1、掌握常掌握常用显微用显微镜的结镜的结构及性构及性能特点能特点熟悉显微熟悉显微技术的基技术的基础理论，础理论，显微镜的显微镜的应用应用了解显微了解显微镜的维护，镜的维护，显微技术显微技术的进展的进展教教 学学 基基 本本 要要 求求第第1页页/共共130页页内内 容容 提提 要要第一节第一节 光学显微镜光学显微镜第二节第二节 光学显微镜的分类及其应用光学显微镜的分类及其应用第三节第三节 电子显微镜电子显微镜第四节第四节 显微镜的维护显微镜的维护、常见故障及排除、常见故障及排除第五节第五节 显微摄影术显微摄影术第第2页页/共共130页页第一节第一节 光光 学学 显显 微微 镜镜一一、光学显微镜的工
2、作原理、光学显微镜的工作原理二二、光学显微镜的基本结构、光学显微镜的基本结构三三、光学显微镜的性能参数、光学显微镜的性能参数四四、像差和色差、像差和色差五五、光学显微镜的不足之处、光学显微镜的不足之处第第3页页/共共130页页一、光学显微镜的工作原理一、光学显微镜的工作原理 显微镜是由两组会聚透镜组成的光学折射成像系统。把显微镜是由两组会聚透镜组成的光学折射成像系统。把焦距较短、靠近观察物、成实像的透镜组称为物镜（焦距较短、靠近观察物、成实像的透镜组称为物镜（object lens），而焦距较长，靠近眼睛、成虚像的透镜组称为目镜），而焦距较长，靠近眼睛、成虚像的透镜组称为目镜（ocular l
3、ens）。被观察物体位于物镜的前方，被物镜作第）。被观察物体位于物镜的前方，被物镜作第一级放大后成一倒立的实像，然后此实像再被目镜作第二级一级放大后成一倒立的实像，然后此实像再被目镜作第二级放大，放大，得到最大放大效果的倒立的虚像，位于人眼的明视距得到最大放大效果的倒立的虚像，位于人眼的明视距离处。离处。第第4页页/共共130页页光学显微镜的工作原理图光学显微镜的工作原理图第第5页页/共共130页页二、光学显微镜的基本结构二、光学显微镜的基本结构第第6页页/共共130页页三、光学显微镜的性能参数三、光学显微镜的性能参数(一一)放大率放大率(二二)数值孔径数值孔径(三三)分辨率分辨率(四四)视野
4、视野(五五)景深与焦长景深与焦长(六六)镜像亮度和清晰度镜像亮度和清晰度(七七)工作距离工作距离第第7页页/共共130页页(一一)放放 大大 率率 显微镜的放大率显微镜的放大率(amplification)或称放大倍数是或称放大倍数是指显微镜经多次成像后最终所成指显微镜经多次成像后最终所成(放大的放大的)像的大小相像的大小相对于原物体大小的比值，常记作对于原物体大小的比值，常记作M。M=maq M是显微镜的总放大倍数；是显微镜的总放大倍数；m是物镜的放大倍数；是物镜的放大倍数；a是目镜的放大是目镜的放大倍率，一般表达为明视距离倍率，一般表达为明视距离(正常视力者为正常视力者为25cm)与目镜焦
5、距之比；与目镜焦距之比；q为为在双目显微镜中所增设的棱镜所起的放大倍数，一般取值为在双目显微镜中所增设的棱镜所起的放大倍数，一般取值为1.6倍。倍。第第8页页/共共130页页(二二)数数 值值 孔孔 径径 数值孔径数值孔径(numerical aperture)又叫镜又叫镜口率，是物体与物镜间媒质的折射率口率，是物体与物镜间媒质的折射率n与物与物镜孔径角的一半镜孔径角的一半()正弦值的乘积，通常缩正弦值的乘积，通常缩写为写为NA，即，即 NA=nsin 显微镜的数值孔径与其放大率成正比，显微镜的数值孔径与其放大率成正比，与分辨率、景深成反比，它的平方与图像与分辨率、景深成反比，它的平方与图像亮
6、度成正比。亮度成正比。第第9页页/共共130页页NA=nsinNA=nsin 最高数值孔径最高数值孔径油浸物镜油浸物镜 较高数值孔径较高数值孔径干物镜干物镜 低数值孔径低数值孔径干物镜干物镜 油油油油(二二)数数 值值 孔孔 径径第第10页页/共共130页页 分辨率：显微镜的最重要参数，能够区分辨率：显微镜的最重要参数，能够区分开两个质点的最小距离。分开两个质点的最小距离。D=0.61Nsin/2D：分：分 辨辨 率率：光波的波长：光波的波长N：介质折射率：介质折射率：物镜镜口角：物镜镜口角N与与D成反比成反比，与与D成正比成正比(三三)分分 辨辨 率率第第11页页/共共130页页提高显微镜分
7、辨率的方法提高显微镜分辨率的方法 （1）增大物镜的数值孔径）增大物镜的数值孔径 在物镜和盖玻片之间充以在物镜和盖玻片之间充以n 较大的油，较大的油，如香柏油如香柏油n=1.52,不仅使不仅使n 增大，而且孔径增大，而且孔径角也增大。角也增大。（2）用短波长的光照射）用短波长的光照射 如紫外光显微镜，电子显微镜。如紫外光显微镜，电子显微镜。第第12页页/共共130页页(四四)视视 野野 视野视野(visual field)又称视场又称视场(field)，是指通过显微镜所能看到，是指通过显微镜所能看到标本所在空间的范围。标本所在空间的范围。第第13页页/共共130页页(五五)景景 深深 与与 焦焦
8、 长长 景深景深(depth of field)又称焦点深度，又称焦点深度，是指在成一幅清晰像的前提下，像平面是指在成一幅清晰像的前提下，像平面不变，景物沿光轴前后移动的距离称不变，景物沿光轴前后移动的距离称“景深景深”。景物不动，像平面沿光轴前后移动景物不动，像平面沿光轴前后移动的距离称的距离称“焦长焦长”。第第14页页/共共130页页(六六)镜镜 像像 亮亮 度度 和和 清清 晰晰 度度 镜像亮度即显微镜的图像亮度的简称。镜像亮度即显微镜的图像亮度的简称。高倍率工作条件下的暗场、偏光、摄影显高倍率工作条件下的暗场、偏光、摄影显微镜等都需要足够的亮度，与照明及物镜微镜等都需要足够的亮度，与照
9、明及物镜的性能参数相关。的性能参数相关。镜像清晰度是指图像的轮廓清晰、衬镜像清晰度是指图像的轮廓清晰、衬度适中的程度。度适中的程度。第第15页页/共共130页页(七七)工工 作作 距距 离离 工作距离是指从物镜前表面中心到被观察标本工作距离是指从物镜前表面中心到被观察标本间满足工作要求的距离范围，与物镜的数值孔径成间满足工作要求的距离范围，与物镜的数值孔径成反比。反比。一般情况下，物镜的数值孔径赿大，其工作距一般情况下，物镜的数值孔径赿大，其工作距离赿小。离赿小。第第16页页/共共130页页四、像四、像 差差 和和 色色 差差(一一)像差像差 1球差球差(spheric aberration)
10、2彗差彗差(broom aberration)3像散像散(astigmatism)4场曲场曲 5畸变畸变(distortion)(二二)色差色差第第17页页/共共130页页(一一)、像、像 差差(aberration)像差是指透镜所成的像与理想像像差是指透镜所成的像与理想像在形状、颜色等方面存在差异。在形状、颜色等方面存在差异。第第18页页/共共130页页1球球 差差(spheric aberration)透镜的球差透镜的球差 光轴上的点光源所发出的光光轴上的点光源所发出的光锥入射到透镜的球折射面时，由锥入射到透镜的球折射面时，由于通过透镜边缘的光线不满足近于通过透镜边缘的光线不满足近轴光线的
11、条件，因此不能和通过轴光线的条件，因此不能和通过近轴曲面的光线会聚成一个理想近轴曲面的光线会聚成一个理想的亮点，而是形成一个中间亮边的亮点，而是形成一个中间亮边缘逐渐模糊的弥散斑，这就是透缘逐渐模糊的弥散斑，这就是透镜的球面像差，简称为球差。镜的球面像差，简称为球差。球差可以通过设置光阑而减球差可以通过设置光阑而减小。小。第第19页页/共共130页页2彗彗 差差(broom aberration)近光轴外的点光源发出的光束，经过近光轴外的点光源发出的光束，经过透镜中央和边缘部分后在垂直于光轴的同一透镜中央和边缘部分后在垂直于光轴的同一成像平面上也不能交于同一个像点。离光轴成像平面上也不能交于同
12、一个像点。离光轴越近的像会聚越好，亮度越大，亮点越小。越近的像会聚越好，亮度越大，亮点越小。于是在成像平面上便形成一个顶端小而亮，于是在成像平面上便形成一个顶端小而亮，远离光轴方向形成逐渐增宽且亮度减弱的模远离光轴方向形成逐渐增宽且亮度减弱的模糊尾部，形如彗星，称为彗差。糊尾部，形如彗星，称为彗差。第第20页页/共共130页页透透 镜镜 的的 彗彗 差差光轴光轴透镜透镜第第21页页/共共130页页3像像 散散(astigmatism)远离光轴的物点发出的光，即使是以远离光轴的物点发出的光，即使是以细光束成像也不可能会聚于一点，而是在细光束成像也不可能会聚于一点，而是在像空间不同的成像面上或者成
13、椭圆弥散斑，像空间不同的成像面上或者成椭圆弥散斑，或者在特殊位置形成圆形弥散斑，甚至是或者在特殊位置形成圆形弥散斑，甚至是形成两个垂直方向上的短亮线，这种成像形成两个垂直方向上的短亮线，这种成像缺陷称为像散。缺陷称为像散。一般来说，透镜像散随透镜形状、光一般来说，透镜像散随透镜形状、光阑位置而异，可以用正、负透镜适当组合阑位置而异，可以用正、负透镜适当组合而消除。而消除。第第22页页/共共130页页透透 镜镜 的的 像像 散散物点物点物镜物镜光轴光轴 水平水平焦平面焦平面 垂直垂直焦平面焦平面明晰圆明晰圆第第23页页/共共130页页4场场 曲曲 一个平面的物体通过透镜成像后，虽一个平面的物体通
14、过透镜成像后，虽然像平面上任意一点仍然是清晰的，但所然像平面上任意一点仍然是清晰的，但所成的像不再是一个平面，而成了一弯曲的成的像不再是一个平面，而成了一弯曲的面，这就是场曲。面，这就是场曲。第第24页页/共共130页页5畸畸 变变(distortion)由于像平面上各处放大率不同引起的由于像平面上各处放大率不同引起的成像缺陷称为畸变成像缺陷称为畸变。畸变的原因是由于透畸变的原因是由于透镜边缘与透镜近轴的放大率不同而引起的。镜边缘与透镜近轴的放大率不同而引起的。如果离光轴越远处放大率越大，则像如果离光轴越远处放大率越大，则像的外部线段将比中间线段长，结果形成了枕的外部线段将比中间线段长，结果形
15、成了枕形畸变，这种畸变称为正畸变。形畸变，这种畸变称为正畸变。反之则形成边缘放大率小而近轴放大反之则形成边缘放大率小而近轴放大率大的桶形畸变，称为负畸变率大的桶形畸变，称为负畸变。第第25页页/共共130页页透透 镜镜 的的 畸畸 变变第第26页页/共共130页页(二二)、色色 差差 色差色差(chromatic aberration)是一种由白光或是一种由白光或复色光经透镜成像时，会因各种色光存在着光程复色光经透镜成像时，会因各种色光存在着光程差而造成颜色不同、位置不重合、大小不一致的差而造成颜色不同、位置不重合、大小不一致的不同成像效果，从而造成像和物的较大失真。不同成像效果，从而造成像和
16、物的较大失真。透镜的色差透镜的色差第第27页页/共共130页页透镜的轴向色差（）和垂轴色差（）透镜的轴向色差（）和垂轴色差（）B第第28页页/共共130页页五、光学显微镜的不足之处五、光学显微镜的不足之处1.放大倍数的极限：放大倍数的极限：20002000 2.分辨率的极限：分辨率的极限：0.20.2 m（可见光照明）（可见光照明）3.景深的极限：景深的极限：0.10.1 m（要求金相准备）（要求金相准备）4.不能分析化学成分不能分析化学成分第第29页页/共共130页页第二节第二节 光学显微镜的分类及其应用光学显微镜的分类及其应用一一、双目生物显微镜、双目生物显微镜二二、荧光显微镜、荧光显微镜
17、三三、相衬显微镜、相衬显微镜四四、倒置显微镜、倒置显微镜五五、暗场显微镜、暗场显微镜六六、紫外光显微镜、紫外光显微镜七七、偏光显微镜、偏光显微镜八八、激光扫描共聚焦显微镜、激光扫描共聚焦显微镜九九、干涉相衬显微镜、干涉相衬显微镜十十、近场扫描光学显微镜、近场扫描光学显微镜第第30页页/共共130页页一、双一、双 目目 生生 物物 显显 微微 镜镜 双目显微镜双目显微镜(binocular microscope)的结构是的结构是利用一组复合棱镜把透过物镜后的光束分成强度相利用一组复合棱镜把透过物镜后的光束分成强度相同的两束而形成两个中间像，分别再由左右目镜放同的两束而形成两个中间像，分别再由左右
18、目镜放大。来自物镜的光线经棱镜组分光成两束平行光束，大。来自物镜的光线经棱镜组分光成两束平行光束，进入目镜，双目显微镜必须满足分光后两束光的光进入目镜，双目显微镜必须满足分光后两束光的光程必须相同和两束光的光强度大小一致这两个基本程必须相同和两束光的光强度大小一致这两个基本要求。要求。第第31页页/共共130页页目镜物镜聚光器光源一、双一、双 目目 生生 物物 显显 微微 镜镜第第32页页/共共130页页二、荧二、荧 光光 显显 微微 镜镜 荧光显微镜荧光显微镜(fluorescence microscopy)是是以紫外线为光源来激发生物标本中的荧光物质，以紫外线为光源来激发生物标本中的荧光物
19、质，产生能观察到各种颜色荧光的一种光学显微镜。产生能观察到各种颜色荧光的一种光学显微镜。利用它可研究荧光物质在组织和细胞内的分布。利用它可研究荧光物质在组织和细胞内的分布。为防止紫外线进入物镜，可以采用暗视场照明。为防止紫外线进入物镜，可以采用暗视场照明。第第33页页/共共130页页荧光（荧光（Fluorescence）：）：细胞中的某些物质（如叶绿素）经紫外线照细胞中的某些物质（如叶绿素）经紫外线照射后能发出可见光线，称为荧光。射后能发出可见光线，称为荧光。自发荧光：由细胞本身存在的物质经紫外线自发荧光：由细胞本身存在的物质经紫外线照射后发出的荧光。照射后发出的荧光。诱发荧光：一些细胞成分本
20、身经紫外线照射诱发荧光：一些细胞成分本身经紫外线照射后不发荧光，但用荧光染料（酸性品红、甲基绿、后不发荧光，但用荧光染料（酸性品红、甲基绿、吖叮橙等荧光色素）进行活体染色或固定后切片吖叮橙等荧光色素）进行活体染色或固定后切片染色，就能在荧光镜下看见荧光，这种荧光叫诱染色，就能在荧光镜下看见荧光，这种荧光叫诱发荧光。发荧光。二、荧二、荧 光光 显显 微微 镜镜第第34页页/共共130页页第第35页页/共共130页页第第36页页/共共130页页第第37页页/共共130页页第第38页页/共共130页页透透 射射 荧荧 光光 显显 微微 镜镜 原原 理理第第39页页/共共130页页落落 射射 荧荧 光
21、光 显显 微微 镜镜 原原 理理第第40页页/共共130页页三、相三、相 衬衬 显显 微微 镜镜 光线只有通过染色标本时其波长、振光线只有通过染色标本时其波长、振幅发生变化，人眼才能看见。幅发生变化，人眼才能看见。活细胞和未染色的标本由于光的波长活细胞和未染色的标本由于光的波长和振幅不发生变化，人眼看不到，但其相和振幅不发生变化，人眼看不到，但其相位有变化，因此利用光的干涉和衍射效应位有变化，因此利用光的干涉和衍射效应把透过标本不同区域的光波光程差转变成把透过标本不同区域的光波光程差转变成振幅差，使细胞内各种结构之间呈现清晰振幅差，使细胞内各种结构之间呈现清晰可见的明暗对比。可见的明暗对比。第
22、第41页页/共共130页页 相衬显微镜比普通光学显微镜多了相衬显微镜比普通光学显微镜多了2个个部件：部件：在聚光器上增加一个环形光阑；在聚光器上增加一个环形光阑；在物镜后焦面增加一个相板，相板上在物镜后焦面增加一个相板，相板上有一个环形区，通过环形区的光比从其它有一个环形区，通过环形区的光比从其它区域透过的光超前或滞后区域透过的光超前或滞后1/4，这样就使，这样就使通过标本不同区域光波的相位差转变为振通过标本不同区域光波的相位差转变为振幅差。幅差。三、相三、相 衬衬 显显 微微 镜镜第第42页页/共共130页页相衬显微镜照明原理相衬显微镜照明原理第第43页页/共共130页页 光通过标本致密区时
23、发生衍射，产生光通过标本致密区时发生衍射，产生偏折光，相位和未受影响的直射光相比被偏折光，相位和未受影响的直射光相比被推迟了推迟了1/4。只有未发生偏折的的直射光。只有未发生偏折的的直射光可通过相位板的环形区，其它的偏折光在可通过相位板的环形区，其它的偏折光在物镜的后焦面上产生了一个与通过相位板物镜的后焦面上产生了一个与通过相位板的环形区的光不同的的环形区的光不同的1/4的光程差。两组的光程差。两组光在平面上成像。光在平面上成像。三、相三、相 衬衬 显显 微微 镜镜第第44页页/共共130页页 如相板的环形区使直射光超前如相板的环形区使直射光超前1/4，加上开始，加上开始直射光超前的直射光超前
24、的1/4，直射光共超前，直射光共超前1/2，直射光和，直射光和偏折光叠加形成的合成波振幅减少，产生暗反差。偏折光叠加形成的合成波振幅减少，产生暗反差。如相板的环形区使直射光滞后如相板的环形区使直射光滞后1/4，加上开始，加上开始直射光超前的直射光超前的1/4，两者相抵直射光不发生变化，两者相抵直射光不发生变化，直射光和偏折光无相位变化，形成的合成波振幅增直射光和偏折光无相位变化，形成的合成波振幅增加，产生明反差。加，产生明反差。三、相三、相 衬衬 显显 微微 镜镜第第45页页/共共130页页四、倒四、倒 置置 显显 微微 镜镜 倒置显微镜倒置显微镜(Inverted Microscope)的的
25、组成和普通显微镜一样，只不过物镜与照组成和普通显微镜一样，只不过物镜与照明系统颠倒，前者在载物台之下，后者在明系统颠倒，前者在载物台之下，后者在载物台之上，用于观察培养的活细胞，具载物台之上，用于观察培养的活细胞，具有相差物镜。有相差物镜。第第46页页/共共130页页倒置显微镜倒置显微镜第第47页页/共共130页页五、暗五、暗 场场 显显 微微 镜镜 暗视野显微镜（暗视野显微镜（dark field microscope）的聚光镜中央有档光片，使）的聚光镜中央有档光片，使照明光线不直接进入物镜，只允许被标本照明光线不直接进入物镜，只允许被标本反射和衍射的光线进入物镜，因而视野的反射和衍射的光线
26、进入物镜，因而视野的背景是黑的，物体的边缘是亮的。利用这背景是黑的，物体的边缘是亮的。利用这种显微镜能见到小至种显微镜能见到小至 4nm200nm的微粒的微粒子，分辨率可比普通显微镜高子，分辨率可比普通显微镜高50倍。倍。第第48页页/共共130页页暗视野照明方式 第第49页页/共共130页页六、紫六、紫 外外 光光 显显 微微 镜镜 使用紫外光源可以明显提高显微镜的分使用紫外光源可以明显提高显微镜的分辨率，对于生物样品使用紫外光照明还具有辨率，对于生物样品使用紫外光照明还具有独特的效果。生物细胞中的原生质对可见光独特的效果。生物细胞中的原生质对可见光几乎是不吸收的，而蛋白质和核酸等生物大几乎
27、是不吸收的，而蛋白质和核酸等生物大分子对紫外光具有特殊的吸收作用。因此，分子对紫外光具有特殊的吸收作用。因此，可以使用紫外光显微镜（可以使用紫外光显微镜（ultraviolet microscope）研究单个细胞的组成与变化情）研究单个细胞的组成与变化情况。况。第第50页页/共共130页页七、偏七、偏 光光 显显 微微 镜镜 偏光显微镜是利用光的偏振特性，对具有双折偏光显微镜是利用光的偏振特性，对具有双折射性射性(即可以使一束入射光经折射后分成两束折射即可以使一束入射光经折射后分成两束折射光光)的晶体、液晶态物质进行观察和研究的重要光的晶体、液晶态物质进行观察和研究的重要光学仪器。学仪器。利用
28、它可以清楚地观察到纤维丝、纺锤体、胶利用它可以清楚地观察到纤维丝、纺锤体、胶原、染色体、卵巢、骨骼、毛发、活细胞的结晶或原、染色体、卵巢、骨骼、毛发、活细胞的结晶或液晶态的内含物、神经纤维、肌肉纤维、植物纤维液晶态的内含物、神经纤维、肌肉纤维、植物纤维等的细微结构，从而可以分析细胞、组织的变化过等的细微结构，从而可以分析细胞、组织的变化过程。程。第第51页页/共共130页页 偏光显微镜是在一般显微镜的基础上偏光显微镜是在一般显微镜的基础上增添了使普通光转变成线偏振光和检测偏振增添了使普通光转变成线偏振光和检测偏振光的装置或观察干涉图样的特殊透镜。即光光的装置或观察干涉图样的特殊透镜。即光源前有
29、偏振片（起偏器），使进入显微镜的源前有偏振片（起偏器），使进入显微镜的光线为偏振光，镜筒中有检偏器（一个偏振光线为偏振光，镜筒中有检偏器（一个偏振方向与起偏器垂直的起偏器）。方向与起偏器垂直的起偏器）。七、偏七、偏 光光 显显 微微 镜镜 第第52页页/共共130页页 偏光显微镜的载物台是可以旋转的。当偏光显微镜的载物台是可以旋转的。当载物台无样品时，无论如何旋转载物台，由载物台无样品时，无论如何旋转载物台，由于两个偏振片是垂直的，显微镜里看不到光于两个偏振片是垂直的，显微镜里看不到光线。而放入旋光性物质后，由于光线通过这线。而放入旋光性物质后，由于光线通过这类物质时发生偏转，因此旋转载物台便
30、能检类物质时发生偏转，因此旋转载物台便能检测到这种物体。测到这种物体。七、偏七、偏 光光 显显 微微 镜镜 第第53页页/共共130页页偏光显微镜的结构偏光显微镜的结构第第54页页/共共130页页激光扫描共聚焦显微镜原理图激光扫描共聚焦显微镜原理图八、激光扫描共聚焦显微镜八、激光扫描共聚焦显微镜第第55页页/共共130页页激光扫描共聚焦显微镜实物图激光扫描共聚焦显微镜实物图第第56页页/共共130页页1.激光扫描共聚焦显微镜工作原理激光扫描共聚焦显微镜工作原理 激光扫描共聚焦显微镜是在荧光显微镜激光扫描共聚焦显微镜是在荧光显微镜成像的基础上装有激光扫描装置，以单色激成像的基础上装有激光扫描装置
31、，以单色激光作为光源，使样品被激发出荧光，利用计光作为光源，使样品被激发出荧光，利用计算机进行图像处理，从而得到细胞或组织内算机进行图像处理，从而得到细胞或组织内部微细结构的荧光图像。部微细结构的荧光图像。第第57页页/共共130页页1.激光扫描共聚焦显微镜工作原理激光扫描共聚焦显微镜工作原理 共聚焦显微镜利用激光扫描束经照明孔形共聚焦显微镜利用激光扫描束经照明孔形成点光源对标本内焦平面上的每一点扫描，由于成点光源对标本内焦平面上的每一点扫描，由于照明孔与检测孔相对于物镜焦平面是共轭的，焦照明孔与检测孔相对于物镜焦平面是共轭的，焦平面上的点同时聚焦于照明孔和检测孔，焦平面平面上的点同时聚焦于照
32、明孔和检测孔，焦平面以外的点不会在检测孔处成像，这样就得到了标以外的点不会在检测孔处成像，这样就得到了标本清晰的光学切面图，克服了普通光镜图像模糊本清晰的光学切面图，克服了普通光镜图像模糊的缺点。的缺点。第第58页页/共共130页页 在显微镜载物台上加一个微量步进马达，在显微镜载物台上加一个微量步进马达，使载物台上下移动，改变焦平面，不同层使载物台上下移动，改变焦平面，不同层次的光切面图像经计算机图像三维重组，次的光切面图像经计算机图像三维重组，就能获得样品的立体结构图像。就能获得样品的立体结构图像。1.激光扫描共聚焦显微镜工作原理激光扫描共聚焦显微镜工作原理第第59页页/共共130页页2.激
33、光扫描共聚焦显微镜的基本结构激光扫描共聚焦显微镜的基本结构第第60页页/共共130页页1.1.抑制图像的模糊，获得清晰的图像抑制图像的模糊，获得清晰的图像2.2.具有更高的轴向分辨率，并可获取连续光学切片具有更高的轴向分辨率，并可获取连续光学切片3.3.增加侧向分辨率增加侧向分辨率4.4.由于点对点扫描去除了杂散光的影响由于点对点扫描去除了杂散光的影响3.共焦显微镜与传统显微镜的区别共焦显微镜与传统显微镜的区别第第61页页/共共130页页4.CLSM在医学检验中的应用在医学检验中的应用1细胞的三维重建细胞的三维重建 2细胞定量荧光测定细胞定量荧光测定 3 细胞内钙离子、细胞内钙离子、pH值和其
34、它离子的值和其它离子的动态分析动态分析 4 细胞间通讯和膜的流动性细胞间通讯和膜的流动性 第第62页页/共共130页页九、干涉相衬显微镜九、干涉相衬显微镜（interference contrast microscope）干涉相衬显微镜利用偏振光，有四个特殊的光干涉相衬显微镜利用偏振光，有四个特殊的光学组件：偏振器、棱镜、滑行器和检偏器。学组件：偏振器、棱镜、滑行器和检偏器。偏振器直接装在聚光系统的前面，使光线发生偏振器直接装在聚光系统的前面，使光线发生线性偏振。在聚光器中安装了石英线性偏振。在聚光器中安装了石英Wollaston棱镜，棱镜，可将一束光分解成偏振方向不同的两束光（可将一束光分解
35、成偏振方向不同的两束光（x和和y），），二者成一小夹角。聚光器将两束光调整成与显微镜二者成一小夹角。聚光器将两束光调整成与显微镜光轴平行的方向。最初两束光相位一致，在穿过标光轴平行的方向。最初两束光相位一致，在穿过标本相邻的区域后，由于标本的厚度和折射率不同，本相邻的区域后，由于标本的厚度和折射率不同，引起两束光发生光程差。引起两束光发生光程差。第第63页页/共共130页页 在物镜的后焦面处安装了第二个在物镜的后焦面处安装了第二个Wollaston棱镜棱镜(滑行器滑行器)，把两束光波合并成一束。这时两束光的，把两束光波合并成一束。这时两束光的偏振面（偏振面（x和和y）仍然存在。）仍然存在。最后
36、光束穿过第二个偏振装置最后光束穿过第二个偏振装置(检偏器检偏器)，检偏，检偏器将两束垂直的光波组合成具有相同偏振面的两束器将两束垂直的光波组合成具有相同偏振面的两束光，使二者发生干涉。光，使二者发生干涉。九、干涉相衬显微镜九、干涉相衬显微镜第第64页页/共共130页页 x和和y波的光程差决定着透射光的多波的光程差决定着透射光的多少，光程差值为少，光程差值为0时，没有光穿过检偏时，没有光穿过检偏器；光程差值等于波长一半时，穿过的器；光程差值等于波长一半时，穿过的光达到最大值。于是在灰色的背景上，光达到最大值。于是在灰色的背景上，标本结构呈现明暗差。标本结构呈现明暗差。九、干涉相衬显微镜九、干涉相
37、衬显微镜第第65页页/共共130页页 为了使影像的反差达到最佳状态，可调为了使影像的反差达到最佳状态，可调节滑行器的纵行微调改变光程差，光程差可节滑行器的纵行微调改变光程差，光程差可改变影像的亮度。调节滑行器可使标本的细改变影像的亮度。调节滑行器可使标本的细微结构呈现出正或负的投影形象，通常是一微结构呈现出正或负的投影形象，通常是一侧亮，而另一侧暗，这便造成了标本的人为侧亮，而另一侧暗，这便造成了标本的人为三维立体感，类似大理石上的浮雕。三维立体感，类似大理石上的浮雕。九、干涉相衬显微镜九、干涉相衬显微镜第第66页页/共共130页页干涉相衬显微镜的光路图干涉相衬显微镜的光路图第第67页页/共共
38、130页页十、近场扫描光学显微镜十、近场扫描光学显微镜（near-field scanning optical microscope）近场扫描光学显微镜的微探头是一个中空的、近场扫描光学显微镜的微探头是一个中空的、针状的、顶部小于针状的、顶部小于150nm，内孔直径为，内孔直径为50nm的玻的玻璃微管，管壁镀铝膜，最终使光线只能从直径为璃微管，管壁镀铝膜，最终使光线只能从直径为50nm（可见波长的（可见波长的1/10左右）的内孔射入，微管左右）的内孔射入，微管的尾部接上十分灵敏的光量子探测器测量进入内的尾部接上十分灵敏的光量子探测器测量进入内孔的光量。孔的光量。第第68页页/共共130页页 近
39、场扫描光学显微镜技术的理论分辨率极限约近场扫描光学显微镜技术的理论分辨率极限约10nm。由于采用可见光对生物样品损害很少，而。由于采用可见光对生物样品损害很少，而且既可以用在空气中（与电子显微镜必须在真空条且既可以用在空气中（与电子显微镜必须在真空条件下相比要优越），又可以用在水中（与一般的光件下相比要优越），又可以用在水中（与一般的光学显微镜相比也有优越性）。学显微镜相比也有优越性）。近场扫描光学显微镜技术将对研究活体中的病近场扫描光学显微镜技术将对研究活体中的病毒和染色体等生物物质的结构和形态发挥作用。毒和染色体等生物物质的结构和形态发挥作用。十、近场扫描光学显微镜十、近场扫描光学显微镜第
40、第69页页/共共130页页第第 三三 节节 电电 子子 显显 微微 镜镜一一、电子显微镜的基本结构、电子显微镜的基本结构二二、电子显微镜的分类及其应用、电子显微镜的分类及其应用 第第70页页/共共130页页一、电子显微镜的基本结构一、电子显微镜的基本结构 电子光学系统电子光学系统 真空系统真空系统 供电系统供电系统 机械系统机械系统 观察显示系统观察显示系统照明系统照明系统成像系统成像系统第第71页页/共共130页页（一）电子光学系统（一）电子光学系统照明系统照明系统 照明系统主要由照明系统主要由电子枪电子枪和和聚光镜聚光镜组成。组成。电子枪是发射电子的照明光源。电子枪是发射电子的照明光源。聚
41、光镜是把电子枪发射出来的电子会聚而聚光镜是把电子枪发射出来的电子会聚而成的交叉点进一步会聚后照射到样品上。成的交叉点进一步会聚后照射到样品上。照明系统的作用就是提供一束亮度高、照照明系统的作用就是提供一束亮度高、照明孔径角小、平行度好、束流稳定的照明明孔径角小、平行度好、束流稳定的照明源。源。第第72页页/共共130页页1.电电 子子 枪枪 电子枪是电镜的电子发射源，其作用是形成电子枪是电镜的电子发射源，其作用是形成电子束，并控制电子束的发射，获得一高亮度和电子束，并控制电子束的发射，获得一高亮度和高稳定度的照明电子光源。高稳定度的照明电子光源。常用的电子枪由常用的是热阴极三极电子枪，常用的电
42、子枪由常用的是热阴极三极电子枪，它由发夹形钨丝阴极、栅极帽和阳极组成。它由发夹形钨丝阴极、栅极帽和阳极组成。第第73页页/共共130页页电子枪的结构及工作原理图电子枪的结构及工作原理图第第74页页/共共130页页灯灯 丝丝第第75页页/共共130页页2.聚聚 光光 镜镜 聚光镜用来会聚电子枪射出的电子束，聚光镜用来会聚电子枪射出的电子束，以最小的损失照明样品，调节照明强度、以最小的损失照明样品，调节照明强度、孔径角和束斑大小。一般都采用双聚光镜孔径角和束斑大小。一般都采用双聚光镜系统。第一聚光镜是强激磁透镜，束斑缩系统。第一聚光镜是强激磁透镜，束斑缩小率为小率为10105050倍左右，将电子枪
43、第一交叉倍左右，将电子枪第一交叉点束斑缩小为点束斑缩小为1 15m5m；而第二聚光镜是弱；而第二聚光镜是弱激磁透镜，适焦时放大倍数为激磁透镜，适焦时放大倍数为2 2倍左右。结倍左右。结果在样品平面上可获得果在样品平面上可获得2 210m10m的照明电的照明电子束斑。子束斑。第第76页页/共共130页页（一）电子光学系统（一）电子光学系统成像系统成像系统 电子透镜：能使电子束聚焦的装置电子透镜：能使电子束聚焦的装置 电子透镜是电镜的核心部件，其工作方电子透镜是电镜的核心部件，其工作方式是利用复杂的电极和线圈结构形成静电式是利用复杂的电极和线圈结构形成静电场和磁场。场和磁场。电子透镜存在各种像差（
44、电子透镜存在各种像差（aberration），），这是影响成像质量的主要因素。这是影响成像质量的主要因素。电子透镜电子透镜第第77页页/共共130页页电电 磁磁 透透 镜镜 的的 结结 构构 电子电子电子源电子源电子轨迹电子轨迹铜导线铜导线软铁壳软铁壳软铁壳软铁壳焦点焦点第第78页页/共共130页页(二二)真真 空空 系系 统统 主要由机械泵、油扩散泵或离子泵、主要由机械泵、油扩散泵或离子泵、联动控制阀门、真空排气管道、空气联动控制阀门、真空排气管道、空气过滤器和用于真空度指示的真空测量过滤器和用于真空度指示的真空测量规等组成。规等组成。第第79页页/共共130页页(三三)供供 电电 系系 统
45、统 供电系统包括高压电源、真供电系统包括高压电源、真空系统供电电源、透镜电源、辅空系统供电电源、透镜电源、辅助电源及安全保护系统的电源等。助电源及安全保护系统的电源等。第第80页页/共共130页页(四四)机机 械械 系系 统统 机械系统包括电镜座、标本室、机械系统包括电镜座、标本室、磁屏蔽外壳、镜筒、制冷系统及控制磁屏蔽外壳、镜筒、制冷系统及控制工作台等，这些部分都有着相当高的工作台等，这些部分都有着相当高的性能。性能。第第81页页/共共130页页(五五)观观 察察 显显 示示 系系 统统 观察显示系统由荧光屏和照相室两部观察显示系统由荧光屏和照相室两部分组成。分组成。电镜通过显像管的荧光屏把
46、电子所成电镜通过显像管的荧光屏把电子所成的像转换成光学影像后供肉眼观察。的像转换成光学影像后供肉眼观察。电子感光板是常用的记录手段之一，电子感光板是常用的记录手段之一，可以利用照相机在照相室内拍照。可以利用照相机在照相室内拍照。第第82页页/共共130页页二、电子显微镜的分类及其应用二、电子显微镜的分类及其应用电子显微镜的电子显微镜的 （四）超高压电子显微镜（四）超高压电子显微镜 第第83页页/共共130页页（一）透（一）透 射射 电电 子子 显显 微微 镜镜（Transmission electron Microscope，TEM）第第84页页/共共130页页光镜、透射电镜和扫描电镜的工作原
47、理图光镜、透射电镜和扫描电镜的工作原理图第第85页页/共共130页页1.成成 像像 原原 理理电子束和固体样品的作用电子束和固体样品的作用第第86页页/共共130页页2.的的 工工 作作 原原 理理 透射电子显微镜是以电子束透透射电子显微镜是以电子束透过样品经过聚焦与放大后所产生的过样品经过聚焦与放大后所产生的物像，物像，投射到荧光屏上或照相底片投射到荧光屏上或照相底片上进行观察。上进行观察。透射电镜的分辨率为透射电镜的分辨率为0.10.2nm，放大倍数为几万几十万，放大倍数为几万几十万倍。倍。第第87页页/共共130页页3.的的 结结 构构 照明系统照明系统 成像系统成像系统 放大系统放大系
48、统 纪录系统纪录系统电子枪电子枪聚光镜聚光镜物镜物镜中间镜中间镜投影镜投影镜第第88页页/共共130页页3.的结构的结构成像系统成像系统 物镜是用来形成第一幅高分辨率电子物镜是用来形成第一幅高分辨率电子显微图像或电子衍射花样的透镜。透射电显微图像或电子衍射花样的透镜。透射电子显微镜分辨本领的高低主要取决于物镜。子显微镜分辨本领的高低主要取决于物镜。因为物镜的任何缺陷都被成像系统中其它因为物镜的任何缺陷都被成像系统中其它透镜进一步放大。欲获得物镜的高分辨率，透镜进一步放大。欲获得物镜的高分辨率，必须尽可能降低像差。通常采用强激磁，必须尽可能降低像差。通常采用强激磁，短焦距的物镜。短焦距的物镜。第
49、第89页页/共共130页页3.的结构的结构成像系统成像系统 中间镜是一个弱激磁的长焦距变倍透中间镜是一个弱激磁的长焦距变倍透镜，可在镜，可在0-20倍范围调节。在电镜操作倍范围调节。在电镜操作过程中，主要是利用中间镜的可变倍率过程中，主要是利用中间镜的可变倍率来控制电镜的放大倍数。来控制电镜的放大倍数。第第90页页/共共130页页3.的结构的结构成像系统成像系统 如果把中间镜的物平面和物镜的像平面如果把中间镜的物平面和物镜的像平面重合，则在荧光屏上得到一幅放大像，这就重合，则在荧光屏上得到一幅放大像，这就是电子显微镜中的成像操作。如果把中间镜是电子显微镜中的成像操作。如果把中间镜的物平面和物镜
50、的后焦面重合，则在荧光屏的物平面和物镜的后焦面重合，则在荧光屏上得到一幅电子衍射花样，这就是电子显微上得到一幅电子衍射花样，这就是电子显微镜中的电子衍射操作。镜中的电子衍射操作。第第91页页/共共130页页3.的结构的结构成像系统成像系统 投影镜的作用是把经中间镜放大（或缩小）投影镜的作用是把经中间镜放大（或缩小）的像进一步放大，并投影到荧光屏上，它和物镜的像进一步放大，并投影到荧光屏上，它和物镜一样，是一个短焦距的强磁透镜。投影镜的激磁一样，是一个短焦距的强磁透镜。投影镜的激磁电流是固定的。因为成像电子束进入投影镜时孔电流是固定的。因为成像电子束进入投影镜时孔镜角很小，因此它的景深和焦距都非
