1、1890型PCR荧光分析仪 介绍及应用实时荧光定量PCR的应用 临床方面的应用临床方面的应用 疾病的临床早期诊断疾病的临床早期诊断 建立病原体病分子诊断标准建立病原体病分子诊断标准 疗效考评疗效考评 指导制订感染性疾病合理治疗方案指导制订感染性疾病合理治疗方案 了解感染性疾病病人用药后病情的变了解感染性疾病病人用药后病情的变化情况化情况 医院、血站及防疫站的确诊医院、血站及防疫站的确诊 新药研究中药物的作用效果新药研究中药物的作用效果 研究研究ElisaElisa方法的漏检率方法的漏检率 病毒性疾病中病毒的耐药性变异株的病毒性疾病中病毒的耐药性变异株的测定，为疾病治疗进行指导测定，为疾病治疗进
2、行指导 遗传病诊断中的应用遗传病诊断中的应用 等位基因检测等位基因检测 多基因遗传病的突变检测多基因遗传病的突变检测 基因表达异常所致遗传病检测基因表达异常所致遗传病检测 在肿瘤诊断中的应用在肿瘤诊断中的应用 肿瘤相关基因表达的检测肿瘤相关基因表达的检测 肿瘤标志物（肽类激素和酶）肿瘤标志物（肽类激素和酶）肿瘤耐药基因（肿瘤耐药基因（MDRMDR）何谓PCR?聚合酶链反应聚合酶链反应(Polymerase Chain Reaction)(Polymerase Chain Reaction)简称，是一项在短时间内大量扩增特定简称，是一项在短时间内大量扩增特定的片段的分子生物学技术。的片段的分子生
3、物学技术。试剂的定量原理：TaqmanTaqman水解探针定量水解探针定量RocheRoche杂交探针定量杂交探针定量分子信标定量分子信标定量SYBR Green SYBR Green 染料定量染料定量杂交探针杂交探针分子信标分子信标荧光能量荧光能量共振转移共振转移TaqmanTaqman探针探针 Taqman Taqman探针、杂交探针、分子信标探针、杂交探针、分子信标都是通过荧光能量共振转移都是通过荧光能量共振转移直接或间接的产生特定波长的荧光，使仪器能检测到直接或间接的产生特定波长的荧光，使仪器能检测到PCR原理和方法:(一)众所周知，是由四种碱基按互补配对原则（即腺嘌呤对胸腺众所周知，
4、是由四种碱基按互补配对原则（即腺嘌呤对胸腺 嘧啶，鸟嘌呤对胞嘧啶）组成的螺旋双链。在细胞内，复制嘧啶，鸟嘌呤对胞嘧啶）组成的螺旋双链。在细胞内，复制 时，解螺旋酶首先解开双链让它变成单链做为模板，然后，另一种酶时，解螺旋酶首先解开双链让它变成单链做为模板，然后，另一种酶-聚合酶合成一小段引物（）结合到模板上，最聚合酶合成一小段引物（）结合到模板上，最 后，合成酶以这段引物为起点，合成与模板配对的新链。后，合成酶以这段引物为起点，合成与模板配对的新链。即是在体外模拟复制的过程，它用加热的办法让所研究的即是在体外模拟复制的过程，它用加热的办法让所研究的片段变性变成两条单链，人工合成两个引物让它们结
5、合到模板的片段变性变成两条单链，人工合成两个引物让它们结合到模板的两端，聚合酶即可以大量复制该模板。两端，聚合酶即可以大量复制该模板。假定我们要研究的假定我们要研究的双链两端的序列是：双链两端的序列是：TATTCGGGCTTTCCAAGCAACTAG.GATCTATCCAACGGCTAGGCATTT TATTCGGGCTTTCCAAGCAACTAG.GATCTATCCAACGGCTAGGCATTT ATAAGCCCGAAAGGTTCGTTGATC.CTAGATAGGTTGCCGATCCGTAAA ATAAGCCCGAAAGGTTCGTTGATC.CTAGATAGGTTGCCGATCCGTAAA
6、 在之前，我们首先人工合成两段有碱基的引物，能在之前，我们首先人工合成两段有碱基的引物，能够分别与上下两条链的一端配对，比如一条是（为与模板能够区别，以小够分别与上下两条链的一端配对，比如一条是（为与模板能够区别，以小 写表示）写表示）:ataagcccgaaaggttcgtt:ataagcccgaaaggttcgtt，另一条就是，另一条就是tttacggatcggcaacctattttacggatcggcaacctat。把这两段引物和模板、聚合酶、底物（四种脱氧核苷）混合把这两段引物和模板、聚合酶、底物（四种脱氧核苷）混合 在一起，我们就可以开始做了。在一起，我们就可以开始做了。PCR原理和
7、方法:(二)第一步叫第一步叫“变性变性”，把样品加热到摄氏度一到数分钟，让，把样品加热到摄氏度一到数分钟，让 模模板变性变成单链。板变性变成单链。第二步叫第二步叫“退火退火”，让样品的温度下降到摄氏度一到数分钟，引物，让样品的温度下降到摄氏度一到数分钟，引物就可以结合到模板上去。就可以结合到模板上去。TATTCGGGCTTTCCAAGCAACTAG.GATCTATCCAACGGCTAGGCATTT TATTCGGGCTTTCCAAGCAACTAG.GATCTATCCAACGGCTAGGCATTT ataagcccgaaaggttcgtt tatccaacggctaggcattt ataagcc
8、cgaaaggttcgtt tatccaacggctaggcattt ATAAGCCCGAAAGGTTCGTTGATC.CTAGATAGGTTGCCGATCCGTAAAATAAGCCCGAAAGGTTCGTTGATC.CTAGATAGGTTGCCGATCCGTAAA 第三步叫第三步叫“延伸延伸”，让样品的温度上升到摄氏度一到数分钟，聚合，让样品的温度上升到摄氏度一到数分钟，聚合酶就可以从引物开始用底物复制出新链。酶就可以从引物开始用底物复制出新链。TATTCGGGCTTTCCAAGCAACTAG.GATCTATCCAACGGCTAGGCATTT TATTCGGGCTTTCCAAGCAACTAG
9、.GATCTATCCAACGGCTAGGCATTT ataagcccgaaaggttcgttGATC.CTAGATAGGTTGCCGATCCGTAAAataagcccgaaaggttcgttGATC.CTAGATAGGTTGCCGATCCGTAAATATTCGGGCTTTCCAAGCAACTAG.GATCtatccaacggctaggcattt TATTCGGGCTTTCCAAGCAACTAG.GATCtatccaacggctaggcattt ATAAGCCCGAAAGGTTCGTTGATC.CTAGATAGGTTGCCGATCCGTAAAATAAGCCCGAAAGGTTCGTTGATC.CT
10、AGATAGGTTGCCGATCCGTAAA 这样经过三步一个循环，一条双链就变成了两条，再来一个循环，就变成了四这样经过三步一个循环，一条双链就变成了两条，再来一个循环，就变成了四条条在一个由计算机控制的循环加热器上经过三十个循环，就可以把原来的样品在一个由计算机控制的循环加热器上经过三十个循环，就可以把原来的样品精确地扩增了的次方倍，而这只需要两三个小时。精确地扩增了的次方倍，而这只需要两三个小时。影响PCR特异性的因素 退火步骤的严格性：提高退火温度可以减少不匹配的杂交，从而退火步骤的严格性：提高退火温度可以减少不匹配的杂交，从而提高特异性。提高特异性。减短退火时间及延伸时间可以减少错误
11、引发及错误延伸。减短退火时间及延伸时间可以减少错误引发及错误延伸。引物二聚体是最常见的副产品，降低引物及酶的浓度也可以减少引物二聚体是最常见的副产品，降低引物及酶的浓度也可以减少错误引发，尤其是引物的二聚化。错误引发，尤其是引物的二聚化。改变改变MgCl2(MgCl2(有时有时KCl)KCl)浓度可以改进特异性，这可能是提高反应严浓度可以改进特异性，这可能是提高反应严格性或者对格性或者对TaqTaq酶的直接作用。酶的直接作用。模板中如果存在次级结构，例如待扩增的片段易自行形成发夹结模板中如果存在次级结构，例如待扩增的片段易自行形成发夹结构时，可在构时，可在PCRPCR混合物中的混合物中的4 4
12、dNTPsdNTPs中加入中加入7-7-脱氮脱氮-2-2-脱氧鸟苷脱氧鸟苷-5-5-三磷酸（三磷酸（7-deaza-2-deoxyguanosine-5-trihosphate7-deaza-2-deoxyguanosine-5-trihosphate）(de7GTP)(de7GTP)。用。用de7GTPde7GTP与与dGTPdGTP比例为比例为3 3：1 1的混合物（的混合物（150mol/l 150mol/l de7GTP+50mol/L dGTPde7GTP+50mol/L dGTP）代替）代替200mol/l dGTP200mol/l dGTP，则可阻非特，则可阻非特异性产物的生成。
13、异性产物的生成。扩增反应可以无穷进行下去吗？答：答：不可以。因为经过一定的循环周期后需扩增的片段不再按指数增多而逐渐进不可以。因为经过一定的循环周期后需扩增的片段不再按指数增多而逐渐进 入平坡，进入平坡的循环次数，取决于起始时存在的模板拷贝数以及合成的入平坡，进入平坡的循环次数，取决于起始时存在的模板拷贝数以及合成的DNADNA总量。总量。所谓平坡就是批所谓平坡就是批PCRPCR循环的后期，合成产物达循环的后期，合成产物达0.30.31pmol1pmol时，由于产物的堆积，使原时，由于产物的堆积，使原 来以指数增加的速率变成平坦的曲线。来以指数增加的速率变成平坦的曲线。造成造成PCR进入平坡的
14、原因有：进入平坡的原因有：引物和引物和dNTP等消耗完毕等消耗完毕 TaqTaq酶失活酶失活 底物过剩底物过剩 非特异性扩增产物的竞争非特异性扩增产物的竞争 退火时产物的单链自己缔合退火时产物的单链自己缔合 变性在高浓度产物条件下，产物解链不完全，以及最终产物的阻化作用变性在高浓度产物条件下，产物解链不完全，以及最终产物的阻化作用（焦磷酸化，双链（焦磷酸化，双链DNADNA）。）。总而言之，总而言之，PCRPCR的条件是随系统的的条件是随系统的而异的，并无统一的最佳条件，先选而异的，并无统一的最佳条件，先选用通用的条件扩增，然后稍稍改变各用通用的条件扩增，然后稍稍改变各参数，可以达到优化，以取
15、得优良的参数，可以达到优化，以取得优良的特异性和产率。特异性和产率。实时荧光定量实时荧光定量PCRPCR 的Ct值 由图我们也可以看出，在由图我们也可以看出，在CtCt值所在处重复性惊人的值所在处重复性惊人的好。好。Ct Ct值的含义是：值的含义是：每个反应管内的荧每个反应管内的荧光信号到达设定的光信号到达设定的域值时所经历的循域值时所经历的循环数环数。由于所设阈。由于所设阈值都很低，所以值都很低，所以CtCt值分析实际上就是值分析实际上就是低浓度的荧光值分低浓度的荧光值分析。由于是低浓度，析。由于是低浓度，影响因素小，误差影响因素小，误差没被放大，所以没被放大，所以具具有良好的重现性有良好的
16、重现性 Ct Ct值，值，C C代表代表CycleCycle，t t代表代表thresholdthreshold。由图可以看到当扩增越靠后定量的重复性由图可以看到当扩增越靠后定量的重复性就越差。主要是因为就越差。主要是因为荧光定量技术要求在低荧光定量技术要求在低浓度坏境。因为荧光检测定量原理是在忽略分浓度坏境。因为荧光检测定量原理是在忽略分子间相互作用的情况下建立的。如果分子浓度子间相互作用的情况下建立的。如果分子浓度高了，影响作用很复杂，而高了，影响作用很复杂，而PCR扩增产物是高扩增产物是高浓度的，因此重复性变差也很容易理解。浓度的，因此重复性变差也很容易理解。由由于扩增末期，扩增效率可能
17、因为大量的靶序列于扩增末期，扩增效率可能因为大量的靶序列而产生不可控的影响。而产生不可控的影响。仪器的Ct值定量原理 固定循环数后，荧光信号与模板数成正比，但当固定荧光固定循环数后，荧光信号与模板数成正比，但当固定荧光信号值后，模板数就与循环数成反比。每个模板的信号值后，模板数就与循环数成反比。每个模板的CtCt值与该模值与该模板的起始拷贝数的对数存在线性关系，起始拷贝数越多，板的起始拷贝数的对数存在线性关系，起始拷贝数越多，CtCt值值越小。只要获得未知样品的越小。只要获得未知样品的CtCt值，即可从标准曲线上计算出该值，即可从标准曲线上计算出该样品的起始拷贝数。样品的起始拷贝数。横坐标代表
18、起始横坐标代表起始拷贝数的对数拷贝数的对数纵纵坐坐标标代代CtCt值值利用已知起始拷贝数的利用已知起始拷贝数的标准品可作出标准曲线标准品可作出标准曲线1890型PCR荧光分析仪的特点 高速的加热降温循环系高速的加热降温循环系统统采用长寿命的采用长寿命的LEDLED激发光激发光源源可对可对PCRPCR扩增全过程进行扩增全过程进行实时动态监测实时动态监测无需开启无需开启PCRPCR反应管，可反应管，可避免在避免在PCRPCR期间及期间及PCRPCR之之后产物污染，确保结果后产物污染，确保结果准确准确可用三种不同报告染料可用三种不同报告染料同时用于一个样品，在同时用于一个样品，在单一反应中取得更多信
19、单一反应中取得更多信息息全中文界面，全中文界面，灵活的程灵活的程序设定、全面的分析和序设定、全面的分析和报告功能，全部参数可报告功能，全部参数可储存储存可打印多个或单个样本可打印多个或单个样本报告报告仪器主要技术规格 样本数：样本数：3232 反应管（光学玻璃管）长：反应管（光学玻璃管）长：35mm 35mm 容积（反应体积）容积（反应体积）10-20ul 10-20ul 温度范围：温度范围：40-9840-98 温度控制：温度控制：1/S-10/S1/S-10/S 激发光波长：激发光波长：470nm470nm（LEDLED）发射光波长：发射光波长：530530，640640，710nm 71
20、0nm 检测灵敏度：检测灵敏度：可在一个基因组中检测单拷贝可在一个基因组中检测单拷贝 软件操作系统：软件操作系统：Win2000 Win2000 输入电源输入电源/功率：功率：AC220V 50HZ/800VAAC220V 50HZ/800VA仪器工作原理（一）仪器工作原理（二）图一盖中的加热器在计算机控制下向热室中交图一盖中的加热器在计算机控制下向热室中交 替注入热气和环境空气，热室中温度由风扇电机替注入热气和环境空气，热室中温度由风扇电机 搅匀，由于空气无有效质量，热室可以迅速达到搅匀，由于空气无有效质量，热室可以迅速达到 设置温度，由此进行设置温度，由此进行PCR的温度循环。的温度循环。
21、32个样品个样品在周向马达的带动下逐一经过信号采集的光学系在周向马达的带动下逐一经过信号采集的光学系 统，为采样的准确定位光学结构由丝杆马达进行统，为采样的准确定位光学结构由丝杆马达进行 微调。由长寿命的微调。由长寿命的LED光源光源(470nm)激发毛细激发毛细 管中的荧光，该荧光通过一组复合滤镜和透镜分管中的荧光，该荧光通过一组复合滤镜和透镜分别同时到别同时到3个接收器上个接收器上(520nm,640nm,710nm)完成了仪器的实时采样。完成了仪器的实时采样。强大的软件功能强大的软件功能 参数设置功能（包括温度、时间、循环数、参数设置功能（包括温度、时间、循环数、升降温速率、检测通道选择
22、）升降温速率、检测通道选择）样本资料记录功能样本资料记录功能文件运行显示功能（文件运行显示功能（PCRPCR热循环数据显示、荧热循环数据显示、荧 光检测数据显示）光检测数据显示）检测数据分析功能检测数据分析功能分析结果输出功能分析结果输出功能故障保护和报警功能故障保护和报警功能先进的光路系统先进的光路系统 选用长寿命选用长寿命LEDLED激发激发,无需预热，无需校正无需预热，无需校正采用了先进的非球面镜设计，提升了仪器的光学性能，采用了先进的非球面镜设计，提升了仪器的光学性能，缩短了光程，使仪器更小巧缩短了光程，使仪器更小巧优质的滤光片，硬膜镀膜技术，窄带低背景高透过率优质的滤光片，硬膜镀膜技
23、术，窄带低背景高透过率不霉变不霉变实时三色荧光检测，尽善尽美实时三色荧光检测，尽善尽美传统96孔板和离心毛细管比较 毛细管毛细管 96孔板孔板 标本量小，耗材成本稍高标本量小，耗材成本稍高 标本量大，耗材成本低标本量大，耗材成本低 由于离心，每个样品孔间温度由于离心，每个样品孔间温度 由于加热模块的边缘效应，每个由于加热模块的边缘效应，每个 均匀一性好均匀一性好 样品孔间温度存在差异样品孔间温度存在差异 加热介质空气与反应体系无缝加热介质空气与反应体系无缝 96孔板反应面积大，故升降温孔板反应面积大，故升降温 接触，接触面积大，故升降接触，接触面积大，故升降 速度慢速度慢 温速度快温速度快 一
24、个一个40个循环的实验只需个循环的实验只需30-45 一个一个40个循环的实验需要个循环的实验需要2小时小时 分钟分钟 光源与检测器对每个样品来说光源与检测器对每个样品来说 每个样品孔距离光源和检测器每个样品孔距离光源和检测器 是等距离的，减少了系统误是等距离的，减少了系统误 光程不同，可能对结果产生光程不同，可能对结果产生 差差 影响影响 由于定量由于定量PCR必须借助于样本和标准必须借助于样本和标准品之间的对比实现定量，旋转的样品架很品之间的对比实现定量，旋转的样品架很好地解决了样品孔间的均一性，最大程度好地解决了样品孔间的均一性，最大程度的保证了标准曲线与样品之间条件的一致的保证了标准曲
25、线与样品之间条件的一致性，避免了微小差别被指数级发大。性，避免了微小差别被指数级发大。优异的灵敏度 宽广的线性动力学范围 仪器能在仪器能在7 7个数量个数量级的范围内得到非常级的范围内得到非常好的线性结果。相关好的线性结果。相关系数（系数（r r）可达）可达3 3个个9 9。且有优异的灵敏度和且有优异的灵敏度和极佳的重复性极佳的重复性 友好方便的操作界面友好方便的操作界面 方便的样品编辑界面方便的样品编辑界面 方便的温度循环设置界面方便的温度循环设置界面 一目了然的运行界面 时实反应了当时实反应了当前样品室的温度前样品室的温度曲线。曲线。指示当前温指示当前温度曲线位置的温度曲线位置的温度，循环
26、数及第度，循环数及第几程序段。几程序段。时实反应了时实反应了当当前的荧光信号前的荧光信号 方便的数据处理界面 两种分析方法：两种分析方法：方差法方差法最小二乘法最小二乘法 标准曲线拟合标准曲线拟合：自动标准曲线拟合自动标准曲线拟合自动计算相关系数自动计算相关系数 个人信息输入和打印报告格式病人检验报告病人检验报告综合检测报告综合检测报告1890型PCR与国内外仪器比较型号型号1890Light-CycleMJ Opticon2 Bio-Rad iCyclerRotor-GeneLine-GeneslanFTC-2000 种类种类国产国产进口进口进口进口进口进口进口进口国产国产国产国产国产国产加
27、热方式加热方式 空气加热空气加热 空气加热空气加热 半导体半导体 半导体半导体 空气加热空气加热 半导体半导体 半导体半导体 半导体半导体 激发光源激发光源 LEDLED冷光源冷光源LEDLED冷光源冷光源 LED冷光源冷光源 卤钨灯光卤钨灯光源源 卤钨灯光源卤钨灯光源 卤钨灯光卤钨灯光源源 LED冷光冷光源源卤钨灯光卤钨灯光源源 反应管反应管 石英玻璃石英玻璃毛细管毛细管10-20ul 石英玻璃石英玻璃毛细管毛细管10-20ul 特殊平板样特殊平板样品板品板和条形管和条形管25-50ul 薄壁塑料薄壁塑料管管25-50ul25-50ul 薄壁塑料管薄壁塑料管25-50ul 薄壁塑料薄壁塑料管管25-50ul 薄壁塑料薄壁塑料管管25-50ul 薄壁塑料薄壁塑料管管25-50ul 加温速度加温速度 10/秒秒 20/秒秒 3.0/秒秒 2.0/秒秒 2.0/秒秒2.0/秒秒 3.0/秒秒 2.5/秒秒 检测方式检测方式 三色，光三色，光电池电池 三色，光三色，光电池电池 双色，光电双色，光电倍增管倍增管 四色，四色，CCD四色，光电四色，光电倍增管倍增管 三色，光三色，光电倍增管电倍增管 三色，三色，光光电倍增管电倍增管 多色，多色，CCD 动力学动力学范围范围0101001010010100101001010010100101001010
