1、2023-2-121基因操作基因操作第十八章第十八章2 2023-2-12第一节第一节 基因的克隆与表达基因的克隆与表达第二节第二节 基因结构分析基因结构分析第三节第三节 基因及基因表达的定量及定性分析基因及基因表达的定量及定性分析第五节第五节 基因功能研究常用手段基因功能研究常用手段第四节第四节 疾病相关基因的克隆与研究策略疾病相关基因的克隆与研究策略3 2023-2-12基因操作技术的基本原理和步骤基因操作技术的基本原理和步骤化学合成化学合成酶切片段酶切片段RT-PCR文库筛选文库筛选目的基因目的基因载体载体原核、真核原核、真核克隆、表达克隆、表达重组重组DNA载体载体原核细胞原核细胞真核
2、细胞真核细胞表达生物活性表达生物活性蛋白蛋白构建基因文库构建基因文库序列分析序列分析体外基因突体外基因突变变瞬时表达瞬时表达定位、功能定位、功能稳定表达细胞系稳定表达细胞系遗传修饰动物遗传修饰动物表达产物功表达产物功能研究能研究生产活性蛋生产活性蛋白白转化转化 转染转染 连接连接4 2023-2-12基因工程常用的工具酶基因工程常用的工具酶酶的种类酶的种类功功 能能限制性核酸内切酶限制性核酸内切酶识别特异序列，切割识别特异序列，切割DNADNA连接酶连接酶催化催化DNA中相邻的中相邻的5磷酸基和磷酸基和3羟基末端之间形成磷酸二酯键，羟基末端之间形成磷酸二酯键，使使DNA切口封合或使两个切口封合
3、或使两个DNA分子或片段连接分子或片段连接DNA聚合酶聚合酶 I合成双链合成双链cDNA的第二条键的第二条键缺口平移制作高比活探针缺口平移制作高比活探针DNA序列分析序列分析填补填补3末端末端反转录酶反转录酶以以RNA为模板合成为模板合成cDNA第一链第一链多聚核苷酸激酶多聚核苷酸激酶 催化多聚核苷酸催化多聚核苷酸5羟基末端磷酸化，或标记探针羟基末端磷酸化，或标记探针末端转移酶末端转移酶 在在3羟基末端进行同质多聚物加尾羟基末端进行同质多聚物加尾切除末端磷酸基切除末端磷酸基碱性磷酸酶碱性磷酸酶5 2023-2-12 识别识别DNA的特异序列，并在识别位点或其周围切割双链的特异序列，并在识别位点
4、或其周围切割双链DNA的一的一类内切酶，与相伴的甲基化酶共同构成细菌防御机制类内切酶，与相伴的甲基化酶共同构成细菌防御机制限制修饰体系限制修饰体系（限制外源（限制外源DNA，保护自身，保护自身DNA）Hin d 流感噬血杆菌种属流感噬血杆菌种属 d 株株 第三种内切酶第三种内切酶限制性核酸内切酶命名：限制性核酸内切酶命名：属名、种名、株名属名、种名、株名限制性核酸内切酶（限制性核酸内切酶（restriction endonuclease）6 2023-2-12切割切割DNA后有后有粘端与平端粘端与平端之分或产之分或产生生匹配末端匹配末端识别位点常为回文结构识别位点常为回文结构 AATGAATT
5、CGTACCG TTACTTAAGCATGGC限制性核酸内切酶限制性核酸内切酶5-NGAATTCN-33-NCTTAAGN-55-NG AATTCN-33-NCTTAA GN-5粘粘末末端端(Cohensive end or sticky end）5突出端突出端EcoR15-NCAG CTGN-33-NGTC GACN-55-NCAG CTGN-33-NGTC GACN-5平末端平末端Pvu 2（blunt end）7 2023-2-12Pst I 3609Pvu I 3735Sca I 3846EcoR I 4361Hind III 29EcoR V 185BamH I 375Sph I 5
6、62Sar I 651BstZ I 939Sty I 1369Pvu II 2066oriTetAmprpBR322(4363bp)克隆用载体举例克隆用载体举例rPst I Sal IXba I Hind III BamH ISma I Sph IoriAmprLacZPlacKpn I Sac I EcoR IpUC182686bppUC oriAmprSac I*Bgl IIPvu II BamH I Kpn INco I Xho IEcoR I BstB I Hind IIIpRSET(A,B,C)2.9kbF1 oriPT7RBS ATG 6xHis XpressTM Epitope
7、EK MCSStop带有带有6个组氨酸标签的原核细胞融合蛋白表达载体举例个组氨酸标签的原核细胞融合蛋白表达载体举例pcDNA3.1-E2360bpPCMVBGH pAF1 oriSV40 oripUC oriSV40 pANeoAmprT7loxHPme I哺乳动物细胞表达载体举例哺乳动物细胞表达载体举例克隆用载体举例克隆用载体举例常用基因工程载体举例常用基因工程载体举例2023-2-128一、基本概念一、基本概念二、基因的获取和克隆二、基因的获取和克隆三、克隆基因的表达三、克隆基因的表达第一节第一节 基因的克隆与表达基因的克隆与表达2023-2-129一、基本概念一、基本概念基因工程基因工程
8、（genetic engineering）特定基因（被称为目的基因或外源特定基因（被称为目的基因或外源DNA片段）的制备、分离、片段）的制备、分离、鉴定、改造及其在不同生物间的转移等多项技术鉴定、改造及其在不同生物间的转移等多项技术 指所有涉及到指所有涉及到DNA或者或者RNA操作的技术，或者指所有基操作的技术，或者指所有基因工程和基因工程相关技术因工程和基因工程相关技术基因操作基因操作（gene manipulating）102023-2-12 指把一个生物体中的基因通过无性繁殖转入另一个生物体内指把一个生物体中的基因通过无性繁殖转入另一个生物体内的过程。通过基因克隆可以得到一群完全相同的基
9、因片段，由于的过程。通过基因克隆可以得到一群完全相同的基因片段，由于基因就是基因就是DNA分子，所以也称其为分子，所以也称其为DNA克隆克隆 克隆克隆（clone）基因克隆基因克隆（gene cloning）是指通过无性繁殖过程所产生的与亲代完全相同的子代群体是指通过无性繁殖过程所产生的与亲代完全相同的子代群体112023-2-12基因重组基因重组（gene recombination）是将不同基因片段连接起来构成一个新的是将不同基因片段连接起来构成一个新的DNA分子分子 的过程的过程自然界不同生物之间的基因重组是经常发生的自然界不同生物之间的基因重组是经常发生的人们受到启发在人们受到启发在2
10、0世纪世纪70年代发展建立了体外基因重组技术年代发展建立了体外基因重组技术,可以人为的改变生物的遗传信息可以人为的改变生物的遗传信息胰岛素、生长激素、干扰素、细胞因子及多种单克隆抗体等基因工程药物已胰岛素、生长激素、干扰素、细胞因子及多种单克隆抗体等基因工程药物已上市上市抗病、抗虫、品质改良的新品种种植面积大量增加，转基因大豆、玉米、棉抗病、抗虫、品质改良的新品种种植面积大量增加，转基因大豆、玉米、棉花和油菜的种植面积增加花和油菜的种植面积增加 122023-2-12二、基因的获取和克隆二、基因的获取和克隆（一）目的基因的获得（一）目的基因的获得1.用用PCR技术获取基因技术获取基因2.用用R
11、T-PCR（逆转录（逆转录-PCR）获得基因）获得基因3.从基因组文库或从基因组文库或cDNA文库中获取基因文库中获取基因4人工合成基因人工合成基因132023-2-12是根据是根据DNA半保留复制和半保留复制和DNA聚合酶的特性建立起来的体外复制聚合酶的特性建立起来的体外复制扩增扩增DNA片段的技术片段的技术1.用用PCR技术获取基因技术获取基因（聚合酶链式反应聚合酶链式反应,polymerase chain reaction）Kary B.Mulis 1985年发明年发明,获获1993年诺贝尔化学奖年诺贝尔化学奖可将微量的目的可将微量的目的DNA在体外扩增在体外扩增100万倍以上万倍以上P
12、CR技术技术142023-2-12 由一对分别与由一对分别与5端和端和3端相互补的寡核苷酸片段为引物，在端相互补的寡核苷酸片段为引物，在DNA聚合酶的作用聚合酶的作用下，合成复制模板下，合成复制模板DNA，使目的，使目的DNA得到扩增得到扩增PCR技术原理技术原理5 引物引物A5 引物引物B第二次循环第二次循环第一次循环第一次循环5 5 5 5 5 5 模板模板DNA5 5 5 5 5 5 5 5 第二次循环第二次循环第一次循环第一次循环（接下页）（接下页）152023-2-122530 次循环后，模板次循环后，模板DNA的含量可以扩大的含量可以扩大100万倍以上万倍以上5 5 5 5 5 5
13、 5 5 5 5 5 5 5 5 5 5 5 5 5 5 5 5 5 5 5 5 5 5 5 5 5 5 第三次循环第三次循环多次循环多次循环162023-2-12PCR反应系统组分反应系统组分模板模板DNA（高温变性）（高温变性）Taq DNA聚合酶（耐高温）聚合酶（耐高温）dNTP（底物）（底物）引物（引物（DNA，人工合成），人工合成）Mg2用PCR技术获取基因基因定向突变（site-directed mutagenesis）是进行基因改造最常用的技术。5-NG AATTCN-3C 延伸，DNA聚合酶在 72 催化DNA的合成指人工建立的利用体外合成或在细胞内表达的短双链RNA（21-2
14、3 nt）抑制细胞内特定基因表达的技术定量或半定量分析基因时需设内参照能在宿主细胞内携带目的基因复制扩增真核细胞：酵母、昆虫、哺乳动物细胞C 延伸，DNA聚合酶在 72 催化DNA的合成Sanger法测定DNA序列荧光显微镜观察Taq DNA聚合酶（耐高温）长度:15-30 mer（mer:核苷酸数）以mRNA为模板，先进行逆转录得到cDNA（complementary DNA，cDNA），再进行的PCR反应转基因被导入的目的基因关键技术 RNA样品的制备和电泳分离3-NCTTAAGN-5表达产物不仅仅含有目的蛋白，还带有一段融合的其他的标签序列用于检测和纯化。表达系统简单，容易操作17202
15、3-2-12模板模板DNA DNA、RNA都可作模板都可作模板,如果是如果是RNA，可以先反转录成，可以先反转录成cDNA再作再作模板模板。模板模板DNA用量为用量为102-105拷贝拷贝,1ug人基因组人基因组DNA=3x105单拷贝单拷贝182023-2-12长度长度:15-30 mer（mer:核苷酸数）核苷酸数）(G+C)含量含量:40-60%,根据其含量计算退火温度根据其含量计算退火温度 Tm=4(G+C)+2(A+T)引物序列引物序列:一对引物之间不能有互补序列一对引物之间不能有互补序列引物的引物的3端端:必须严格互补必须严格互补引物的引物的5端端:可以不严格可以不严格,可以加酶可
16、以加酶,加标记物加标记物,引入突变引入突变 位点等位点等引物的浓度引物的浓度:0.2-1umol/L特异性引物特异性引物192023-2-12 PCR的早期的早期,用大肠杆菌用大肠杆菌DNA聚合酶聚合酶I的的Kleenow片段，此酶不能片段，此酶不能耐受高温耐受高温(93-95)，因此要不断添加酶，因此要不断添加酶 耐热耐热Taq酶来自水生栖热菌酶来自水生栖热菌(Thermus aquaticus),在在72可以可以60核苷酸核苷酸/S的速度延伸的速度延伸DNA链。其半衰期链。其半衰期:92 2hr;95 40min;97 5minDNA聚合酶聚合酶202023-2-12A 变性变性 95，D
17、NA模板变性成为单链，引物自身和引物间局部双链消除模板变性成为单链，引物自身和引物间局部双链消除B 退火，退火，Tm值减值减-25，使引物与模板，使引物与模板DNA结合互补成双链结合互补成双链C 延伸，延伸，DNA聚合酶在聚合酶在 72 催化催化DNA的合成的合成 PCR 的基本反应步骤的基本反应步骤变性变性95 延伸延伸72 退火退火Tm-5PCR仪25-30个循环212023-2-12PCR的基本原理和操作程序的基本原理和操作程序222023-2-122.用用RT-PCR（逆转录（逆转录-PCR）获得基因）获得基因 以以mRNA为模板，先进行逆转录得到为模板，先进行逆转录得到cDNA（co
18、mplementary DNA，cDNA），再进行的），再进行的PCR反应反应模板为模板为mRNA需逆转录酶需逆转录酶产物为产物为cDNART-PCR与与PCR区别区别232023-2-12RT-PCR的基本原理和操作程序的基本原理和操作程序242023-2-12基因的体外突变基因的体外突变DNA和和RNA的微量分析的微量分析DNA序列测定序列测定基因突变分析基因突变分析PCR的其他用途的其他用途252023-2-123.从基因组文库或从基因组文库或cDNA文库中获取基因文库中获取基因基因组文库基因组文库（genomic DNA library）含有某种生物体全部基因片段的重组含有某种生物体全
19、部基因片段的重组DNA克隆群体克隆群体cDNA文库（文库（cDNA library）含有某一组织细胞中的全部含有某一组织细胞中的全部mRNA信息信息 基因文库基因文库gene library262023-2-12文库构建文库构建提取染色体提取染色体DNADNA片段片段插入适当的克隆载体插入适当的克隆载体转入受体菌扩增转入受体菌扩增基因组文库基因组文库基因组文库的构建基因组文库的构建机械法或限制性内机械法或限制性内切酶切割切酶切割带有6个组氨酸标签的原核细胞融合蛋白表达载体举例 经过聚丙烯酰胺凝胶电泳分离由一对分别与5端和3端相互补的寡核苷酸片段为引物，在DNA聚合酶的作用下，合成复制模板DNA
20、，使目的DNA得到扩增表达产物不仅仅含有目的蛋白，还带有一段融合的其他的标签序列用于检测和纯化。用PCR技术获取基因小干扰RNA形成机理RNA酶保护试验（RNase protection assay，RPA）（聚合酶链式反应,polymerase chain reaction）nucleic acid probe含有某种生物体全部基因片段的重组DNA克隆群体原位杂交和荧光原位杂交（FISH）缺口平移制作高比活探针指人工建立的利用体外合成或在细胞内表达的短双链RNA（21-23 nt）抑制细胞内特定基因表达的技术原核细胞RNA聚合酶可以识别的启动子从数据库中检索该标志附近与该区域之中所有已 知的
21、基因（连锁分析或染色体分析）The Establishment and Application of heredity-modified Animal Model选出异常表达的结构基因已知蛋白质功能和序列nucleic acid probe自然界不同生物之间的基因重组是经常发生的272023-2-12细胞总细胞总mRNA 反转录酶反转录酶 cDNA 插入合适载体插入合适载体转入受体菌转入受体菌 cDNA文库文库cDNA文库的构建文库的构建282023-2-12基因文库构建示意图基因文库构建示意图292023-2-124人工合成基因人工合成基因 已知目的基因的碱基序列可用已知目的基因的碱基序列可
22、用DNA合成仪合成基因片段，合成仪合成基因片段，然后用其他反应将基因片段连接起来然后用其他反应将基因片段连接起来优点优点可修饰基因可修饰基因 可在基因两端设计接头可在基因两端设计接头可选择各种宿主生物偏爱的密码子可选择各种宿主生物偏爱的密码子302023-2-12用用PCR技术人工合成的技术人工合成的DNA片段片段312023-2-12（二）（二）目的基因克隆目的基因克隆 1.克隆载体克隆载体（vector）携带目的基因进入宿主细胞的携带目的基因进入宿主细胞的DNA分子分子最常用的是被称为质粒的环状双链最常用的是被称为质粒的环状双链DNA分子分子能在宿主细胞内携带目的基因复制扩增能在宿主细胞内
23、携带目的基因复制扩增 有限制性内切酶位点有限制性内切酶位点 有筛选标志，如抗药基因有筛选标志，如抗药基因具有单一的酶切位点作为克隆或多克隆位点具有单一的酶切位点作为克隆或多克隆位点质粒质粒载体的特点载体的特点322023-2-12Hind3Sph1Pst1Bamh1Smal1EcoR1Multiple Cloning Site，MSC 多克隆位点多克隆位点载体的分类载体的分类1.按功能按功能-克隆载体、表达载体克隆载体、表达载体2.按受体细胞按受体细胞-原核、真核原核、真核3.按来源按来源-质粒、噬菌体、病毒质粒、噬菌体、病毒PUC 182686 bpAmpRLacZOri质粒质粒载体的基本结
24、构载体的基本结构332023-2-12表达质粒表达质粒载体载体pET的结构的结构342023-2-12目的基因克隆的基本过程目的基因克隆的基本过程352023-2-12（三）目的基因的改造（三）目的基因的改造 基因定向突变（基因定向突变（site-directed mutagenesis）是进行基因改造最）是进行基因改造最常用的技术。最常用方法是以双链常用的技术。最常用方法是以双链DNA为模板，经加热变性后，与含为模板，经加热变性后，与含突变碱基的引物退火，利用突变碱基的引物退火，利用PCR方法改变特定碱基方法改变特定碱基，从而将突变碱基，从而将突变碱基引入引入DNA序列中序列中362023-
25、2-12PCR法（法（4 引物法）引物法）设计引物设计引物分段分段PCR识别DNA的特异序列，并在识别位点或其周围切割双链DNA的一类内切酶，与相伴的甲基化酶共同构成细菌防御机制限制修饰体系（限制外源DNA，保护自身DNA）利用RNase A和RNase T1能专一性降解单链RNA而双链RNA受到保护的特性，分析受到保护的RNA片段的大小，估计待检测mRNA的情况表达系统简单，容易操作目的基因克隆的基本过程指所有涉及到DNA或者RNA操作的技术，或者指所有基因工程和基因工程相关技术表达系统简单，容易操作特定基因（被称为目的基因或外源DNA片段）的制备、分离、鉴定、改造及其在不同生物间的转移等多
26、项技术A 变性 95，DNA模板变性成为单链，引物自身和引物间局部双链消除发展基于RNAi原理的药物。合成双链cDNA的第二条键是一种直接进行基因定位的方法。优点：可进行自动化定量分析、降低假阳性指所有涉及到DNA或者RNA操作的技术，或者指所有基因工程和基因工程相关技术其半衰期:92 2hr;95 40min;97 5min含有某种生物体全部基因片段的重组DNA克隆群体5-NGAATTCN-3研究或发现基因的新功能用途：鉴定RNA片段非放射性荧光标记的DNA探针372023-2-12再次再次PCR获得突变基因获得突变基因382023-2-12二、克隆基因的表达二、克隆基因的表达原核细胞：大肠
27、杆菌原核细胞：大肠杆菌真核细胞：酵母、昆虫、哺乳动物细胞真核细胞：酵母、昆虫、哺乳动物细胞1.常用表达系统常用表达系统392023-2-122.原核细胞表达载体原核细胞表达载体pBV220、pET等等,多种载体有商品化供应多种载体有商品化供应原核细胞原核细胞RNA聚合酶可以识别的启动子聚合酶可以识别的启动子原核细胞转录终止子原核细胞转录终止子原核细胞核糖体结合位点原核细胞核糖体结合位点 其他调控序列其他调控序列结构特点结构特点克隆基因在原核生物中表达的必要条件是携带克隆基因的载体具备原核克隆基因在原核生物中表达的必要条件是携带克隆基因的载体具备原核生物中所需要的以下表达调控序列生物中所需要的以
28、下表达调控序列:402023-2-12表达质粒表达质粒载体载体pET的结构的结构412023-2-12蛋白表达方式蛋白表达方式表达产物不仅仅含有目的蛋白，还带有一段融表达产物不仅仅含有目的蛋白，还带有一段融合的其他的标签序列用于检测和纯化。最后应合的其他的标签序列用于检测和纯化。最后应用时，可能需要切除标签部分用时，可能需要切除标签部分非融合表达非融合表达表达产物直接是单一目的蛋白表达产物直接是单一目的蛋白融合表达融合表达422023-2-12原核细胞表达系统的优缺点原核细胞表达系统的优缺点优点优点 表达系统简单，容易操作表达系统简单，容易操作 成本低，易于大量生产成本低，易于大量生产 生长周
29、期短生长周期短缺点缺点 需要翻译后修饰的蛋白不能用此表达系统需要翻译后修饰的蛋白不能用此表达系统432023-2-123.真核表达载体真核表达载体 主要包括质粒载体和病毒载体，使用的调控表达主要包括质粒载体和病毒载体，使用的调控表达元件最初多来源于病毒元件最初多来源于病毒442023-2-12真核细胞表达系统的优缺点真核细胞表达系统的优缺点表达系统相对复杂表达系统相对复杂成本高成本高生长周期长生长周期长优点优点可表达需要翻译后修饰的蛋白表达系统简单可表达需要翻译后修饰的蛋白表达系统简单缺点缺点452023-2-12第二节第二节 基因结构分析基因结构分析462023-2-12一、一、DNA测序测
30、序1.Sanger法（双脱氧末端终止法）法（双脱氧末端终止法）用用4种种2,3 双脱氧核苷酸（双脱氧核苷酸（ddNTP）代替部分脱氧核苷）代替部分脱氧核苷酸（酸（dNTP）作为底物进行）作为底物进行DNA合成反应，从而获得在不同部合成反应，从而获得在不同部位终止反应的大小不同的位终止反应的大小不同的DNA链，经高分辨率变性聚丙烯凝胶链，经高分辨率变性聚丙烯凝胶电泳分离，就可以对电泳分离，就可以对DNA序列进行分析序列进行分析已知目的基因的碱基序列可用DNA合成仪合成基因片段，然后用其他反应将基因片段连接起来含有某种生物体全部基因片段的重组DNA克隆群体转基因被导入的目的基因原位杂交和荧光原位杂
31、交（FISH）利用RNase A和RNase T1能专一性降解单链RNA而双链RNA受到保护的特性，分析受到保护的RNA片段的大小，估计待检测mRNA的情况定量或半定量分析基因时需设内参照二、DNA一级结构的简单分析指人工建立的利用体外合成或在细胞内表达的短双链RNA（21-23 nt）抑制细胞内特定基因表达的技术将待剔除的基因作为目的基因克隆到载体第五节 基因功能研究常用手段TTACTTAAGCATGGC限制性核酸内切酶命名：属名、种名、株名 限制性片段长度多态性分析（RFLP）由一对分别与5端和3端相互补的寡核苷酸片段为引物，在DNA聚合酶的作用下，合成复制模板DNA，使目的DNA得到扩增
32、长度:15-30 mer（mer:核苷酸数）含有某一组织细胞中的全部mRNA信息Pvu II 2066特定基因（被称为目的基因或外源DNA片段）的制备、分离、鉴定、改造及其在不同生物间的转移等多项技术非放射性荧光标记的DNA探针472023-2-12Sanger法测定法测定DNA序列序列482023-2-122.DNA自动化测序自动化测序方法要点方法要点492023-2-12DNA自动测序结果举例自动测序结果举例502023-2-12二、二、DNA一级结构的简单分析一级结构的简单分析主要方法主要方法 限制性片段长度多态性分析（限制性片段长度多态性分析（RFLP）PCR-限制性片段长度多态性（限
33、制性片段长度多态性（PCR-RFLP）单链构象多态性分析（单链构象多态性分析（SSCP）512023-2-12 粗略分析未知粗略分析未知DNA片段片段 分析过长的分析过长的DNA片段片段 大量筛选大量筛选DNA样本样本主要用途主要用途522023-2-12第三节第三节 基因及基因表达的定量及定性分析基因及基因表达的定量及定性分析一、一、DNA的定性和定量分析的定性和定量分析二、二、RNA的定性和定量分析的定性和定量分析532023-2-12一、一、DNA的定性和定量分析的定性和定量分析1.Southern印迹（印迹（Southern blot）2.基因组基因组PCR反应反应3.荧光原位杂交荧光
34、原位杂交542023-2-12原理原理:核酸分子杂交的碱基互补配对核酸分子杂交的碱基互补配对用途用途:鉴定鉴定DNA片段片段步骤步骤:DNA分离分离DNA变性变性转膜转膜 杂交杂交洗洗 膜膜放射自显影放射自显影关键技术关键技术:核酸探针标记和核酸探针标记和DNA的转移。的转移。1.Southern印迹（印迹（Southern blot），），DNA印迹印迹 552023-2-12 在在DNA复性过程中，如果把不同复性过程中，如果把不同DNA单链分子放在同一溶单链分子放在同一溶液中，或把液中，或把DNA与与RNA放在一起，只要在放在一起，只要在DNA或或RNA的单链分的单链分子之间有一定的子之间
35、有一定的碱基配对碱基配对关系，就可以在不同的分子之间形成关系，就可以在不同的分子之间形成杂杂化双链化双链(heteroduplex)核酸分子杂交核酸分子杂交(nucleic acid hybridization)562023-2-12核酸探针的标记核酸探针的标记计算出模板DNA或mRNA的含量细胞内异常双链RNA激活Dicer 短双链RNA（2123 nt）RNA诱导的沉默复合物两个可互补的单链RNA与靶RNA互补结合切割靶RNA小干扰RNAPCR 的基本反应步骤表达系统简单，容易操作带有6个组氨酸标签的原核细胞融合蛋白表达载体举例遗传修饰动物模型的建立及应用成本低，易于大量生产基因组文库（g
36、enomic DNA library）基因工程（genetic engineering）DNA和RNA的微量分析最后应用时，可能需要切除标签部分二、DNA一级结构的简单分析基因定向突变（site-directed mutagenesis）是进行基因改造最常用的技术。限制性片段长度多态性分析（RFLP）Sanger法测定DNA序列细胞内异常双链RNA激活Dicer 短双链RNA（2123 nt）RNA诱导的沉默复合物两个可互补的单链RNA与靶RNA互补结合切割靶RNA小干扰RNA模板行PCR扩增电泳检测基因的表达量指所有涉及到DNA或者RNA操作的技术，或者指所有基因工程和基因工程相关技术计算出
37、模板DNA或mRNA的含量可选择各种宿主生物偏爱的密码子572023-2-12探针种类探针种类 cDNA探针探针 基因组基因组DNA探针探针 寡核苷酸探针和寡核苷酸探针和RNA探针探针探针标记方法探针标记方法 化学法化学法 酶促法酶促法核酸探针的标记核酸探针的标记582023-2-12 酶切与电泳酶切与电泳 杂交与放射自显影杂交与放射自显影 DNA片段转移至硝基纤维素膜片段转移至硝基纤维素膜Southern印迹操作步骤印迹操作步骤592023-2-12Southern印迹技术的用途印迹技术的用途基因定位分析基因定位分析基因酶切图谱分析基因酶切图谱分析基因突变分析基因突变分析基因重排基因重排60
38、2023-2-122.基因组基因组PCR反应反应用途用途 定性分析特定基因在基因组中存在与否定性分析特定基因在基因组中存在与否 定量或半定量分析定量或半定量分析优点优点 灵敏度高灵敏度高缺点缺点 容易出现假阳性容易出现假阳性 定量或半定量分析基因时需设内参照定量或半定量分析基因时需设内参照 612023-2-123.荧光原位杂交荧光原位杂交 优点优点 非放射性荧光标记的非放射性荧光标记的DNA探针探针 探针特异性高探针特异性高,灵敏度好灵敏度好 荧光显微镜观察荧光显微镜观察 成本低成本低 一次可检测多个基因一次可检测多个基因 是一种利用非放射性的荧光信号对原位杂交样本进行检是一种利用非放射性的
39、荧光信号对原位杂交样本进行检测的技术测的技术622023-2-12二、二、RNA的定性与定量的定性与定量1.Northern印迹印迹2.RT-PCR3.实时实时PCR4.RNA酶保护试验酶保护试验5.芯片技术芯片技术632023-2-12原理：原理：与与Southern印迹相同印迹相同用途：用途：鉴定鉴定RNA片段片段步骤步骤 与与Southern类似类似关键技术关键技术 RNA样品的制备和电泳分离样品的制备和电泳分离 1.Northern印迹，印迹，RNA印迹印迹 642023-2-12三种印迹技术的比较三种印迹技术的比较652023-2-122.RT-PCR 用途：用途：定量检测基因的表达
40、情况定量检测基因的表达情况步骤：步骤：提取总提取总RNA逆转录成逆转录成cDNA以以cDNA为为 模板行模板行PCR扩增扩增电泳电泳检测基因的表达量检测基因的表达量关键点：关键点：提取的总提取的总RNA的质量的质量662023-2-123.实时实时PCR（real time RT-PCR）原理：原理：根据荧光染料形成特异性荧光信号的强度，根据荧光染料形成特异性荧光信号的强度，计算出模板计算出模板DNA或或mRNA的含量的含量 用途：用途：定量分析定量分析mRNA或或DNA优点：优点：可进行自动化定量分析、降低假阳性可进行自动化定量分析、降低假阳性672023-2-12实时实时PCR的基本原理的
41、基本原理682023-2-12实时实时PCR的基本过程的基本过程692023-2-124.RNA酶保护试验酶保护试验（RNase protection assay，RPA）原理原理 利用利用RNase A和和RNase T1能专一性降解单链能专一性降解单链RNA而双链而双链RNA受受到保护的特性，分析受到保护的到保护的特性，分析受到保护的RNA片段的大小，估计待检测片段的大小，估计待检测mRNA的情况的情况用途用途 mRNA定量定量mRNA末端定位末端定位mRNA剪切部位剪切部位内含子位置的确定内含子位置的确定702023-2-125.芯片技术芯片技术类别类别 基因组芯片基因组芯片 表达芯片（
42、表达芯片（cDNA芯片）芯片）测序芯片测序芯片 用途用途 表达芯片表达芯片 定量分析定量分析 RNA 测序芯片测序芯片 712023-2-12基因芯片使用流程基因芯片使用流程722023-2-12第四节第四节 疾病相关基因的克隆与研究策略疾病相关基因的克隆与研究策略一、定位克隆策略一、定位克隆策略 二、功能克隆策略二、功能克隆策略三、表型克隆策略三、表型克隆策略732023-2-12一、定位克隆策略一、定位克隆策略 表现型表现型(包括疾病包括疾病)对应的基因组区域对应的基因组区域 建立结构基因表达的转录图建立结构基因表达的转录图 选出异常表达的结构基因选出异常表达的结构基因 确定这些基因与疾病
43、的关系确定这些基因与疾病的关系742023-2-12定位候选克隆定位候选克隆 大量定位克隆的基因序列已知（大量定位克隆的基因序列已知（HGP的完成）的完成）从数据库中检索该标志附近与该区域之中所有已从数据库中检索该标志附近与该区域之中所有已 知的基因（连锁分析或染色体分析）知的基因（连锁分析或染色体分析）用已知基因进行致病改变的筛选用已知基因进行致病改变的筛选.HGP：人类基因组计划：人类基因组计划752023-2-12基因定位的基本方法基因定位的基本方法体细胞杂交法体细胞杂交法 将来源不同将来源不同(人与鼠人与鼠)的两种细胞融合成的两种细胞融合成1 1个新细胞。在融个新细胞。在融合过程中人类
44、染色体逐渐丢失，最后只剩条或数条，即可定位合过程中人类染色体逐渐丢失，最后只剩条或数条，即可定位基因基因762023-2-12原位杂交和荧光原位杂交（原位杂交和荧光原位杂交（FISH）是一种直接进行基因定位的方法。例如用此法已经将人是一种直接进行基因定位的方法。例如用此法已经将人及及珠蛋白基因分别定位于第珠蛋白基因分别定位于第16号和第号和第11号染色体上号染色体上识别特异序列，切割DNA真核细胞：酵母、昆虫、哺乳动物细胞基因剔除小鼠建立流程示意图以mRNA为模板，先进行逆转录得到cDNA（complementary DNA，cDNA），再进行的PCR反应基因组DNA探针研究或发现基因的新功能
45、3-NGTC GACN-5最常用的是被称为质粒的环状双链DNA分子DNA自动测序结果举例按受体细胞-原核、真核含有某一组织细胞中的全部mRNA信息带有6个组氨酸标签的原核细胞融合蛋白表达载体举例二、DNA一级结构的简单分析定性分析特定基因在基因组中存在与否（聚合酶链式反应,polymerase chain reaction）长度:15-30 mer（mer:核苷酸数）外源基因通过转基因过程插入到细胞的染色体中，使其在细胞中稳定表达，成为可以表达该外源基因的特定细胞株二、DNA一级结构的简单分析应用被定位的基因与同一染色体上另一基因或遗传标记相连锁的特点进行定位位点等772023-2-12连锁分
46、析连锁分析 应用被定位的基因与同一染色体上另一基因或遗传标记相连锁的特点进行定位应用被定位的基因与同一染色体上另一基因或遗传标记相连锁的特点进行定位782023-2-12定位克隆的基本程序定位克隆的基本程序绘制目的区域的物理图谱绘制目的区域的物理图谱疾病相关基因的确定疾病相关基因的确定792023-2-12二、功能克隆策略二、功能克隆策略 已知蛋白质功能和序列已知蛋白质功能和序列 设计出核酸探针设计出核酸探针 获得相应遗传病的致病基因获得相应遗传病的致病基因 筛选特定的文库筛选特定的文库802023-2-12三、表型克隆策略三、表型克隆策略812023-2-12第五节第五节 基因功能研究常用手
47、段基因功能研究常用手段一、转基因技术一、转基因技术 二、基因剔除技术二、基因剔除技术 三、基因沉默技术三、基因沉默技术822023-2-12遗传修饰动物模型的建立及应用遗传修饰动物模型的建立及应用The Establishment and Application of heredity-modified Animal Model 832023-2-12转基因转基因被导入的目的基因被导入的目的基因转基因动物（转基因动物（transgenic animal）目的基因的受体动物目的基因的受体动物一、转基因技术一、转基因技术 采用基因转移技术使目的基因整合入受精卵细胞或胚胎干细胞，采用基因转移技术使目
48、的基因整合入受精卵细胞或胚胎干细胞，然后将细胞导入动物子宫，使之发育成个体然后将细胞导入动物子宫，使之发育成个体842023-2-12建立转基因动物的基本流程建立转基因动物的基本流程852023-2-12转基因动物的应用转基因动物的应用研究特定基因在组织中特异表达研究特定基因在组织中特异表达研究或发现基因的新功能研究或发现基因的新功能 研究在胚胎期表达的基因结构和功能研究在胚胎期表达的基因结构和功能 建立外源基因表达、调控的动物模型建立外源基因表达、调控的动物模型遗传性疾病的研究遗传性疾病的研究探讨生殖细胞的基因治疗方法探讨生殖细胞的基因治疗方法动物新品种的培育动物新品种的培育 病毒性疾病的研
49、究病毒性疾病的研究基因工程产品的制备基因工程产品的制备862023-2-12细胞水平转基因细胞水平转基因 外源基因通过转基因过程插入到细胞的染色体中，使其在外源基因通过转基因过程插入到细胞的染色体中，使其在细胞中稳定表达，成为可以表达该外源基因的特定细胞株细胞中稳定表达，成为可以表达该外源基因的特定细胞株基本过程基本过程 外源基因片段克隆到真核表达质粒中外源基因片段克隆到真核表达质粒中用重组表达质粒转染哺用重组表达质粒转染哺乳动物细胞乳动物细胞克隆化筛选克隆化筛选转染细胞表达目的蛋白质转染细胞表达目的蛋白质蛋白质的提蛋白质的提取和鉴定取和鉴定基因功能的研究细胞模型基因功能的研究细胞模型获得外源
50、基因产物获得外源基因产物主要用途主要用途872023-2-12二、基因剔除技术二、基因剔除技术 指通过基因同源重组的过程定向地在活细胞中从基因组上移除指通过基因同源重组的过程定向地在活细胞中从基因组上移除特定基因的技术特定基因的技术 基因靶向基因靶向(gene targeting)灭活灭活882023-2-12基因剔除载体的构建基因剔除载体的构建 将待剔除的基因作为目的基因克隆到载体将待剔除的基因作为目的基因克隆到载体 将一阳性筛选标志基因插入到目的基因的中段将一阳性筛选标志基因插入到目的基因的中段 线性化重组载体，将一个阴性筛选标志基因克隆此处线性化重组载体，将一个阴性筛选标志基因克隆此处
