1、第九章第九章 抗生素类药物分析与生物抗生素类药物分析与生物检定法检定法 基本要求：基本要求：掌握氨基酸定性鉴别的方法，熟悉氨基酸特殊杂质及掌握氨基酸定性鉴别的方法，熟悉氨基酸特殊杂质及安全性检查，掌握氨基酸含量测定方法，掌握多肽因安全性检查，掌握氨基酸含量测定方法，掌握多肽因子类药物的定性鉴别方法，熟悉多肽因子类药物的检子类药物的定性鉴别方法，熟悉多肽因子类药物的检查方法，掌握多肽因子类药物生物效价的测定方法，查方法，掌握多肽因子类药物生物效价的测定方法，掌握蛋白质类药物的鉴别和检查方法，掌握蛋白质含掌握蛋白质类药物的鉴别和检查方法，掌握蛋白质含量测定和效价测定方法，了解几种氨基酸、多肽因子量
2、测定和效价测定方法，了解几种氨基酸、多肽因子和蛋白质药物的质量分析过程。和蛋白质药物的质量分析过程。第九章第九章 抗生素类药物分析与生物抗生素类药物分析与生物检定法检定法 基本内容基本内容第一节第一节 氨基酸类药品检验氨基酸类药品检验第二节第二节 多肽因子类和蛋白质类药品检验多肽因子类和蛋白质类药品检验第三节第三节 几种氨基酸、多肽因子和蛋白质药物的质量分析几种氨基酸、多肽因子和蛋白质药物的质量分析第一节第一节 氨基酸类药品检验氨基酸类药品检验 氨基酸是氨基酸是治疗蛋白质代谢紊乱治疗蛋白质代谢紊乱、蛋白质缺损蛋白质缺损所引起的所引起的一系列疾病的重要生化药物，也是具有高度营养价值一系列疾病的重
3、要生化药物，也是具有高度营养价值的蛋白质补充剂，有着广泛的生化作用和临床疗效的蛋白质补充剂，有着广泛的生化作用和临床疗效。目前氨基酸及其衍生物临床应用不断发展和扩大，创目前氨基酸及其衍生物临床应用不断发展和扩大，创制了一些新的生化药物制了一些新的生化药物。如如甲基酪氨酸甲基酪氨酸治疗治疗嗜铬细胞瘤嗜铬细胞瘤 氧苯丙氨酸氧苯丙氨酸用于用于类癌瘤综合征类癌瘤综合征 偶氮丝氨酸偶氮丝氨酸治疗治疗白血病白血病 乙酰羟脯氨酸乙酰羟脯氨酸用于用于治疗类风湿关节炎治疗类风湿关节炎第一节第一节 氨基酸类药品检验氨基酸类药品检验 氨基酸为氨基酸为白色晶状体白色晶状体，熔点很高，多在熔融时分解，熔点很高，多在熔融
4、时分解，都能溶解在强酸强碱中都能溶解在强酸强碱中，形成的盐多能溶于水。，形成的盐多能溶于水。氨基酸在氨基酸在等电点等电点（pIpI）时）时溶解度最小溶解度最小，最稳定。，最稳定。中性中性pIpI值在值在5 56.36.3左右。左右。酸性酸性pIpI值在值在2.82.83.23.2左右。左右。碱性氨基酸的碱性氨基酸的pIpI值在值在7.67.610.810.8左右。左右。第一节第一节 氨基酸类药品检验氨基酸类药品检验一、氨基酸的定性鉴别一、氨基酸的定性鉴别 旋光度、熔点、溶解度、纸层析、氨基酸自动化分析旋光度、熔点、溶解度、纸层析、氨基酸自动化分析、气相色谱等均可作为氨基酸鉴别的依据。、气相色谱
5、等均可作为氨基酸鉴别的依据。1 1、化学鉴别法、化学鉴别法 氨基酸的氨基酸的鉴别最常用的方法鉴别最常用的方法是根据所有氨基酸均能与是根据所有氨基酸均能与茚三酮茚三酮显蓝紫色显蓝紫色。采用茚三酮显色法，中国药典（采用茚三酮显色法，中国药典（20102010年）二部对所收年）二部对所收载的氨基酸类药物大多采用此方法进行鉴别。载的氨基酸类药物大多采用此方法进行鉴别。如要对某种氨基酸加以鉴别，可借助于一些如要对某种氨基酸加以鉴别，可借助于一些特定的显特定的显色反应色反应。第一节第一节 氨基酸类药品检验氨基酸类药品检验（1 1）茚三酮反应茚三酮反应 茚三酮在酸性溶液中与茚三酮在酸性溶液中与-氨基酸共氨基
6、酸共热，引起氨基酸氧化脱氢、脱羧反应，最后生成紫色热，引起氨基酸氧化脱氢、脱羧反应，最后生成紫色物质。物质。蓝紫色溶液样品静置水加热茚三酮水min15mL20min3.mL1mL55STmgOOOHOH+H-C-NH2COOHROOOHH+NH3CO2RCO+OOHOHO+OOOHH+NH3H2OCOOOOH+N第一节第一节 氨基酸类药品检验氨基酸类药品检验（2 2）在室温下）在室温下氨基酸与亚硝酸氨基酸与亚硝酸反应，生成反应，生成氮气氮气。在标在标准条件下测定生成氮气体积，即可计算氨基酸的量。准条件下测定生成氮气体积，即可计算氨基酸的量。注：注：生成的氮气只有生成的氮气只有一半来自氨基酸一半
7、来自氨基酸。2.mL410mL103.0NgST亚硝酸钠滴稀盐酸加热水样品CHCOOHRNH2+HNO2CHCOOHROH+N2+H2Owaters 160，125，250；563ng/mL的溶液，每孔加100L。转移电泳 将湿醋酸纤维素（NC）薄膜紧贴凝胶，凝胶与薄膜之间不能有气泡，否则在气泡所在部位的条带将不能转移，在NC膜和凝胶的另一侧放上两层湿滤纸，也不能有气泡，再在两边贴上海绵，最后用塑料网框架夹紧，插入电泳槽，根据凝胶中样品所带电荷的性质，决定有NC膜的一边是靠近正极还是靠近负极一侧。Merck规格微晶纤维素比其他规格的微晶纤维素的分离效果和重现性较好。第二节 多肽因子类和蛋白质类
8、药品检验原理：A、含氮有机物的消化 当含氮有机物与硫酸共热时，分解出氮、二氧化碳、水。第二节 多肽因子类和蛋白质类药品检验74A260（假设1mg/mL蛋白质溶液的A280为1.基因重组多肽因子类药物的鉴别主要采用SDS-PAGE法和免疫印迹法。将待测样品用蛋白酶K，37消化4h。吸去微孔中的液体，每孔加300L清洗液清洗4次。蛋白质分子构象受热、超声波、紫外光照射等物理因素和酸、碱、重金属、有机溶剂等因素的影响而变化。其中包括天然动物体内提取的药物如干扰素、白细胞介素、胸腺肽、转移因子等和通过现代基因工程技术生产的药品如重组人干扰素、重组白细胞介素、重组乙肝疫苗等。根据紫外吸收光谱选定导数光
9、谱波长范围（应包含被测组分的最大吸收波长）。汞、锰、钴等二价金属离子；衍生方式包括柱后衍生法和柱前衍生法。50mL 85磷酸及100mL浓盐酸充分混匀后，以小火回流10h，再加入150g硫酸锂，50mL蒸馏水及数滴液体溴，然后开口继续沸腾15min，以驱逐过量的溴，冷却后定容到1000mL，过滤，溶液呈黄绿色。（3）检测 过去常用薄层层析法进行鉴定检查，但该法操作非常复杂，时间长，灵敏度和精确度都很差。取样品12mL，加等量显色指示剂，以下操作同上法。用异硫氰酸苯酯柱前衍生紫外检测反相HPLC定量测定植物中氨基酸含量，检测限8.第一节第一节 氨基酸类药品检验氨基酸类药品检验（3 3）苯乙醛，有
10、香气苯丙氨酸样品煮沸滴铬酸钾水.3mL550STmgLH2CCHNH2COOHH2CrO4H2CCHO第一节第一节 氨基酸类药品检验氨基酸类药品检验（4 4）红色溶液精氨酸样品萘酚溶液，次溴酸钠水mL5.0.mL5.0mL150STmgLOH+CNH2NHNH(H2C)3CHNH2HOOCOHCNH2NH(H2C)3CHNH2HOOC+NH3+2NH33NaBrON23H2O3NaBr+第一节第一节 氨基酸类药品检验氨基酸类药品检验（5 5）蓝紫色溶液色氨酸样品加热二甲氨基苯甲醛水.mL2mL1020STmgLCHOH2CHCCOOHNH2+RH2CCHCOOHNH2CH2CHHOOCNH2C
11、HR第一节第一节 氨基酸类药品检验氨基酸类药品检验（6 6）红色溶液色氨酸样品加热漂白精溶液水%101mL320mLmgL第一节第一节 氨基酸类药品检验氨基酸类药品检验（7 7）紫色溶液甘氨酸样品加热变色酸放冷水浴蒸干滴置蒸发皿中取上述溶液亚硝酸钠溶液滴稀盐酸水 .mL120%1015mL51.0STmLgNH2CH2COOHHNO2HOCH2COOHN2H2O+HOCH2COOHCO2H2O+HCHOHOHOSO3HSO3H+HCHO-H2OHOHOSO3HSO3HOHOHHO3SSO3HH2C-HHOHOSO3HSO3HOHO-HO3SSO3HH2C第一节第一节 氨基酸类药品检验氨基酸类药
12、品检验（8 8）乙醛蒸气接触亚硝基铁氰化钠和二乙胺时蓝紫色乙醛蒸气接触亚硝基铁氰化钠和二乙胺时蓝紫色内不消失蓝紫色斑点，丙氨酸样品二乙胺溶液滴浸润过的滤纸亚硝基铁氰化钠水浴加热溶液氯胺水min35%501.mL1mL5STTmgLH3CCHNH2COOHCH3CHOCO2N2H2O+氯胺T第一节第一节 氨基酸类药品检验氨基酸类药品检验（9 9）组氨酸的）组氨酸的侧链咪唑基侧链咪唑基也能与也能与重氮苯磺酸重氮苯磺酸反应形成反应形成与与PaulyPauly反应相似的化合物，呈棕红色。反应相似的化合物，呈棕红色。橘黄色溶液组氨酸样品溶液重氮试剂水NaOH%20mL1mL1mL15mgLHCCH2CH
13、CCOOHNH2NH2NH2CCH2CHCCOOHNHHNNH2HO3SNNSO3HNNCH第一节第一节 氨基酸类药品检验氨基酸类药品检验（1010）借助这些特定的显色反应可以对氨基酸进行鉴别。借助这些特定的显色反应可以对氨基酸进行鉴别。呈翠绿色界面处有绿色环，摇匀苏氨酸样品乙醇沿管壁缓慢加入放冷加热至红色化亚锡固体碳酸，少量二苯胺和氰 mL1mL15mgL第一节第一节 氨基酸类药品检验氨基酸类药品检验2 2、光谱鉴别法、光谱鉴别法（1 1）紫外吸收光谱法）紫外吸收光谱法 在在2020种天然氨基酸中，只有种天然氨基酸中，只有酪酪氨酸氨酸、色氨酸色氨酸和和苯丙氨酸苯丙氨酸在紫外区有最大吸收在紫外
14、区有最大吸收。酪氨酸酪氨酸的的 max275nm 275=1.4x103 苯丙氨酸的苯丙氨酸的 max257nm 257=2.0 x102 色氨酸的色氨酸的 max280nm 280=5.6x1031 1：酪氨酸：酪氨酸2 2：色氨酸：色氨酸3 3：苯丙氨酸。：苯丙氨酸。第一节第一节 氨基酸类药品检验氨基酸类药品检验 这三种氨基酸可以通过这三种氨基酸可以通过紫外紫外吸收光谱吸收光谱加以鉴别。加以鉴别。精密称取酪氨酸、色氨酸、精密称取酪氨酸、色氨酸、苯丙氢酸各适量苯丙氢酸各适量。用水制成每用水制成每1mL1mL含含20g20g（色（色氨酸）、氨酸）、40g40g（酪氨酸）（酪氨酸）、200g20
15、0g（苯丙氨酸）（苯丙氨酸）。在波长在波长230230300nm300nm测定各氨测定各氨基酸的吸收光谱基酸的吸收光谱，如右图。，如右图。第一节第一节 氨基酸类药品检验氨基酸类药品检验（2 2）红外吸收光谱图红外吸收光谱图 氨基酸在红外区都有特性图谱氨基酸在红外区都有特性图谱，可以通过与标准氨基酸图谱比较作为氨基酸的鉴别，可以通过与标准氨基酸图谱比较作为氨基酸的鉴别依据。依据。用红外分光光度法进行氨基酸鉴别时，除另有规定外用红外分光光度法进行氨基酸鉴别时，除另有规定外，通常固体供试品均采用，通常固体供试品均采用溴化钾片法溴化钾片法，在，在400400667cm667cm-1-1范围范围内测定其
16、吸收图谱。内测定其吸收图谱。所得的吸收图谱各所得的吸收图谱各主要吸收峰波长主要吸收峰波长和和各吸收峰间的相各吸收峰间的相互强度关系互强度关系均应与对照的图谱一致。均应与对照的图谱一致。第一节第一节 氨基酸类药品检验氨基酸类药品检验3 3、薄层色谱鉴别法、薄层色谱鉴别法 在薄层板上点样，通过与标准氨基酸对照而鉴别氨基在薄层板上点样，通过与标准氨基酸对照而鉴别氨基酸。酸。（1 1）薄层板的制备薄层板的制备待用微晶纤维素样品溶剂挥发完毕后均匀涂板拌成糊状水无水乙醇，hCg5.1,105mL5.2mL205第一节第一节 氨基酸类药品检验氨基酸类药品检验（2 2）十一种氨基酸）十一种氨基酸混合液混合液（
17、色、蛋、亮、异亮、甘、（色、蛋、亮、异亮、甘、赖、苏、缬、苯丙、组、精）与赖、苏、缬、苯丙、组、精）与对照液对照液的的制备制备。混合待测液加水定容至mL1025mg各种对照液分别加水定容至mL15.2 mg第一节第一节 氨基酸类药品检验氨基酸类药品检验（3 3）点样、展开和显色点样、展开和显色 吸取混合液和对照液各吸取混合液和对照液各3L3L，分别点于同一薄层板上，分别点于同一薄层板上。以以正丁醇正丁醇-水水-异丁酸异丁酸-醋酸醋酸（505050505 57 7）之上层）之上层作展开剂，进行作展开剂，进行单向三次展开单向三次展开，展开约，展开约15cm15cm，每次必，每次必须须待溶剂挥发尽待
18、溶剂挥发尽后，再进行下一次展开后，再进行下一次展开。喷以喷以显色剂显色剂（吲哚醌吲哚醌1g1g，溶于，溶于100mL100mL无水乙醇和无水乙醇和10mL10mL冰醋酸中）置冰醋酸中）置100100干燥干燥5 510min10min至显色完全为止至显色完全为止。如所测氨基酸种类不明时，可用亮氨酸作标准曲线。攻毒培养液 MEM培养液添加3牛血清。取样品12mL，加等量显色指示剂，以下操作同上法。偏酸将导致偶合反应不完全。5mL样品同上操作，从标准曲线上查得其浓度。（5）将HRP-羊抗鼠IgG以1800稀释后，每孔100L，37保温30min。如此将仪器洗涤23次。第二节 多肽因子类和蛋白质类药品
19、检验第二节 多肽因子类和蛋白质类药品检验B、标准曲线及样品测定 取7支试管分别加入标准蛋白溶液0、0.取2硼酸溶液10mL，置100mL锥形瓶中，加甲基红-溴甲酚绿混合指示液5滴，将冷凝管尖端插入液面下；测定前将三种溶液按10011混合均匀，即得。第一节 氨基酸类药品检验李湛君等对比了RP-HPLC法和在体生物测定法（小鼠血糖法），证明两种方法测定结果基本吻合，差异无显著性意义。C、测定 用强酸滴定，直至恢复溶液中原来的氢离子浓度为止。（3）Hydrindantin法 取茚三酮20g及茚烷酮（Hydrindantin）3g溶于750mL甲基溶纤剂及4mol/L醋酸缓冲液（醋酸钠272g溶于适量
20、水中，加冰醋酸50mL，加水至500mL）250mL中，混合作为显色指示剂。74A260（假设1mg/mL蛋白质溶液的A280为1.（6）血涂片进一步用瑞氏色素（1600甲醇染液）复染数分钟。第二节 多肽因子类和蛋白质类药品检验01mol/L）滴定至溶液由蓝绿色变为灰紫色，并将滴定结果用空白试验校正（空白和供试品所得馏出液的容积应基本相同，约7075mL）。（1）蛋白质的裂解方法 酶解法 应用蛋白酶裂解蛋白质，利用各种蛋白酶对蛋白质分子肽键作用的特异性。第一节第一节 氨基酸类药品检验氨基酸类药品检验 本层析系统中，由于本层析系统中，由于分分离的程度离的程度与各种与各种氨基酸氨基酸显出不同的颜色
21、显出不同的颜色，可以，可以区别十一种氨基酸。区别十一种氨基酸。用用茚三酮茚三酮-硝酸钠硝酸钠试剂试剂亦能显出不同颜色的色亦能显出不同颜色的色斑，且灵敏度较高斑，且灵敏度较高。用用E.MerckE.Merck规格微晶纤规格微晶纤维素比其他规格的微晶维素比其他规格的微晶纤维素的分离效果和重纤维素的分离效果和重现性较好。现性较好。第一节第一节 氨基酸类药品检验氨基酸类药品检验（3 3）点样、展开和显色点样、展开和显色 吸取混合液和对照液各吸取混合液和对照液各3L3L，分别点于同一薄层板上，分别点于同一薄层板上。以以正丁醇正丁醇-水水-异丁酸异丁酸-醋酸醋酸（505050505 57 7）之上层）之上
22、层作展开剂，进行作展开剂，进行单向三次展开单向三次展开，展开约，展开约15cm15cm，每次必，每次必须须待溶剂挥发尽待溶剂挥发尽后，再进行下一次展开后，再进行下一次展开。喷以喷以显色剂显色剂（吲哚醌吲哚醌1g1g，溶于，溶于100mL100mL无水乙醇和无水乙醇和10mL10mL冰醋酸中）置冰醋酸中）置100100干燥干燥5 510min10min至显色完全为止至显色完全为止。第一节第一节 氨基酸类药品检验氨基酸类药品检验二、氨基酸特殊杂质及安全性检查二、氨基酸特殊杂质及安全性检查1 1、特殊杂质检查、特殊杂质检查 氨基酸原料药所含有的特殊杂质一般为一些其他种类氨基酸原料药所含有的特殊杂质一
23、般为一些其他种类的氨基酸的氨基酸。用用薄层色谱法薄层色谱法进行限量检查：将样品配成一定浓度的进行限量检查：将样品配成一定浓度的供试品液，取一定量供试品液稀释后作为对照液，在供试品液，取一定量供试品液稀释后作为对照液，在同一硅胶同一硅胶G G薄板上，一般用薄板上，一般用正丁醇水冰醋酸正丁醇水冰醋酸（3 31 11 1）展开晾干后，喷）展开晾干后，喷茚三酮茚三酮的的丙酮溶液丙酮溶液显色，规定显色，规定供试品所显杂质斑点的颜色不得深于对照液主斑点供试品所显杂质斑点的颜色不得深于对照液主斑点，以此限制其他氨基酸的含量。以此限制其他氨基酸的含量。第一节第一节 氨基酸类药品检验氨基酸类药品检验 氨基酸和有
24、些小分子多肽药物是经过氨基酸和有些小分子多肽药物是经过酶解酶解或或化学方法化学方法裂解大分子蛋白裂解大分子蛋白后经层析或超滤等方法得到的小分子后经层析或超滤等方法得到的小分子物质物质，因此检查是否存在大分子蛋白质非常重要。因此检查是否存在大分子蛋白质非常重要。方法方法：取取适宜浓度适宜浓度的样品溶液，加的样品溶液，加等体积等体积的的2020磺基磺基水杨酸水杨酸溶液，溶液不发生浑浊则判定无蛋白质。溶液，溶液不发生浑浊则判定无蛋白质。第一节第一节 氨基酸类药品检验氨基酸类药品检验2 2、安全性检查、安全性检查 影响氨基酸安全用药的因素除其中的一般杂质，主要影响氨基酸安全用药的因素除其中的一般杂质，
25、主要为热原的含量。为热原的含量。中国药典所收载的氨基酸基本上都规定了热原检查。中国药典所收载的氨基酸基本上都规定了热原检查。采用采用家兔法家兔法，将一定剂量的供试品，静脉注入家兔体，将一定剂量的供试品，静脉注入家兔体内，在规定时间内观察内，在规定时间内观察家兔体温升高家兔体温升高的情况，以判定的情况，以判定供试品中所含热原的限度是否符合规定。供试品中所含热原的限度是否符合规定。第一节第一节 氨基酸类药品检验氨基酸类药品检验三、氨基酸含量测定三、氨基酸含量测定1 1、茚三酮法、茚三酮法 茚三酮法是氨基酸定量测定应用最广泛的方法之一。茚三酮法是氨基酸定量测定应用最广泛的方法之一。当当茚三酮茚三酮在
26、在酸性条件酸性条件下和氨基酸反应时，氨基酸被氧下和氨基酸反应时，氨基酸被氧化分解生成醛，放出氨和二氧化碳，水合茚三酮则成化分解生成醛，放出氨和二氧化碳，水合茚三酮则成还原型水合茚三酮。然后还原型茚三酮与氨，另一分还原型水合茚三酮。然后还原型茚三酮与氨，另一分子茚三酮进一步缩合生成子茚三酮进一步缩合生成蓝紫色物蓝紫色物，最大吸收值的波，最大吸收值的波长为长为570nm570nm。第一节第一节 氨基酸类药品检验氨基酸类药品检验 茚三酮反应为一切茚三酮反应为一切-氨基酸氨基酸所共有，反应灵敏，根所共有，反应灵敏，根据反应所生成的蓝紫色深浅，可以测定氨基酸含量。据反应所生成的蓝紫色深浅，可以测定氨基酸
27、含量。本法可允许的测定范围是本法可允许的测定范围是0.50.550g50g氨基酸氨基酸。该法又分为该法又分为YemmYemm法法、RosenRosen法法和和HydrindantinHydrindantin法法。过碱会导致PITC与一级胺、二级胺反应，从而影响PTH-氨基酸鉴定；取本品20片，精密称定，研细，精密称取适量（约相当于赖氨酸0.原理：A、含氮有机物的消化 当含氮有机物与硫酸共热时，分解出氮、二氧化碳、水。肽图分析是指用酶解或化学降解蛋白质后，对生成的肽段进行分离、分析的技术。0mg/mL牛血清白蛋白。其他一些仪器分析方法也可用于氨基酸的含量测定。05mg/mL牛血清白蛋白溶液的A5
28、95约为0.谷氨酸和门冬氨酸在高氯酸中不溶解，可将样品溶于2mL甲酸中，再加20mL冰醋酸，直接用标准高氯酸溶液滴定。蛋白质多肽链的N-端必须是游离基团。第一节 氨基酸类药品检验第二节 多肽因子类和蛋白质类药品检验操作方法 常用的凯氏定氮法分为常量法和半微量法两种。当样品中蛋白质浓度较稀时（0.A、溶液的配制 标准蛋白质溶液 0.第二节 多肽因子类和蛋白质类药品检验氨基酸在等电点（pI）时溶解度最小，最稳定。4g酒石酸钾钠溶于20mL水中。用异硫氰酸苯酯柱前衍生紫外检测反相HPLC定量测定植物中氨基酸含量，检测限8.一般采用CPE（细胞致病效应）抑制为基础的抑制微量测定法。第二节 多肽因子类和
29、蛋白质类药品检验第一节第一节 氨基酸类药品检验氨基酸类药品检验（1 1）YemmYemm法法 取样品取样品1.0mL1.0mL（含（含0.020.020.5mol/L0.5mol/L氨基氨基酸酸），加），加枸橼酸缓冲液枸橼酸缓冲液（枸橼酸（枸橼酸21g21g溶于溶于100ml100ml水中，水中，加加1.0mol/L1.0mol/L氢氧化钠溶液氢氧化钠溶液200mL200mL，加水至，加水至500mL500mL）0.5mL0.5mL，茚三酮溶液茚三酮溶液（茚三酮（茚三酮2.5g2.5g溶于溶于50mL50mL甲基溶纤甲基溶纤剂中）剂中）0.2mL0.2mL，氰化钾溶液氰化钾溶液（0.01mol
30、/L0.01mol/L氰化钾溶液氰化钾溶液5mL5mL与与25mL25mL甲基溶纤剂混合）甲基溶纤剂混合）1.0mL1.0mL，充分混匀，充分混匀，沸水沸水浴加热浴加热15min15min，冷却。，冷却。加入加入稀释剂稀释剂3 35mL5mL，于，于570nm570nm波长处测定。波长处测定。按标准曲线计算出含氨基酸的量。按标准曲线计算出含氨基酸的量。如所测氨基酸种类不明时如所测氨基酸种类不明时，可用可用亮氨酸亮氨酸作标准曲线。作标准曲线。第一节第一节 氨基酸类药品检验氨基酸类药品检验（2 2）RosenRosen法法 该法是该法是YemmYemm法的改良。法的改良。取样品取样品1.0mL1.
31、0mL，加，加茚三酮茚三酮溶液（茚三酮溶液（茚三酮3g3g溶于溶于100mL100mL甲甲基溶纤剂中）及基溶纤剂中）及氰化钠氰化钠溶液（氰化钠溶液（氰化钠490mg490mg溶于溶于1L1L水水中，取该溶液中，取该溶液20mL20mL，加醋酸缓冲液至，加醋酸缓冲液至1L1L）各）各0.5mL0.5mL，充分混匀，充分混匀，沸水浴加热沸水浴加热15min15min，立即加，立即加5050（V/VV/V）异异丙醇丙醇，充分搅拌，放冷，比色，计算。，充分搅拌，放冷，比色，计算。（3 3）HydrindantinHydrindantin法法 取取茚三酮茚三酮20g20g及及茚烷酮茚烷酮（Hydrind
32、antinHydrindantin）3g3g溶于溶于750mL750mL甲基溶纤剂甲基溶纤剂及及4mol/L4mol/L醋醋酸缓冲液酸缓冲液（醋酸钠（醋酸钠272g272g溶于适量水中，加冰醋酸溶于适量水中，加冰醋酸50mL50mL，加水至，加水至500mL500mL）250mL250mL中，混合作为显色指示剂。取中，混合作为显色指示剂。取样品样品1 12mL2mL，加等量显色指示剂，以下操作同上法。加等量显色指示剂，以下操作同上法。第一节第一节 氨基酸类药品检验氨基酸类药品检验2 2、三硝基苯磺酸（、三硝基苯磺酸（TNBSTNBS）法）法 三硝基苯磺酸（三硝基苯磺酸（TNBSTNBS）是定量
33、测定氨基酸的重要试剂）是定量测定氨基酸的重要试剂之一。之一。TNBSTNBS在在偏碱性偏碱性的条件下与氨基酸反应，先形成的条件下与氨基酸反应，先形成中间络中间络合物合物（带有等摩尔（带有等摩尔 ），如下式。），如下式。H2NCCHOHORO2NSO3NaNO2NO2+OH-O2NSO3-NO2NO2HNCRH+COO-(中间络合物)H+O2NNaHSO3NO2NO2HNCRH+COOH+（TNP-氨基酸）第一节第一节 氨基酸类药品检验氨基酸类药品检验 中间络合物在光谱下有两个吸收值相近的高峰，分别中间络合物在光谱下有两个吸收值相近的高峰，分别位于位于355nm355nm和和420nm420nm
34、附近。附近。溶液一旦酸化溶液一旦酸化，中间络合物转化成三硝基苯氨基酸（，中间络合物转化成三硝基苯氨基酸（TNPTNP氨基酸），氨基酸），420nm420nm处的吸收值显著下降，而处的吸收值显著下降，而350nm350nm附近的吸收峰则移至附近的吸收峰则移至340nm340nm处处。H2NCCHOHORO2NSO3NaNO2NO2+OH-O2NSO3-NO2NO2HNCRH+COO-(中间络合物)H+O2NNaHSO3NO2NO2HNCRH+COOH+（TNP-氨基酸）第一节第一节 氨基酸类药品检验氨基酸类药品检验 利用利用TNBSTNBS与氨基酸反应的这一特性，可在与氨基酸反应的这一特性，可在
35、420nm420nm处（处（偏碱性偏碱性溶液中）或在溶液中）或在340nm340nm（偏酸性偏酸性溶液中）对氨基溶液中）对氨基酸进行定量测定。酸进行定量测定。本法允许的测定范围是本法允许的测定范围是0.050.050.4mol0.4mol氨基酸氨基酸。H2NCCHOHORO2NSO3NaNO2NO2+OH-O2NSO3-NO2NO2HNCRH+COO-(中间络合物)H+O2NNaHSO3NO2NO2HNCRH+COOH+（TNP-氨基酸）第一节第一节 氨基酸类药品检验氨基酸类药品检验3 3、铜复合物紫外吸收法、铜复合物紫外吸收法 在合适的在合适的pHpH值条件下，值条件下，2mol-2mol-
36、氨基酸与氨基酸与1mol1mol铜离子铜离子形成氨基酸形成氨基酸-铜复合物：铜复合物：CO-OCu2+NH2H2NO-CHCHCROR5kBq 3H-TdR，继续培养46h。第一节 氨基酸类药品检验第二节 多肽因子类和蛋白质类药品检验第一节 氨基酸类药品检验利用TNBS与氨基酸反应的这一特性，可在420nm处（偏碱性溶液中）或在340nm（偏酸性溶液中）对氨基酸进行定量测定。精密称定氨基酸样品约50mg，溶于20ml冰醋酸中，加2滴甲基紫指示剂，用高氯酸标准液滴定。用二阶导数光谱法测定复方氨基酸中色氨酸含量，浓度范围在9-45gml-1时,呈良好线性。四甲基偶氮唑盐3-（4,5-dimethy
37、hhiazol-2-y1）-2,5-di-phenyhetrazolium bromide，MTT是一种淡黄色的可溶性化合物，活细胞特别是增殖期的细胞可通过线粒体能量代谢过程中的琥珀酸脱氢酶的作用使淡黄色的MTT分解产生蓝色结晶状Formazan沉积于细胞内或细胞周围，而且Formazan的量与细胞的增殖程度呈正比，Formazan经异丙醇作用后可溶解显色。以标准蛋白质浓度为横坐标，吸收度为纵坐标作标准曲线。（1）CTLL-2细胞短期培养3H-TdR掺入法 取传代第2-3d、生长旺盛的CTLL-2细胞，用RPMI 1640培养液将细胞洗两次后，用含10小牛血清、510-5mol/L 2-巯基乙
38、醇的RPMI 1640培养液配成1105/mL细胞悬液。双羧基氨基酸（谷氨酰胺、天（门）冬酰胺）的侧链上含有酰胺基。（8）在显微镜油镜下计数网织红细胞数和红细胞数，并计算两者的比值。第二节 多肽因子类和蛋白质类药品检验地高辛与dUTP经强碱作用形成新的复合物DIG-11-UDP标记物，该标记物与膜上的被检测DNA杂交显色而被测定。氨基酸是治疗蛋白质代谢紊乱、蛋白质缺损所引起的一系列疾病的重要生化药物，也是具有高度营养价值的蛋白质补充剂，有着广泛的生化作用和临床疗效。（9）组氨酸的侧链咪唑基也能与重氮苯磺酸反应形成与Pauly反应相似的化合物，呈棕红色。如此将仪器洗涤23次。细胞增殖反映能量代谢
39、活跃，可产生大量的能量，供合成多种大分子物质和细胞分裂所需，细胞能量代谢的水平与细胞合成DNA水平基本平行，因此，测定细胞能量代谢的水平可以间接地反映细胞的增殖情况。李湛君等对比了RP-HPLC法和在体生物测定法（小鼠血糖法），证明两种方法测定结果基本吻合，差异无显著性意义。导数光谱数值测定有三种方法：切线法，峰谷法，峰零法。第一节第一节 氨基酸类药品检验氨基酸类药品检验 此复合物呈此复合物呈蓝色蓝色，除了在，除了在620nm620nm有吸收峰外，在有吸收峰外，在230nm230nm有最大吸收，其摩尔吸收系数在有最大吸收，其摩尔吸收系数在230nm230nm处为处为620nm620nm处的处的
40、100100倍左右倍左右，因此利用氨基酸，因此利用氨基酸-铜复合物的紫外吸收以铜复合物的紫外吸收以进行氨基酸的微量测定。进行氨基酸的微量测定。本法可允许测定范围是本法可允许测定范围是5050500mol/mL500mol/mL的氨基酸。的氨基酸。适用于蛋白质水解速率和水解程度的测定。适用于蛋白质水解速率和水解程度的测定。CO-OCu2+NH2H2NO-CHCHCROR第一节第一节 氨基酸类药品检验氨基酸类药品检验4 4、甲醛滴定法、甲醛滴定法 氨基酸的氨基酸的NHNH3 3+基的基的pKpK值常在值常在9.09.0以上以上，不能用一般指，不能用一般指示剂作酸碱滴定测定。示剂作酸碱滴定测定。但但
41、甲醛甲醛可与氨基酸中不带电荷的氨基相互作用，可与氨基酸中不带电荷的氨基相互作用，促使促使NHNH3 3+上的氢离子释放上的氢离子释放。CO-ONH3+HCRCOHONH2HCRHCHOCO-ONHCH2OHHCRCO-ON(CH2OH)2HCRHCHO+H+H+OH-中和第一节第一节 氨基酸类药品检验氨基酸类药品检验 在在pHpH值中性和常温条件下，甲醛迅速与氨基酸上的氨值中性和常温条件下，甲醛迅速与氨基酸上的氨基（或亚氨基）结合，使下述平衡向右移动，促进氢基（或亚氨基）结合，使下述平衡向右移动，促进氢离子释放，使溶液酸度增加。离子释放，使溶液酸度增加。即可即可用用酚酞酚酞作指示剂，以作指示剂
42、，以氢氧化钠氢氧化钠来滴定。来滴定。每释放出每释放出一个氢离子一个氢离子，就相当有，就相当有一个氨基氮一个氨基氮，从滴定，从滴定所用氢氧化钠量可以计算样品中氨基氮含量所用氢氧化钠量可以计算样品中氨基氮含量以及以及氨基氨基酸含量。酸含量。CO-ONH3+HCRCOHONH2HCRHCHOCO-ONHCH2OHHCRCO-ON(CH2OH)2HCRHCHO+H+H+OH-中和第一节第一节 氨基酸类药品检验氨基酸类药品检验5 5、非水溶液滴定法、非水溶液滴定法 中国药典、美国药典和英国药典对所收载氨基酸类药中国药典、美国药典和英国药典对所收载氨基酸类药物，除物，除谷氨酸谷氨酸用用氢氧化钠氢氧化钠为标
43、准溶液的酸碱滴定法，为标准溶液的酸碱滴定法，其余均根据其结构特性，采用了其余均根据其结构特性，采用了非水酸碱滴定法非水酸碱滴定法。用用冰醋酸作溶剂冰醋酸作溶剂，高氯酸高氯酸作作标准溶液滴定，电位法或标准溶液滴定，电位法或指示剂法确定终点。指示剂法确定终点。适用于适用于常量氨基酸常量氨基酸的含量测定。的含量测定。第一节第一节 氨基酸类药品检验氨基酸类药品检验COHONH2HCRCOHONH3+HCR+CH3COOH+CH3COO-+CH3COOHHClO4+CH3COOH2+ClO4-CH3COO-+CH3COOH2+2CH3COOHCOHONH2HCR+HClO4COHONH3+HCRClO4
44、-+第一节第一节 氨基酸类药品检验氨基酸类药品检验（1 1）直接滴定法直接滴定法 适用于能适用于能溶于冰醋酸溶于冰醋酸的氨基酸。的氨基酸。精密称定氨基酸样品约精密称定氨基酸样品约50mg50mg，溶于，溶于20ml20ml冰醋酸中，加冰醋酸中，加2 2滴甲基紫指示剂，用高氯酸标准液滴定。滴甲基紫指示剂，用高氯酸标准液滴定。终点为紫色消失，终点为紫色消失，呈现蓝色呈现蓝色，计算，即得。，计算，即得。用用直接法直接法测定的氨基酸有丙氨酸、精氨酸、组氨酸、测定的氨基酸有丙氨酸、精氨酸、组氨酸、亮氨酸、甲硫氨酸、苯丙氨酸、色氨酸、缬氨酸、异亮氨酸、甲硫氨酸、苯丙氨酸、色氨酸、缬氨酸、异亮氨酸、苏氨酸等
45、。亮氨酸、苏氨酸等。谷氨酸和门冬氨酸在高氯酸中不溶解，可将谷氨酸和门冬氨酸在高氯酸中不溶解，可将样品溶于样品溶于2mL2mL甲酸中甲酸中，再加，再加20mL20mL冰醋酸，直接用标准高氯酸溶冰醋酸，直接用标准高氯酸溶液滴定。液滴定。第一节第一节 氨基酸类药品检验氨基酸类药品检验（2 2）回滴法回滴法 适用于适用于不易溶于冰醋酸不易溶于冰醋酸而能溶于高氯酸而能溶于高氯酸的氨基酸。的氨基酸。精密称定氨基酸样品约精密称定氨基酸样品约30-40mg30-40mg，溶于，溶于5mL5mL高氯酸标准高氯酸标准液中，加液中，加2 2滴甲基紫指示剂，用醋酸钠溶液滴定剩余滴甲基紫指示剂，用醋酸钠溶液滴定剩余的酸
46、，颜色的酸，颜色由黄至绿至蓝至初次呈现不褪色的紫色由黄至绿至蓝至初次呈现不褪色的紫色为为终点，计算，即得。终点，计算，即得。用用回滴法回滴法测定的氨基酸有赖氨酸、丝氨酸、半胱氨酸测定的氨基酸有赖氨酸、丝氨酸、半胱氨酸等。等。第一节第一节 氨基酸类药品检验氨基酸类药品检验6 6、双波长分光度法、双波长分光度法 双波长分光光度法的理论基础是双波长分光光度法的理论基础是差吸光度差吸光度和和等吸收波等吸收波长长。它采用它采用测量波长测量波长（主波长（主波长p p,Primary Wavelength,Primary Wavelength）和）和参比波长参比波长（次波长（次波长s s,Second Wa
47、velength,Second Wavelength）两）两个不同波长同时测定一个样品溶液，可以克服单波长个不同波长同时测定一个样品溶液，可以克服单波长测定的缺点，提高了测定结果的精密度和准确度。测定的缺点，提高了测定结果的精密度和准确度。待测溶液在待测溶液在p p与与s s两个波长处测定的两个波长处测定的差吸光度差吸光度AA与与试样中试样中待测物质的浓度待测物质的浓度C C成成正比正比。第一节第一节 氨基酸类药品检验氨基酸类药品检验 复方氨基酸注射液中，复方氨基酸注射液中，采用采用双波长分光光度法测定双波长分光光度法测定氨基氨基酸酸的含量的含量，可，可消除共存组分消除共存组分干扰干扰原理，不
48、经分离直接测原理，不经分离直接测定，操作简便、准确。定，操作简便、准确。色氨酸测定波长色氨酸测定波长280nm280nm，酪氨，酪氨酸等吸收波长酸等吸收波长303nm303nm。酪氨酸测定波长酪氨酸测定波长240nm240nm，色氨，色氨酸等吸收波长酸等吸收波长292nm292nm。第一节第一节 氨基酸类药品检验氨基酸类药品检验7 7、导数分光光度法、导数分光光度法 在一定条件下，溶液组分在一定条件下，溶液组分的吸光度对波长的吸光度对波长的的微分值微分值与组分浓度仍保持线性关与组分浓度仍保持线性关系系，利用利用吸光度导数光谱吸光度导数光谱可以可以定量测定组分定量测定组分含量含量，称为导数分光光
49、度法。称为导数分光光度法。导数光谱数值测定有三种导数光谱数值测定有三种方法：方法：切线法切线法，峰谷法峰谷法，峰零法峰零法。kCdAdnn聚丙烯酰胺凝胶电泳 先将待分离样品进行凝胶电泳分离。第三节 几种氨基酸、多肽因子和蛋白质药物的质量分析（3）紫外吸收 由于组成蛋白质的氨基酸中，酪氨酸、色氨酸、苯丙氨酸在紫外区的光吸收特性，因此可利用此种特性鉴别蛋白质。563ng/mL的溶液，每孔加100L。每1mL盐酸滴定液（0.在合适的pH值条件下，2mol-氨基酸与1mol铜离子形成氨基酸-铜复合物：4g酒石酸钾钠溶于20mL水中。测定蛋白质或多肽的氨基酸序列是鉴别蛋白质的重要指标。本法可允许测定范围
50、是50500mol/mL的氨基酸。用薄膜封闭微孔，将微孔板置于室温孵育2h。离心（1500r/min、5min），从各孔中轻轻吸取100L上清液，弃去，各孔再加入10L MTT溶液，置37、5CO2孵箱中孵育46h。置37、5CO2孵箱中培养18h，然后每孔中加入50L的18.该法又分为Yemm法、Rosen法和Hydrindantin法。二、多肽因子类药物的检查连接装置，A瓶中加水适量与甲基红指示液数滴，加稀硫酸使成酸性，加玻璃珠或沸石数粒。Triton、Tween、Lubrol等去垢剂以及乙烯、乙二醇、聚乙烯、吡咯烷酮、载体两性电解质等。第一节 氨基酸类药品检验第二节 多肽因子类和蛋白质类
