTTGAAATAAAGTGAAATCGAAATCTTCTCCTTTTTAGGTTATTGATCTAAAATACAAGGCTATTGCCAAA 1300
19、 1301 ATCATGTAATACAATATTTGCTGAAATAGGCCAAATCACTTCTCGCCCTCCGTTCTATTTTTGATGACAGTGAAGCATTATGCAAGCTTGTTTCAATCAATTCT 1400 1401 CCCGCTTATCGTCACAACCTCTACAGATTTTGCAATTTACGTAAAGAAAAAGAAAAACGGCAAAATATTGAAAATGAAAATCAGCAAAAATCAAAAAAAT 1500 1501 TATCAGCAGTTCTCGCTGGACTCACCTGACGGTCTGATTAACTATTTTGCTGTGAAATGTTAAATTTA
20、TTTGATATAAATATATAAATA CCCCCAGTGGAAGCCAGTG 1600 1601 GAGGGTACATTTCACAAGTTAGAACATTCGGCTTAAGAAGTGCCCGTACGACTTTGGGAATTTTTGAAACTGACCGACAGAAGGATGATGAATCCATTGGGAG 1700 1701 TTTTGTGCTTTGTAGCCTTTGTGGCTGCCGGCGCCTTGGCCTCACAATCGCAGGACTACAGTCCAAAGCCAGCACATTGGCTGAAACCCACCGAATTGGA 1800 1801 GGCCACACCATCTTTGAATGAGC
21、TCACCTTTGAGCAGCTGGAGAATATGCCATTGGAAAAGGGAGCCAAATTGATGCGTAAACTCTGTAAGTAGCCAGTC 1900 1901 AAGAATTTGGAAAAGACCTCCAATAATACAATTTCTCTCTTCTCTAGACCACCTGTCCCAAATCGACTACTCTGTGTCGCCCAACTTTGTGCCCAGTCCC 2000 2019 AGCAATGTCCCCGTCTACATTTTCAACAGCAAGGGTGAAAAAGAAACCTGCAACTTGAACAACTACGTCGACATTGCCAAGGAAAAGCCGAAATTTGGCG
22、2100 获得了全长3991bp的基因组序列，包含1.7kb卵黄蛋白基因组基因及其5-调控区序列。2101 AACAAGAAGTCACCGTTTTCATCACCGGTCTGCCCCAGTCCTTGGAGGATGTGAAAAAGGCCAACACCAAATTGATCCAGTCCTACATTCAACGTTACAG 2200 2201 CAAAAAACCCGAAGCACCCCAGGGTGAGGATCAATCGAAATGGGAAAATGAAAAACCTGTGGGCGGTCATTTGGTTGTCATCGATTTGGGCCATGCCATC 2300 2301 ACCAATGTGGAACGTTATGCCACT
23、TTGAATGTCAAGGAGACCGGTAAAATGATTGGCAAGACCTTGGCTGAGTTGGAGAGGGAAAGCAATGTCGATTTGG 2400 2401 AAGATCTCCATGTCATTGGTCAGGGTATTGGTGCCAATGTTGCCGGTGCTGCTGGTAAGGCTTTCAAGGACATTACCACCCACAAATTGGATCGCATTAC 2500 2501 TGCCTTGGACCCTGCCAGCCAAATGGCCAAGGATCCCAAAGTTTTGACCGGTTTGTCTCGTGGCAGTGCCAAATTCGTTGATGCCATCCACACCTCCGCC 2
24、600 2601 TTGGGTATGGGCACCACCCGTCGTGTTGGTGATGTTGATTTCTTCCCCAATGGACCATGCCAAGGTGTTCCCGGTAGCCGCAATGCCATCGATGCCCAAG 2700 2701 CTCGTGCCACACGTCTCTTTGCCGAAACAGTTCGTCCCGGTAACAGCCGCAATTTCCCTGCCGTTGAGGCCAGCTCTTTGAAACAGTACCGCAACAATGA 2800 2801 TGGCTATGGCAAACGCACCTACATGGGCATTGCCACCCATCGTGACATCTCCGGTGACTACATGTTGGA
25、GGTCAACGCCGAGAGCCCCTATGGCAAGAGA 2900 2901 ACTCCCGCCCGCAAACAAAAATCATACCATGGTGTTCATCAAACTTCCTATGCCAAAAGCAACGAAAACTATTAGAACGTTGGATGTTTGGCAAAAGAAA 3000 3001 AAGATTCTTTGGAAATGACTCCGAAAAAATTAAGCTGTGAATATTTGTCGAACGAAAACAGAAAAAAAAAACATCGAAGATAAATTATTGATTATTTAAT 3100 3101 TAAAAAAAAAAAAAAA AATAAGACTCTGAACATTA
26、CAAAAAGGAAATATTTATTTGAATTTTTATTCTTAGAGGATCGGGCGGGATAAACAAGATTATTA 3200 3201 AAGAAGGGCTAAAAATATAAGACAAGTGCGTCGGCGTTTTGAAAATGTACATGGCAAAGTAACCTAAATAGAGGCGCAAAGTTCCTCCTCTTCCCCATTT 3300 3301 TTAGAAATTTCGTTTCATAATATGTACAGGGTGAGATAAAAAAAAACTGCAACAAAGTCAAACGCTATAATTTTTATTTTTTTTTTAATTTTATTTATTG 3400 3401 AA
27、AGCAAAAAATGTCGGAAATAGCATCAAATTTTAGAATATATTTAGTGTACAAGTTCCAATACCGTCGTATGGACTTGTTGTGGTTCAAATTCTACTGA 3500 3501 GTAGATTTTGAGCCGGAATTTATTGTTGCACAAAGACGAACAACAATATTGTTTAGCAAACTACAAACAAACACAAAAGTATTCTGACGATACTTACGTT 3600 3601 TGTTGTCTGCACAAAAGAAAAAGCACTTTAATAATTAGTATTTCAAAGTTGAAAATGACTCAGTCGGTCAAATTTTTATT
28、TTATAAAAAAATTCACAATT 3700 3701 TTGATCTGGCGATCCACTTTTCTGAACTTCAAGAAGAAGAGTGCCGTTTTTAGTTTTGTGACGACATCGATAGTTTTTATTTATCGAGATCGATTAGATC 3800 3801 CATGTCGATGTCGTCATCTATCGGGTTGGGTCTATTCCCAACATGCCGGGCCCCTTGCACTGGTGCACAGTTAATGCCGTTGCTATTTTTTCAAGCACGC 3900 3901 TCAGGAACCTGTCCATCATCTCTGGCTGCTGCATTAAGGACTTTCCT
29、TCGGGTTTTAATTCGGGCTGTTGTGCGGTATGTCGACTTTGTTG 3991 Fig.3 The sequence of Musca domestica YP1 gene containing 1.7kb 5flanking region.The intron region(18861947)is marked by underlining,the TATA box or the AATAA signal is in bold,The translation initiation codon ATG or translation termination codon TAG
30、 is indicated by an open box。图3.卵黄蛋白基因组基因全序列 实验三、实验三、家蝇卵黄蛋白基因启动子片段的家蝇卵黄蛋白基因启动子片段的 克隆与功能分析克隆与功能分析 FP1 RP1或RP2 PCR FP2 FP3 P2 P3+7 5 3 ATG+1 启动子区 FP4 pMYP1-GFP3840bpHind IIIGFPNot IBamH ISpe IPOLY(A)TETMYP1pMYP2-GFP4238bpXba IGFPNot IBamH ISpe IHind IIIPOLY(A)TETMYP2pCMV-GFP4200 bpHind IIIGFPNot IBamH
31、 ISpe IPOLY(A)TETCMVP4 4720bpXba IGFPNot IBamH ISpe IHind IIIpMYP3-GFPPOLY(A)TETMYP34170bpXba IGFPNot IBamH ISpe IHind IIIpMYP4-GFPPOLY(A)TETMYP4P1 实验三、技术路线图 pGFP3560 b pSpe Hi n d GFP补平 T4 Ligase 表达质粒构建 表达质粒构建表达质粒构建 TATA Hind III P2 P3 TATA Hind III Hind III 酶切 P5 P6 pCMV-GFP4200 bpHind IIIGFPNot I
32、BamH ISpe IPOLY(A)TETCMV3940bppMYP5-GFPHind IIIGFPNot IBamH ISpe IPOLY(A)TETMYP54320bppMYP6-GFPHind IIIGFPNot IBamH ISpe IPOLY(A)TETMYP6pGFP3560 b pSpe Hin d GFP补平 T4 Ligase 鉴 定 电转移 转染 pMYP1-GFP pMYP2-GFP pMYP3-GFP pMYP4-GFP pMYP5-GFP pMYP6-GFP 转染 Sf9昆虫细胞 BHK-21 细胞 家蝇卵 绿色荧光蛋白 启动子活性 荧光显微镜 荧光显微镜 2.2 启
33、动子片段的转录活性鉴定 pMYP2-GFP质粒电转移结果 pMYP3-GFP质粒电转移结果 pMYP4-GFP质粒电转移结果 TE buffer电转移结果 实验三结果实验三结果 家蝇早期胚胎转基因前后的 差异表达研究 2.DD-PCR技术技术 5-NMAAAAAAAAAAAAAn细胞总RNA或poly(A)RNA 5-NMAAAAAAAAAAAAAn cDNA 3-N M TTTTTTTTTTTT 简并锚定引物 进行PCR 随机十聚体 NNNNNNNNNN NMTTTTTTTTTTTT 持续循环 NNNNNNNNNN NMTTTTTTTTTTTT 变性聚丙烯酰胺凝胶电泳 样品A 样品B 作No
34、rthern 探针 作cDNA文库筛选探针 作亚克隆和测序样品 反转录反应 切取目的带,重新扩增,回收纯化 图3.家蝇早期胚胎转基因前后DD-PCR结果 1、3、5转基因处理组转基因处理组T11MA-AP1、T11MA-AP3、T11MA-AP4 2、4、6对照组对照组 T11A-AP1、T11MA-AP3、T11MA-AP4 图4.差异片段的二次PCR回收结果 1DD-frag-6 2DD-frag-5 3DD-frag-3 MDL2000 Marker DD-frag-3：355 nt GGTACTCCAGTACAACTGATATCGTATGTTGAAATTCCTGCCGTGAGCAAAG
35、CTCCCTTTGTAATAATCAGTACCCAAGAACAGGCAAACAAATAAATAACAGTTCTAAGTGAAATAACTGATGATCTACTATACAAAACTTATAAAGAGATAATAAGGTATTCGGTAATAAAATAAAAAAATAGTAAAGGTGGGTTCTTACTAATTATTCATTCAATAATAATAATCGAATGTATTACTGCTCCCTAAATCAACTAAACAGTTCTAATAGAGTTGAGGGAATGCATGCAGTAATATTCCTGTTGTAAAATTGAATGAAGCTCCAAACCTGTTCCAATGCAGGAGTATATCT
36、GGA DD-frag-5：432 nt GCAATCGATGTACGATGTTTAACAACAACAAGAGTAATTACACTTTCAATTTTCACTTGTCTAACCAAAATTCATGTTGTATGAATGTCAAAAAGAAAAGACGACGGGTAACAAAAATCGAAAGTGAGCAACAATCGATTCTGGTGACGACAAAATTCTTAAGCAAGAAATCATCATCTTAAGAACGAAACAACTCATTGACCTAGAATGTTGATTGACAACTTAATGCTTCACCACTAGACATTACTCGTCAGCTGGTTACATCGATTG TTAAACGT
37、TTTCAAATCGAAACACTAGAAGATGGATAACCCGTGATTGGCTTTTCGTATTAAAGATAGATGTAAATCAACCGCGAATTGTTCAACAACAACCAAGCAAAGGAATCAACTGAACACATATCAAAGAGTGTTTGGCACTTTATATAAATACTT DD-frag-6：240 nt GCAATCGATGTCACGATCGTAAGCGTTAACCAAAATTGCGTCCTCTAGAGATAGTATTCAACAAGCGATAATGGCCGTACTGAGGCAAATCTTTGTCATTCCCAAAAGTATGTTTCAGAAGCACCTTGG
38、TAATAGTGCAAAATATAGGCCTTATTGAATTTTGACGAAATCTCTTTCATGATTTTAGTGCATCGATTGC ATACAAACGCTCTTTTGTAAGCCAAGACATAGTTTCTCCA 图图8 DD-frag-3（上）、DD-frag-5（A）与DD-frag-6（B）点杂交鉴定结果 1阳性对照 2.阴性对照 3.家蝇基因组 1阴性对照阴性对照;2.家蝇基因组;3转基因处理组;4.对照组 三、重组质粒的构建与鉴定三、重组质粒的构建与鉴定 1.工具酶：限制性内切酶、连接酶、聚合酶及其他修饰酶等；2.大肠杆菌感受态细胞；3.DNA的酶切与回收；1pIRES-E
39、GFP5200bppCMVMCSIVSIRESEGFPPoly ACol E1Amp图图.pIRES-EGFP 4.目的片段与载体的连接；5.转化与重组质粒的鉴定；1）初步鉴定：-互补；快速鉴定；原位杂交；PCR；抗性筛选；2）酶切鉴定；3）测序鉴定。四、提高表达效率的技术方法 1.选用强启动子，如CMV、EF1 等；2.增强子，如MAR序列；3.poly(A)；4.组成型表达（可诱导表达）；5.Dhfr加压筛选系统；6.串联表达（融合表达）；7.稳定表达（瞬时表达）；8.Kozak序列（CCACCATG）；SD序列 9.密码子优化；10.联合应用几种方法。五、阳性克隆筛选技术五、阳性克隆筛选
40、技术 1.报告基因：cat；LacZ；GFP；YFP；hGH；生长激素。2.抗性筛选：Amp；Tetr；G418；潮霉素；氯霉素。3.其 他：MTX-DHFR；HGPRT。六、重组病毒构建技术（反向遗传学操作技术！）1.Ad2 vector 2.Baculovirus vector 3.RT-V vector 七、转基因方法与转基因动物 八、由真核生物蛋白质氨基酸序列获得其 cDNA基因 第五节第五节 基因工程中的最新技术基因工程中的最新技术 一、克隆技术 二、蛋白质工程 三、生物芯片技术 四、抗体库与基因工程抗体 五、RNAi and iPS Protein EngineeringProte
41、in Engineering：以蛋白质分子的结构规律及其与生物功能的关系为基础，通过有目的的分子设计，或人工直接合成蛋白质（多肽），或利用基因工程手段，对已知或未知蛋白质进行定向改造，获得比天然蛋白更优良、更符合人们需要的新型蛋白质的过程。Huge Mouse A transgenic mouse with an active rat growth hormone gene(left)is twice the size of a normal mouse(right).凡事之本，必先治身！-吕氏春秋先己 不疾学而能为魁士名人者，未之尝有也！-吕氏春秋劝学 在科学的道路上，只有丰碑，没有路标！-爱因斯坦 知识+智慧+机遇+奋斗+健康 成功!衣带渐宽终不悔，为伊消得人憔悴。柳永（宋）伊新解：科学
