1、基因工程第五章克隆重组体的构建转化2023-2-12第五章 克隆重组体的构建、转化第一节 受体细胞n受体细胞的选择n限制缺陷型大肠杆菌的限制系统主要由大肠杆菌的限制系统主要由hsd R基因编码，因此具有基因编码，因此具有hsd R遗传表型的遗传表型的 大肠杆菌各株均丧失了降解外源大肠杆菌各株均丧失了降解外源DNA的的能力，同时大大增加了外源能力，同时大大增加了外源DNA的可转化性。的可转化性。n重组缺陷型大肠杆菌中存在着两条体大肠杆菌中存在着两条体 内同源重组的途径，即内同源重组的途径，即RecBCD途径和途径和RecEF途径，前者远比后者重要，但两种途径均需途径，前者远比后者重要，但两种途径
2、均需要要 RecA重组蛋白的参与重组蛋白的参与。因此受体细胞必须选择体内同源重组缺陷型的遗传表型，其相应的基因因此受体细胞必须选择体内同源重组缺陷型的遗传表型，其相应的基因 型为型为recA-、recB-、recC-.n遗传互补型n感染寄生缺陷型2023-2-12第五章 克隆重组体的构建、转化第一节 受体细胞n常用的受体细胞n原核生物细胞 大肠杆菌（G-）、枯草杆菌（G+）、蓝细菌n真菌细胞 酵母菌n植物细胞 水稻、棉花、玉米、拟南芥等n动物细胞 小鼠L细胞、Hela细胞、中国仓鼠卵巢细胞（CHO）等2023-2-12苏州科技学院生物系 叶亚新各种基因工程受体的特性各种基因工程受体的特性大肠杆
3、菌大肠杆菌遗传背景清楚，载体受体系统完备，生长迅速，培养简单，重组子稳定产结构复杂、种类繁多的内毒素2023-2-12苏州科技学院生物系 叶亚新各种基因工程受体的特性各种基因工程受体的特性枯草杆菌枯草杆菌 遗传背景清楚，蛋白质分泌机制健全，生长迅速，培养简单，不产内毒素 适用于原核生物基因的克隆、表达以及重组蛋白多肽的有效分泌适用于原核生物基因的克隆、表达以及重组蛋白多肽的有效分泌 遗传欠稳定，载体受体系统欠完备2023-2-12苏州科技学院生物系 叶亚新各种基因工程受体的特性各种基因工程受体的特性链霉菌链霉菌抗生素的主要生产者，分子遗传相对操作简便，不产内毒素主要用于抗生素生产菌株的改良遗传
4、不稳定，生长相对缓慢2023-2-12苏州科技学院生物系 叶亚新各种基因工程受体的特性各种基因工程受体的特性酵母菌 具有真核生物的特征，遗传背景清楚，生长迅速，培养简单，遗传稳定 适用于外源DNA的扩增、克隆以及真核生物基因的高效表达、基因文库的构建、真核生物基因表达调控的研究，是DNA重组实验和基因工程重要的真核性受体菌 不含有特异性的病毒、不产生毒素 内源性蛋白产物种类繁多且含量高 具有真核生物蛋白翻译后修饰加工系统转化（transformation）：重组子通过与膜蛋白结合进入受体细胞并在受体细胞内稳定维持和表达的过程。第五章 克隆重组体的构建、转化苏州科技学院生物系 叶亚新各种基因工程
5、受体的特性苏州科技学院生物系 叶亚新三、重组DNA分子导入植物细胞适用于外源DNA的扩增和克隆、原核生物基因的高效表达、基因文库的构建，是DNA重组实验和基因工程的主要受体菌三、重组DNA分子导入植物细胞苏州科技学院生物系 叶亚新例如，某一DNA重组实验的重组率为20%，转化率为107/mg载体，7 kb，最好选用单一切口的酶将质粒线型化，然基于非接合型质粒的迁移作用而建立的一种DNA转化方式脂质体是由人工构建的磷脂双分子层组成的膜状结构，可以将DNA包在其内，并通过脂质体与原生质体的融合或由于原生质体的吞噬过程，把外源DNA转运到细胞内。苏州科技学院生物系 叶亚新各种基因工程受体的特性第五章
6、 克隆重组体的构建、转化包括种类：菌落印迹原位杂交、斑点印迹杂交、Southern 印迹杂交和Northern 印迹杂交。如果拥有目的基因的mRNA，则可通过逆转录酶将其反转录成单链cDNA，以cDNA为探针无论在长度还是在同源性上都较为理想。四环素 tetracymic Tc或Tet用EcoRI酶切转化子质粒DNA2023-2-12苏州科技学院生物系 叶亚新各种基因工程受体的特性昆虫细胞（家蚕）具有真核生物的特征，外源基因表达量高，繁殖相对较快，培养成本低廉，遗传稳定 适用于真核生物基因的高效表达 DNA重组操作系统欠完善2023-2-12苏州科技学院生物系 叶亚新各种基因工程受体的特性哺乳
7、动物细胞（中国仓鼠卵巢细胞 CHO）与人的亲缘关系近，分子重组表达系统健全，具有合适的糖基化修饰系统 适用于哺乳类动物和人的基因表达调控研究、基因药物的生产，是DNA重组实验和基因工程的主要哺乳动物受体 细胞培养条件苛刻，生长缓慢 2023-2-12苏州科技学院生物系 叶亚新各种基因工程受体的特性植物细胞（拟南芥菜、烟叶）农作物的经济意义重大，转基因植物细胞易于分化，细胞培养简单且成本低廉，具有光合作用 适用于高等植物基因表达调控的研究、基因药物的生产，农作物品质的改良 遗传操作繁琐 2023-2-12第五章 克隆重组体的构建、转化第二节 重组DNA分子导入宿主细胞n以质粒为载体：转化作用、接
8、合作用n以噬菌体为载体：转染作用、转导作用一、重组质粒DNA分子转化E.colin转化（transformation）：重组子通过与膜蛋白结合进入受体细胞并在受体细胞内稳定维持和表达的过程。n细菌感受态的形成（感受态细胞：处于能吸收周围环境中DNA分子的生理状态的细胞）n转化因子的吸收n整合复合物前体的形成n单链DNA转化因子的整合n转化子的形成2023-2-12第五章 克隆重组体的构建、转化第二节 重组DNA分子导入宿主细胞一、重组质粒DNA分子转化E.colinCa2+诱导转化1.利用CaCl2处理E.coli，能够促进其对噬菌体DNA、质粒DNA的吸收，重复性好，操作简便，适合成批制备感
9、受态细胞2023-2-12第五章 克隆重组体的构建、转化第二节 重组DNA分子导入宿主细胞一、重组质粒DNA分子转化E.colin电穿孔转化法n利用高压脉冲作用，在E.coli细胞膜上进行电穿孔（electroporation），形成可逆的瞬间通道，从而促进外源DNA的有效吸收。2.需在低温下（0-4）进行，转化效率高。2023-2-12第五章 克隆重组体的构建、转化第二节 重组DNA分子导入宿主细胞一、重组质粒DNA分子转化E.colin接合转化法（三亲本杂交接合转化法）n基于非接合型质粒的迁移作用而建立的一种DNA转化方式3.非接合型质粒由于缺少编码接合转移基因的功能区，因此不能直接通过细
10、胞接合转化受体细胞，但当同一细胞中共存一个含有接合功能的辅助质粒，则这些非接合型质粒通常也会被转移。2023-2-12苏州科技学院生物系 叶亚新细菌原生质体的转化 革兰氏阳性细菌（如枯草杆菌、链霉菌等）接纳外源DNA的主要屏障是细胞壁，因而这类细菌通常采用原生质体（细胞去壁后的形态）转化的方法转移质粒或重组DNA分子 酵母菌、霉菌、植物细胞也可用原生质体法进行转化 2023-2-12苏州科技学院生物系 叶亚新转化率转化率转化率的定义转化率的定义 转化率是衡量转化效率的重要指标，其定义为：每微克载体DNA在最佳转化条件下进入受体细胞的分子数。由于在一般的转化实验规模下，每个受体细胞最多只能接受一
11、个载体分子，因此转化率的定义也可以表征为：每微克载体DNA转化后，受体细胞接纳DNA的个数，即克隆数（在筛选时，未接纳载体或重组子的受体细胞不长）2023-2-12苏州科技学院生物系 叶亚新细菌原生质体的转化细菌原生质体的转化 不同细菌的原生质体制备方法不尽相同，以链霉菌为例：细菌需生长在高渗培养基中（如34%的蔗糖溶液，并加入甘氨酸以增加细菌细胞壁对溶菌酶的敏感性。在制备过程中，菌体应始终悬浮在10.3%的蔗糖等渗溶液中。与原生质体接触的所有器皿应保持无水无去污剂 细菌原生质体细菌原生质体的制备：的制备：2023-2-12苏州科技学院生物系 叶亚新转化率转化率转化率的定义转化率的定义 例如，
12、pUC18对大肠杆菌的转化率为108，即每微克pUC18中只有108个分子能进入受体细胞。一微克pUC18共有3.4X1011个分子（6.02X1017/2686X660），也就是说，每3400个pUC18分子才有一个分子进入受体细胞 另一方面，在实际操作过程中，转化一微克pUC18共需2ml感受态细胞，大约含有2X1010个大肠杆菌细胞，也就是说，每200个细胞只有一个细胞能接纳pUC18 DNA 2023-2-12苏州科技学院生物系 叶亚新转化率转化率转化率的用途 利用转化率和重组率等参数可以帮助设计DNA重组实验规模例如，某一DNA重组实验的重组率为20%，转化率为107/mg载体，经切
13、接处理后的载体转化率比天然的载体低100倍，欲获得104个 重组克隆，需投入多少载体DNA进行重组实验？若重组率为100%，则转化后产生104个重组克隆需要：104/107 X 10-2=0.1 mg 载体DNA 考虑到实验系统的重组率为20%，所以实际投入载体应为：0.1/20%=0.5 mg 载体DNA 载体投入量确定后，外源DNA的投入量即可按10 1的要求算出（5 mg），甚至还可以估算需要涂布多少块平板进行筛选 2023-2-12苏州科技学院生物系 叶亚新转化率转化率转化率的影响因素载体及DNA重组分子方面：载体本身的性质：不同的载体转化同一株受体细胞，其转化率不同 载体的空间构象：
14、质粒的超螺旋构象转化率最高，经酶切连接操作后的载体由于空间构象难以恢复，其转化率一般要比新制备的超螺旋质粒低两个数量级 插入片段的大小：对质粒载体而言，插入片段越大，转化效率越低 2023-2-12苏州科技学院生物系 叶亚新转化率转化率转化率的影响因素受体细胞方面：受体细胞必须与载体相匹配，例如：pBR322转化大肠杆菌JM83株，转化率很低；但对大肠杆菌ED8767株的转化率则较高 转化（transformation）：重组子通过与膜蛋白结合进入受体细胞并在受体细胞内稳定维持和表达的过程。载体DNA分子上通常携带有一定的选择性遗传标记基因，转化或转染宿主细胞后可以使后者呈现出特殊的表型或遗传
15、学特征，据此可进行转化子或重组子的初步筛选。例如，某一DNA重组实验的重组率为20%，转化率为107/mg载体，4 kb两片段，表明两者2)重组DNA分子能否自主复制在细胞水平上，放射自显影可用来确定生物大分子的合成部位，以及随后在细胞内的运动情况。一、遗传表型直接筛选法6 kb的片段必为0.如果外源DNA片段插在pUC18的SphI位点处，原则上也可用SphI酶解鉴定，但这样做很不经济，因为SphI非常昂贵（每100单位50美元）。农杆菌介导的Ti质粒载体转化法各种基因工程受体的特性第五章 克隆重组体的构建、转化苏州科技学院生物系 叶亚新聚阳离子-DMSO转染法杂交的双方是：待测的核酸序列+
16、已知序列的核酸探针。第五章 克隆重组体的构建、转化苏州科技学院生物系 叶亚新各种基因工程受体的特性已有实验条件：仪器，载体种类等已有实验条件：仪器，载体种类等转染（transfection）：将重组噬菌体DNA分子直接导入受体细胞中的过程。2023-2-12第五章 克隆重组体的构建、转化第二节 重组DNA分子导入宿主细胞二、重组噬菌体DNA分子导入E.colin转染（transfection）：将重组噬菌体DNA分子直接导入受体细胞中的过程。n转导（transduction）：通过噬菌体颗粒感染宿主细胞，把外源DNA分子转移到受体细胞内的过程。n转导前必须对重组DNA分子进行人工体外包装，使其
17、成为具有感染活力的噬菌体颗粒。EDNADEDNAD+2023-2-12第五章 克隆重组体的构建、转化第二节 重组DNA分子导入宿主细胞三、重组DNA分子导入植物细胞n农杆菌介导的Ti质粒载体质粒载体转化法n叶盘法转化植物细胞n整体植株接种转化法n原生质体共培养转化法1.悬浮细胞共培养转化法2023-2-12第五章 克隆重组体的构建、转化第二节第二节 重组重组DNA分子导入宿主细胞分子导入宿主细胞三、重组三、重组DNA分子导入植物细胞分子导入植物细胞nDNA的直接转移法的直接转移法n多聚物介导法多聚物介导法 PEG法法(聚乙二醇法聚乙二醇法)n电穿孔（电穿孔（electroporation）转化
18、法）转化法n激光微束穿孔转化法激光微束穿孔转化法n显微注射法（显微注射法（microinjection）n超声波介导转化法超声波介导转化法n基因枪法基因枪法(particle gun)n脂质体介导法（脂质体介导法（liposome）2.花粉管通道法花粉管通道法2023-2-12电穿孔（electroporation）转化法n细胞膜的基本成分是磷脂双分子层，在适当的外加电压作用下，细胞膜有可能被击穿，但不会导致细胞致命的伤害，当移去外加电压后被击穿的膜孔可自行修复。显微注射法（microinjection）n利用显微注射仪，通过机械方法把外源DNA直接注入细胞质或细胞核的基因转化方法。基因枪法(
19、particle gun)n利用高速运行的金属颗粒轰击细胞时能进入细胞的现象，将包裹在金属颗粒表面的外源DNA随之带入细胞进行表达的基因转化方法。脂质体介导法（liposome）n脂质体是由人工构建的磷脂双分子层组成的膜状结构，可以将DNA包在其内，并通过脂质体与原生质体的融合或由于原生质体的吞噬过程，把外源DNA转运到细胞内。2023-2-12第五章 克隆重组体的构建、转化第二节 重组DNA分子导入宿主细胞四、重组DNA分子导入哺乳动物细胞n病毒颗粒转导法n磷酸钙转染法nDEAE-葡聚糖转染法n聚阳离子-DMSO转染法n显微注射转基因技术n电穿孔DNA转移技术1.脂质体介导法2023-2-1
20、2选择方法的依据：1转化频率 取决于以下几个因素：1)外源DNA能否易于进入宿主细胞；2)重组DNA分子能否自主复制 3)标记基因表达效率2.检测转化体的方法：是否具有选择压力3.生物材料的种类：细胞大小，有无细胞壁，除去细胞壁后的原生质体能否易于再生4.已有实验条件：仪器，载体种类等2023-2-12第三节 重组子的筛选n 由于重组率和转化率不可能达到理想极限，因此必须借助各种筛选和鉴定方法区分转化子与非转化子、重组子与非重组子、目的重组子与非目的重组子n转化子n重组子n目的重组子当目的基因插入到lacZ区段时，受体无法形成，便不能转译形成-半乳糖苷酶，因而在含有X-gal和IPTG的培养基
21、中形成白色菌落。电脑自动检测、记录、编辑程序苏州科技学院生物系 叶亚新聚阳离子-DMSO转染法苏州科技学院生物系 叶亚新生物材料的种类：细胞大小，有无细胞壁，除去细胞壁后的原生质体能否易于再生需在低温下（0-4）进行，转化效率高。适用于外源DNA的扩增、克隆以及真核生物基因的高效表达、基因文库的构建、真核生物基因表达调控的研究，是DNA重组实验和基因工程重要的真核性受体菌coli细胞膜上进行电穿孔（electroporation），形成可逆的瞬间通道，从而促进外源DNA的有效吸收。苏州科技学院生物系 叶亚新苏州科技学院生物系 叶亚新苏州科技学院生物系 叶亚新用SSC-SDS液洗涤杂交薄膜苏州科
22、技学院生物系 叶亚新大肠杆菌的限制系统主要由hsd R基因编码，因此具有hsd R遗传表型的 大肠杆菌各株均丧失了降解外源DNA的能力，同时大大增加了外源DNA的可转化性。根据目的基因在受体细胞中的表达产物的性质，筛选含有目的基因的克隆子。第五章 克隆重组体的构建、转化农杆菌介导的Ti质粒载体转化法利用高压脉冲作用，在E.三、重组DNA分子导入植物细胞2023-2-12第五章 克隆重组体的构建、转化第三节 重组子的筛选一、遗传表型直接筛选法（一）根据载体选择标记初步筛选转化子n载体DNA分子上通常携带有一定的选择性遗传标记基因，转化或转染宿主细胞后可以使后者呈现出特殊的表型或遗传学特征，据此可
23、进行转化子或重组子的初步筛选。2023-2-12第五章 克隆重组体的构建、转化第三节 重组子的筛选一、遗传表型直接筛选法（一）根据载体选择标记初步筛选转化子n抗药性筛选n主要用于重组质粒DNA分子的转化子的筛选n氨苄青霉素氨苄青霉素 ampicillin Apampicillin Ap或或AmpAmpn氯霉素氯霉素 chloramphenicol Cm chloramphenicol Cm或或 Cmp Cmpn卡那霉素卡那霉素 kanamycin Kn kanamycin Kn或或KanKann四环素四环素 tetracymic Tc tetracymic Tc或或TetTet1.1.插入失活
24、筛选插入失活筛选 插入表达筛选插入表达筛选2023-2-12第五章 克隆重组体的构建、转化第三节 重组子的筛选一、遗传表型直接筛选法（一）根据载体选择标记初步筛选转化子n显色互补筛选法nE.coli的载体质粒上含有lacZ基因，其表达产物为无活性的酶，称为受体，而在受体细胞存在相应的供体编码序列。n无论在胞内还是胞外，受体一旦与供体结合，便可以恢复-半乳糖苷酶的活性，在含有X-gal和IPTG的培养基中形成。2.当目的基因插入到lacZ区段时，受体无法形成，便不能转译形成-半乳糖苷酶，因而在含有X-gal和IPTG的培养基中形成。2023-2-12第五章 克隆重组体的构建、转化n营养缺陷型检测
25、法营养缺陷型检测法n根据目的基因在受体细胞中的表达产物的性质，筛选含有目的基因的克隆子。n基因产物能降解某些药物使得菌株呈现出抗性标记n基因产物与某些药物作用呈现颜色反应2023-2-12n形成噬菌斑筛选法n对噬菌体载体系统，外源DNA 插入载体后，重组分子大小必须在野生性DNA长度的78%-105%，才能在体外包装成具有感染活力的噬菌体颗粒，转导受体菌后，转化子在培养基平板上被裂解形成噬菌斑，而非转化子能正常生长。2023-2-12第五章 克隆重组体的构建、转化二、利用重组子结构特征分析的筛选法n根据外源DNA片段插入的重组质粒与载体DNA之间大小的差异来区分重组子和非重组子。n重组子中插入
26、了外源DNA片段，分子质量较载体DNA分子大，在琼脂糖凝胶电泳时迁移速率较慢。n限制酶酶切分析法n从转化菌落中随机挑选出少数菌落，快速提取质粒DNA，然后用限制酶酶解，并通过凝胶电泳分析来确定是否有外源基因插入以及插入的方向。n利用利用PCRPCR方法筛选确定重组子方法筛选确定重组子在细胞水平上，放射自显影可用来确定生物大分子的合成部位，以及随后在细胞内的运动情况。第五章 克隆重组体的构建、转化0 kb的条带中含有两种不同的分子适用于原核生物基因的克隆、表达以及重组蛋白多肽的有效分泌后通过其长度来鉴定其是否为重组子苏州科技学院生物系 叶亚新苏州科技学院生物系 叶亚新二、利用重组子结构特征分析的
27、筛选法苏州科技学院生物系 叶亚新氯霉素 chloramphenicol Cm或 Cmp第五章 克隆重组体的构建、转化该重组质粒经酶解后，分别得到下列几组数据：第五章 克隆重组体的构建、转化三、核酸分子杂交检测法5 mg 载体DNA苏州科技学院生物系 叶亚新适用于原核生物基因的克隆、表达以及重组蛋白多肽的有效分泌具有真核生物的特征，外源基因表达量高，繁殖相对较快，培养成本低廉，遗传稳定适用于原核生物基因的克隆、表达以及重组蛋白多肽的有效分泌区分目的重组子与非目的重组子2023-2-12苏州科技学院生物系 叶亚新克隆DNA序列检测限制性酶切图谱法 所谓的限制性酶切图谱法就是对载体上插入的外源DNA
28、片段进行酶切图谱分析，并以此与目的基因的已知图谱对比，因此利用这种方法不仅能区分重组子与非重组子，而且还能鉴定目的重组子。但这种方法在用于数千规模的转化子筛选时，工作量极大，实验成本也高。2023-2-12苏州科技学院生物系 叶亚新克隆克隆DNA序列检测序列检测限制性酶切图谱法限制性酶切图谱法全酶解图谱法：全酶解图谱法：pUC18 2.7 kbHindIII SphI PstI SalI BamHI SmaI KpnI EcoRIAprlacZoriBBEP4.0 kb1.0 kb0.8 kb区分重组子与非重组子区分重组子与非重组子用用BamHI酶切转化子质粒酶切转化子质粒DNA电泳观察酶解产
29、物片段电泳观察酶解产物片段重组子：重组子：2.7 kb+4.0 kb非重组子：非重组子：2.7 kb如果外源如果外源DNA片段也是片段也是2.7 kb，最好选，最好选用单一切口的酶将质粒线型化，然用单一切口的酶将质粒线型化，然后通过其长度来鉴定其是否为重组子后通过其长度来鉴定其是否为重组子2023-2-12苏州科技学院生物系 叶亚新克隆克隆DNA序列检测序列检测限制性酶切图谱法限制性酶切图谱法全酶解图谱法：全酶解图谱法：pUC18 2.7 kbHindIII SphI PstI SalI BamHI SmaI KpnI EcoRIAprlacZoriSSBP4.0 kb1.0 kb0.8 kb
30、区分重组子与非重组子区分重组子与非重组子如果外源如果外源DNA片段插在片段插在pUC18的的SphI位点处，原则上也可用位点处，原则上也可用SphI酶酶解鉴定，但这样做很不经济，因为解鉴定，但这样做很不经济，因为SphI非常昂贵（每非常昂贵（每100单位单位50美美元）。用元）。用HindIII和和EcoRI联合酶解联合酶解同样可以达到目的，但这两种酶的价同样可以达到目的，但这两种酶的价格只及格只及SphI的的1/50 2023-2-12苏州科技学院生物系 叶亚新克隆克隆DNA序列检测序列检测限制性酶切图谱法限制性酶切图谱法全酶解图谱法：全酶解图谱法：pUC18 2.7 kbHindIII S
31、phI PstI SalI BamHI SmaI KpnI EcoRIAprlacZoriBBEP4.0 kb1.0 kb0.8 kb区分目的重组子与非目的重组子区分目的重组子与非目的重组子用用EcoRI酶切转化子质粒酶切转化子质粒DNA目的重组子：目的重组子：3.0 kb+3.7 kb 或者：或者：1.0 kb+5.7 kb用用PstI酶切转化子质粒酶切转化子质粒DNA目的重组子：目的重组子：3.2 kb+3.5 kb 或者：或者：0.8 kb+5.9 kb2023-2-12苏州科技学院生物系 叶亚新克隆克隆DNA序列检测序列检测限制性酶切图谱法限制性酶切图谱法全酶解图谱法：全酶解图谱法：p
32、UC18 2.7 kbHindIII SphI PstI SalI BamHI SmaI KpnI EcoRIAprlacZoriBBE4.0 kb2.0 kb2.0 kb区分目的重组子与非目的重组子区分目的重组子与非目的重组子对图示的克隆片段，转化子质粒对图示的克隆片段，转化子质粒DNA用用EcoRI酶切开后，只出现酶切开后，只出现2.0 kb和和2.7 kb两条带子，实际上两条带子，实际上2.0 kb的条带中含有两种不同的分子的条带中含有两种不同的分子2.7 kb2.0 kbE2023-2-12苏州科技学院生物系 叶亚新克隆克隆DNA序列检测序列检测限制性酶切图谱法限制性酶切图谱法部分酶解
33、图谱法：部分酶解图谱法：2.2 kbPstI EcoRI BamHIBBE4.4 kb1.2 1.8 kbEB0.6 0.8 该重组质粒经酶解后，分别得到下列几组数据：该重组质粒经酶解后，分别得到下列几组数据：BamHI全酶解：全酶解：0.6 0.8 1.8 3.4 kbBamHI+EcoRI全酶解：全酶解：0.6 0.8 1.8 1.2 2.2 kb其中，其中，1.2 kb片段的存在表明该片段位于一端片段的存在表明该片段位于一端BamHI部分酶解：部分酶解：1.4 2.6 4.0 kb其中，其中，1.4 kb的片段必为的片段必为0.6 kb和和0.8 kb两片段，表两片段，表明两者是连在一起
34、的；同理，明两者是连在一起的；同理，2.6 kb的片段必为的片段必为0.8 kb和和1.8 kb两片段，表明两者是连在一起的；最后，两片段，表明两者是连在一起的；最后，4.0 kb的片段必为的片段必为0.6 kb和和3.4 kb两片段，表明两者两片段，表明两者是连在一起的是连在一起的2023-2-12三、核酸分子杂交检测法n具有一定同源性的两条核酸（DNA或RNA）单链，在适宜的温度及离子强度等条件下，可按碱基互补配对原则，高度特异性地复性形成双链。n杂交的双方是：待测的核酸序列+已知序列的核酸探针。n包括种类：菌落印迹原位杂交、斑点印迹杂交、Southern 印迹杂交和Northern 印迹
35、杂交。2023-2-12放射自显影n在标记了放射性同位素的细胞、组织、切片或其它生物样品上，压上一张X光胶片，放射性同位素的电离辐射作用于x光胶片上的乳胶，就像可见光一样产生了一个潜在的图象。因此，经过曝光，射线与乳胶作用产生电子，电子使卤化银还原成金属银，这样，便得到了放射性同位素的分布图。n在细胞水平上，放射自显影可用来确定生物大分子的合成部位，以及随后在细胞内的运动情况。n如：通过掺人H标记的脱氧胸腺嘧啶核甘酸，我们得知细胞核是DNA合成的主要部位。2023-2-12第五章 克隆重组体的构建、转化三、核酸分子杂交检测法1、菌落原位杂交法n直接把菌落或噬菌斑印迹转移到硝酸纤维素滤膜上通过溶
36、菌和变性处理，使DNA暴露出来并与滤膜原位结合n再与特异性DNA或RNA探针杂交，筛选出含有插入序列的菌落或噬菌斑2023-2-12苏州科技学院生物系 叶亚新克隆DNA序列检测菌落噬菌斑原位杂交法菌落原位杂交法的基本操作：影印用硝酸纤维素薄膜影印克隆平板 洗涤杂交感光用0.4N的NaOH溶液浸泡影印薄膜 用SSC溶液浸泡清洗影印薄膜 80烘干固定影印薄膜 薄膜置于含有探针的杂交溶液中保温 用SSC-SDS液洗涤杂交薄膜 用X光胶片覆盖薄膜感光 4 kb两片段，表明两者在标记了放射性同位素的细胞、组织、切片或其它生物样品上，压上一张X光胶片，放射性同位素的电离辐射作用于x光胶片上的乳胶，就像可见
37、光一样产生了一个潜在的图象。杂交的双方是：待测的核酸序列+已知序列的核酸探针。第三节 重组子的筛选coli，能够促进其对噬菌体DNA、质粒DNA的吸收，重复性好，操作简便，适合成批制备感受态细胞第三节 重组子的筛选已有实验条件：仪器，载体种类等薄膜置于含有探针的杂交溶液中保温根据目的基因在受体细胞中的表达产物的性质，筛选含有目的基因的克隆子。各种基因工程受体的特性化学降解测序法的基本原理：苏州科技学院生物系 叶亚新苏州科技学院生物系 叶亚新1 mg 载体DNA细胞膜的基本成分是磷脂双分子层，在适当的外加电压作用下，细胞膜有可能被击穿，但不会导致细胞致命的伤害，当移去外加电压后被击穿的膜孔可自行
38、修复。利用显微注射仪，通过机械方法把外源DNA直接注入细胞质或细胞核的基因转化方法。第五章 克隆重组体的构建、转化各种基因工程受体的特性80烘干固定影印薄膜载体DNA分子上通常携带有一定的选择性遗传标记基因，转化或转染宿主细胞后可以使后者呈现出特殊的表型或遗传学特征，据此可进行转化子或重组子的初步筛选。2023-2-12第五章 克隆重组体的构建、转化三、核酸分子杂交检测法2、Southern blottingn根据毛细管作用原理，使在电泳凝胶中分离的DNA片段转移并结合在适当的滤膜上，然后通过与已标记的单链DNA或RNA探针的杂交作用，以检测这些被转移的DNA片段。n是针对DNA分子进行的印迹
39、杂交技术。2023-2-123、Northern blottingn是指将RNA分子变性及电泳分离后，从电泳凝胶转移到固相支持物上进行核酸杂交的方法。n是针对RNA分子进行的印迹杂交技术。n注意的两个问题：n防止单链RNA形成高级结构，必须采用变性凝胶电泳n电泳过程中始终要防止Rnase的作用，防止RNA分子的降解4 4、Dot blottingDot blotting（斑点印迹杂交）或（斑点印迹杂交）或 Slot blotting Slot blotting（狭线印迹杂交）（狭线印迹杂交）2023-2-12第五章 克隆重组体的构建、转化三、核酸分子杂交检测法5、核酸探针n探针标记n放射性标记
40、 32P 3H 35Sn非放射性标记 生物素（biotin）n探针标记方法n切口平移标记法切口平移标记法n随机引物标记法随机引物标记法n末端标记法末端标记法2023-2-12第五章 克隆重组体的构建、转化三、核酸分子杂交检测法5、核酸探针n核酸探针的种类n同源或部分同源探针n是指与目的基因的部分序列完全互补的核酸探针，主要用于从 cDNA或基因组DNA文库中筛选含有目的序列的克隆子。ncDNA探针n如果拥有目的基因的mRNA，则可通过逆转录酶将其反转录成单链cDNA，以cDNA为探针无论在长度还是在同源性上都较为理想。n人工合成的寡核苷酸探针n根据目的蛋白的一段已知氨基酸序列推导合成的，简并性
41、和稳定性。2023-2-12苏州科技学院生物系 叶亚新克隆克隆DNA序列检测序列检测八、八、DNA序列分析法序列分析法化学降解测序法的基本原理：化学降解测序法的基本原理：将待测DNA分子进行末端放射性标记然后置于4组独立的化学反应体系中 分别进行部分降解其中每一组反应特异性地针对某一碱基或某一类碱基。通过化学降解一段时间后在每一组反应体系中生成各种不同长度的、一 端为放射性标记固定的寡聚核昔酸分子，经聚丙烯酰胺凝胶电泳和放射自显 影检测后可以读出待测DNA分子的碱基序列G反应G+A反应T+C反应C反应2023-2-12苏州科技学院生物系 叶亚新克隆克隆DNA序列检测序列检测八、八、DNA序列分
42、析法序列分析法双脱氧末端终止测序法的基本原理：双脱氧末端终止测序法的基本原理：DNA序列测定是精确鉴定目的基因的重要手段，目前国际上流行采用Sanger发明的双脱氧末端终止法测定DNA序列，其工作原理是在DNA聚合反应的进程中，通过位点特异性终止测定DNA序列其关键技术有：DNA链聚合反应时的定点随机中断（ddNTP）聚丙烯酰胺凝胶电泳的高分辨率（600 bp/601 bp）电脑自动检测、记录、编辑程序用于DNA测序的专一性试剂盒（Kit）2023-2-122023-2-12苏州科技学院生物系 叶亚新克隆克隆DNA序列检测序列检测八、DNA序列分析法双脱氧末端终止测序法的基本操作：A C G
43、T ssDNA ssDNA ssDNA ssDNA Primer Primer Primer Primer KlenowKlenowKlenowKlenowdNTPsdNTPsdNTPsdNTPsddATPddCTPddGTPddTTPA G T C DNA聚合反应聚丙烯酰胺凝胶电泳2023-2-12苏州科技学院生物系 叶亚新克隆克隆DNA序列检测序列检测八、八、DNA序列分析法序列分析法双脱氧末端终止测序法的基本反应：双脱氧末端终止测序法的基本反应：KlenowOH 35 PTdNTP+ddATP TTTTTOH 35 PA G T C GGCATTGCGTTACTAGTCCAGTACA4N
44、的NaOH溶液浸泡影印薄膜不同细菌的原生质体制备方法不尽相同，以链霉菌为例：细菌需生长在高渗培养基中（如34%的蔗糖溶液，并加入甘氨酸以增加细菌细胞壁对溶菌酶的敏感性。农杆菌介导的Ti质粒载体转化法苏州科技学院生物系 叶亚新苏州科技学院生物系 叶亚新各种基因工程受体的特性各种基因工程受体的特性根据目的基因在受体细胞中的表达产物的性质，筛选含有目的基因的克隆子。用BamHI酶切转化子质粒DNA农杆菌介导的Ti质粒载体转化法第三节 重组子的筛选区分目的重组子与非目的重组子对质粒载体而言，插入片段越大，转化效率越低用EcoRI酶切转化子质粒DNAcoli，能够促进其对噬菌体DNA、质粒DNA的吸收，重复性好，操作简便，适合成批制备感受态细胞如果外源DNA片段插在pUC18的SphI位点处，原则上也可用SphI酶解鉴定，但这样做很不经济，因为SphI非常昂贵（每100单位50美元）。苏州科技学院生物系 叶亚新但这种方法在用于数千规模的转化子筛选时，工作量极大，实验成本也高。不同的载体转化同一株受体细胞，其转化率不同8 kb两片段，表明两者是连在一起的；显微注射法（microinjection）n非放射性标记检测物的使用nDNA测序自动化n计算机在DNA测序中的应用n现有技术的改进n基因芯片
