1、基因诊断基因诊断利用现代分子生物学和分子遗传利用现代分子生物学和分子遗传学的技术方法，直接检测基因结学的技术方法，直接检测基因结构及其表达水平是否异常，从而构及其表达水平是否异常，从而对疾病做出诊断的方法。对疾病做出诊断的方法。基因基因治疗治疗基因治疗是指将外源正常基因导入基因治疗是指将外源正常基因导入靶细胞，以纠正或补偿因基因缺陷靶细胞，以纠正或补偿因基因缺陷和异常引起的疾病，以达到治疗目和异常引起的疾病，以达到治疗目的。从广义说，基因治疗还可包括的。从广义说，基因治疗还可包括从从DNADNA水平采取的治疗某些疾病的水平采取的治疗某些疾病的措施和新技术。措施和新技术。基因诊断与基因治疗1基因
2、诊断的特点基因诊断的特点针对性强针对性强灵敏性高灵敏性高特异性强特异性强检测样品获取方便检测样品获取方便适应性强适应性强基因诊断与基因治疗2基因诊断常用的技术方法 一一六六四四 二二核酸分子杂交核酸分子杂交DNA芯片芯片限制性内切核酸酶酶谱分析限制性内切核酸酶酶谱分析 聚合酶链反应聚合酶链反应三三五五 单链构多单链构多态性检态性检(SSCP)DNADNA序列测定序列测定基因诊断与基因治疗3Southern印迹杂交印迹杂交基因诊断与基因治疗4Northern 印迹杂交法印迹杂交法提取提取RNA样本样本RNA变性变性琼脂糖凝琼脂糖凝胶电泳分离胶电泳分离转移至膜转移至膜探针（标记探针（标记DNA或或
3、RNA）与之杂交）与之杂交显影或显色显影或显色检测信号。检测信号。Northern法可用于检测组织细胞中法可用于检测组织细胞中总总RNA或或mRNA基因诊断与基因治疗5PCR产物变性后，产物变性后，经聚丙烯酰胺凝胶电泳，经聚丙烯酰胺凝胶电泳，正常基因和变异基因的迁移位置不同，正常基因和变异基因的迁移位置不同，可分析确定致病基因的存在。可分析确定致病基因的存在。PCR/单链构象多态性分析（SSCP）过程原理过程原理基因诊断与基因治疗6基因诊断与基因治疗7基因治疗的策略基因治疗的策略一一基因置换基因置换二二基因添加基因添加三三基因干预基因干预四四自杀基因治疗自杀基因治疗五五基因免疫治疗基因免疫治疗
4、基因诊断与基因治疗8一、基因置换基因诊断与基因治疗9二、基因添加基因诊断与基因治疗10三、基因干预基因诊断与基因治疗11四、自杀基因治疗基因诊断与基因治疗12基因诊断与基因治疗13五、基因免疫治疗基因诊断与基因治疗14体细胞基因治疗体细胞基因治疗基因治疗的两种方式基因治疗的两种方式生殖细胞基因治疗生殖细胞基因治疗1只限于某一只限于某一体细胞的基因体细胞的基因的改变的改变2只限于某个只限于某个体的当代体的当代1对缺陷的生殖对缺陷的生殖细胞进行矫正细胞进行矫正2当代及子代当代及子代基因诊断与基因治疗15存在的一些问题存在的一些问题1对特定座位基因转移，目前还存在较大对特定座位基因转移，目前还存在较
5、大困难；困难；2随机插入可能引起后代的基因突变。随机插入可能引起后代的基因突变。体细胞基因治疗体细胞基因治疗1 1）靶细胞的遗传修饰至今尚无实质性展；）靶细胞的遗传修饰至今尚无实质性展；2 2）基因转移效率不高，只能用显微注射法；）基因转移效率不高，只能用显微注射法；3 3）只适用于排卵周期短而次数多的动物，很）只适用于排卵周期短而次数多的动物，很难适用于人类。难适用于人类。（但目前辅助生殖技术的发展较为有效的（但目前辅助生殖技术的发展较为有效的解决了获取卵细胞的办法。一次可获取少者解决了获取卵细胞的办法。一次可获取少者3-53-5个，多者十几个。）个，多者十几个。）生殖细胞基因治疗生殖细胞基
6、因治疗基因诊断与基因治疗16基因治疗的基本程序基因诊断与基因治疗17（一）治疗性基因的获得（一）治疗性基因的获得 在了解疾病发生的分子机制基础上，选择对疾病有治疗作用的特定基因。治疗性基因获得的方法很多：用酶切或探针杂交法从基因组DNA文库获得，从cDNA文库获取，PCR扩增，人工合成等。基因诊断与基因治疗18（二）基因载体的选择（二）基因载体的选择 基因治疗关键步骤之一，是将治疗基因高效转基因治疗关键步骤之一，是将治疗基因高效转移移 入患者体内、并能调控其适度表达。入患者体内、并能调控其适度表达。常用的载体有两类：病毒载体和非病毒载体。常用的载体有两类：病毒载体和非病毒载体。病毒载体：逆转录
7、病毒载体，病毒载体：逆转录病毒载体，腺病毒载体，腺病毒载体，腺相关病毒载体等；腺相关病毒载体等；非病毒载体：与病毒载体的主要区别在于：采非病毒载体：与病毒载体的主要区别在于：采用理化方法将治疗基因转移入患者体内。用理化方法将治疗基因转移入患者体内。基因诊断与基因治疗19（三）靶细胞的选择（三）靶细胞的选择 基因治疗的受体细胞有生殖细胞和体细胞基因治疗的受体细胞有生殖细胞和体细胞两大类。两大类。对生殖细胞进行基因治疗，可使该生殖细对生殖细胞进行基因治疗，可使该生殖细胞分化发育成长的个体及其后代均具有正胞分化发育成长的个体及其后代均具有正常基因，理论上讲是根治遗传病的理想方常基因，理论上讲是根治遗
8、传病的理想方法。法。但由于涉及安全性和伦理学问题，目前基但由于涉及安全性和伦理学问题，目前基因治疗中禁止使用生殖细胞作为靶细胞，因治疗中禁止使用生殖细胞作为靶细胞，只限于使用体细胞。只限于使用体细胞。基因诊断与基因治疗20人类基因治疗中，将治疗基因导入靶细胞有人类基因治疗中，将治疗基因导入靶细胞有两种两种 途径。途径。一种为直接体内疗法（一种为直接体内疗法（in vivo）：）：即，即，将治疗基因直接导入体内有关组织细胞；将治疗基因直接导入体内有关组织细胞；另一种为间接体内疗法（另一种为间接体内疗法（ex vivo）：）：即，即，在体外先将治疗基因导入培养的靶细胞内，在体外先将治疗基因导入培养
9、的靶细胞内，再将已获得表达外源基因的遗传修饰细胞回再将已获得表达外源基因的遗传修饰细胞回输入病人体内，达到治疗目的。输入病人体内，达到治疗目的。基因诊断与基因治疗21 治疗基因治疗基因导入受体细导入受体细胞的方法胞的方法 化学方法化学方法物理方法物理方法膜融合法膜融合法病毒载体法病毒载体法质粒质粒DNADNA直接转移法直接转移法（四）基因转移方法（四）基因转移方法 磷酸钙法 DEAE葡聚糖法 电穿孔法 粒子轰击法（基因枪法）基因诊断与基因治疗22(五五)转导细胞的选择鉴定转导细胞的选择鉴定 标记基因技术标记基因技术 基因缺陷型受体细胞技术基因缺陷型受体细胞技术 基因共转染技术基因共转染技术 分
10、子杂交技术分子杂交技术 外源基因表达鉴定外源基因表达鉴定 基因诊断与基因治疗23(六六)回输体内回输体内 将治疗性基因修饰的细胞以不同方式回输将治疗性基因修饰的细胞以不同方式回输体内。体内。基因诊断与基因治疗24基因治疗的应用与展望基因治疗的应用与展望基因诊断与基因治疗25(一一)基因治疗应满足的条件：基因治疗应满足的条件：3、靶细胞易获取、培养、及回输、靶细胞易获取、培养、及回输体内。体内。2、仅限体细胞的基因治疗、仅限体细胞的基因治疗 1、单基因缺陷疾病、单基因缺陷疾病 4、治疗效果应胜过对病人的危害。、治疗效果应胜过对病人的危害。5、表达水平无需调控且无副作用。、表达水平无需调控且无副作
11、用。6、需经动物实验验证安全可行。、需经动物实验验证安全可行。基因诊断与基因治疗26（二）基因治疗有待解决的问题（二）基因治疗有待解决的问题 1 1、难以获得真正有治疗作用的基、难以获得真正有治疗作用的基因。因。2 2、外源基因的表达难以在体内精、外源基因的表达难以在体内精确调控。确调控。基因诊断与基因治疗27 3 3、体细胞经体外培养后，其生、体细胞经体外培养后，其生物学特性会有改变。物学特性会有改变。4 4、过多的外源蛋白对机体带来可、过多的外源蛋白对机体带来可能的影响。能的影响。基因诊断与基因治疗285 5、随机整合潜在的威胁。、随机整合潜在的威胁。基因诊断与基因治疗29谢谢谢谢！基因诊断与基因治疗30
