1、第二章第二章 基因工程基因工程Gene Engineering基因工程是生物工程的基因工程是生物工程的核心技术，是最具生命核心技术，是最具生命力和最引人注目的前沿力和最引人注目的前沿学科之一。学科之一。学习要求n掌握基因工程的概念掌握基因工程的概念,DNA,DNA重组原理与技术重组原理与技术;n熟悉外源基因转入受体细胞的各种途径熟悉外源基因转入受体细胞的各种途径;n了解基因工程研究的基本技术路线，基因工程的应用。了解基因工程研究的基本技术路线，基因工程的应用。一、复习一、复习DNA、基因的概念和结构、基因的概念和结构1.DNA的组成、结构和功能的组成、结构和功能 DNA DNA由由腺嘌呤脱氧核
2、苷酸（腺嘌呤脱氧核苷酸（A A）、鸟嘌呤脱氧核）、鸟嘌呤脱氧核苷酸苷酸(G)(G)、胞嘧啶脱氧核苷酸、胞嘧啶脱氧核苷酸(C)(C)、胸腺嘧啶脱氧核、胸腺嘧啶脱氧核苷酸苷酸(T)(T)组成。组成。脱氧核苷酸由脱氧核苷酸由脱氧核糖、碱基和磷酸基脱氧核糖、碱基和磷酸基组成。组成。四种脱氧核苷酸的脱氧核糖、磷酸基的结构和四种脱氧核苷酸的脱氧核糖、磷酸基的结构和位置相同，只是各自的碱基不同。位置相同，只是各自的碱基不同。DNA的双螺旋结构的双螺旋结构 DNA两条脱氧核苷酸两条脱氧核苷酸链总是按照碱基链总是按照碱基A与与T互补互补配对和配对和G与与C互补配对的，互补配对的，通过氢键形成稳定的双螺通过氢键形
3、成稳定的双螺旋结构，称为双链旋结构，称为双链DNA。少数病毒和噬菌体中少数病毒和噬菌体中的的DNA是以单链形式存在是以单链形式存在的。的。DNA的功能的功能（1 1）DNADNA分子能在细胞内复制分子能在细胞内复制 （2 2）携带遗传信息）携带遗传信息2 2、基因的概念和结构、基因的概念和结构 基因是编码蛋白质或基因是编码蛋白质或RNARNA等具有特定功等具有特定功能产物能产物的遗传信息的基本单位，是具有的遗传信息的基本单位，是具有遗传信息一段遗传信息一段DNA序列。序列。结构：包括编码序列结构：包括编码序列(外显子外显子)、编码区前、编码区前后对于基因表达具有调控功能的序列和后对于基因表达具
4、有调控功能的序列和单个编码序列间的间隔序列单个编码序列间的间隔序列(内含子内含子)。基因是基因工程的操作对象原核生物基因结构原核生物基因结构真核生物基因结构真核生物基因结构 原核生物基因启动子相关的保守核苷酸序列原核生物基因启动子相关的保守核苷酸序列 Pribnow框或框或-10区：区：-4 -13bp之间由个核苷之间由个核苷酸组成，多数是酸组成，多数是TATAAT序列。序列。-35区：区：-35bp前后保守的前后保守的TTGACA序列。序列。动、植物基因启动子相关的保守核苷酸序列动、植物基因启动子相关的保守核苷酸序列生物生物类型类型 TATA区区（-25-30）CAAT区区（-70-80）G
5、C区区（-80-100）动物动物TATAATAGGCCAACTGCCACACCC植物植物TCTATATA13CA 或或TGTATAAA13CA CA25GNGA24CC或或 T A25TNGA24TTGGGCGGG终止子终止子(termi-nator):在基因编码区下游有一段使转在基因编码区下游有一段使转录终止的核苷酸序列。录终止的核苷酸序列。3、基因工程的概念基因工程的概念n按照按照人们的愿望人们的愿望（人为的），进行（人为的），进行严密的设计严密的设计（类似（类似工程设计），通过工程设计），通过体外体外DNA重组（重组（非生命活动过程）非生命活动过程）和和转基因转基因等技术，有目的地改造生
6、物种性，使现有的等技术，有目的地改造生物种性，使现有的物种物种在较短的时间内在较短的时间内趋于完善（区别于自然突变和常趋于完善（区别于自然突变和常规育种），创造出更符合人们需求的新的生物类型规育种），创造出更符合人们需求的新的生物类型;利用这种技术对人类疾病进行有效的诊断和治疗。利用这种技术对人类疾病进行有效的诊断和治疗。n体外体外DNA重组是基因工程的基本内容和关键技术。重组是基因工程的基本内容和关键技术。n自然界的自然界的DNA重组重组-难以预测难以预测n基因工程基因工程-按人的意志进行按人的意志进行DNA重组重组n重组重组DNA技术技术是指将一种是指将一种生物体（供体）生物体（供体）的基
7、因与的基因与载体载体在在体外进行拼接重组，然后转入另一种体外进行拼接重组，然后转入另一种生物体（受体）生物体（受体）内，内，使之按照人们的意愿稳定遗传并表达出新产物或新性状的使之按照人们的意愿稳定遗传并表达出新产物或新性状的DNA体外操作程序，也称体外操作程序，也称分子克隆技术分子克隆技术。n因此因此供体、受体、载体供体、受体、载体是重组是重组DNA技术的三大基本元件。技术的三大基本元件。二、基因工程诞生的基础二、基因工程诞生的基础n（一）理论上的三大发现（一）理论上的三大发现n1、40年代确定的遗传信息的携带者是年代确定的遗传信息的携带者是DNA而而不是蛋白质（肺炎双球菌实验）不是蛋白质（肺
8、炎双球菌实验）n2、50年代揭示的年代揭示的DNA分子的双螺旋结构模型分子的双螺旋结构模型和半保留复制机制。和半保留复制机制。n3、50年代末年代末60年代：年代：确定了遗传信息的传确定了遗传信息的传递方式递方式(密码子学说，密码子学说，中心法则中心法则)n（二）基因工程研究的理论依据（为何可对基因进行（二）基因工程研究的理论依据（为何可对基因进行切、接切、接、转、增转、增、检检操作）操作）n1 1、基因可以重组互换、基因可以重组互换n2 2、基因可切割、基因可切割n3 3、基因可转移（不同生物体之间、同一染色体上、不、基因可转移（不同生物体之间、同一染色体上、不同人染色体之间、插入到靶同人染
9、色体之间、插入到靶DNADNA中）：可把来自任何生中）：可把来自任何生物的基因转移到与其毫无关系的任何其他受体细胞中，物的基因转移到与其毫无关系的任何其他受体细胞中，可以任意改造生物的遗传特性，创造出生物的新性状可以任意改造生物的遗传特性，创造出生物的新性状 n4 4、多肽与基因之间存在对应关系、多肽与基因之间存在对应关系n5 5、遗传密码是通用的、遗传密码是通用的n6 6、基因可以通过复制把遗传信息传递给下一代：某一段、基因可以通过复制把遗传信息传递给下一代：某一段DNADNA可在受体细胞内进行复制，为制备大量纯化的可在受体细胞内进行复制，为制备大量纯化的DNADNA片段片段提供了可能提供了
10、可能（三）技术上的三大发明（三）技术上的三大发明n1 1、6060年代末年代末7070年代：年代：限制性核酸内切酶的发现限制性核酸内切酶的发现 n2 2、7070年代：年代：DNA连接酶的发现连接酶的发现n3 3、7070年代：基因工程载体的使用。年代：基因工程载体的使用。19731973年第一次实现了重组转化成功的例子。从此基年第一次实现了重组转化成功的例子。从此基因工程诞生，这年定为基因工程诞生的元年。因工程诞生，这年定为基因工程诞生的元年。三、基因工程操作的技术路线三、基因工程操作的技术路线供体细胞目的基因载体重组DNA分子转化细胞受体细胞多肽药物疫苗、抗体基因治疗基因诊断 转基因动物(
11、畜牧业、渔业 生物反应器)转基因植物(农业、林业 生物反应器)冶金、环保轻工、食品生物材料mRNARNADNAcDNA基因组文库人工合成目的基因PCR扩增酶切技术路线技术路线剪切剪切拼接拼接导入导入表达表达n第二节第二节 基因工程四大要素基因工程四大要素 工具酶工具酶 载体载体 目的基因目的基因 受体受体基因工程技术中对核酸的精雕细刻主要用酶作为工基因工程技术中对核酸的精雕细刻主要用酶作为工具具一、工具酶一、工具酶（一）限制性内切核酸酶（一）限制性内切核酸酶 1、概念、概念 一类能识别双链一类能识别双链DNADNA中特殊核苷酸序列，并在合中特殊核苷酸序列，并在合适的反应条件下使每条链一定位点上
12、的磷酸二适的反应条件下使每条链一定位点上的磷酸二酯键断开，产生具有酯键断开，产生具有3 3-OH-OH和和5 5-P-P基团的基团的DNADNA片段的内切脱氧核糖核酸酶。片段的内切脱氧核糖核酸酶。什么是限制性内切酶？由由19731973年年H.O SmithH.O Smith和和D.NathansD.Nathans提议的命名系统提议的命名系统 由三部分构成，即由三部分构成，即菌种名、菌系编号、分离顺序菌种名、菌系编号、分离顺序。n1、用属名的第一个字母（大写，斜体）和种名的头两个字母（小写，斜体）组成3个字母的略语表示寄主菌的物种名。大肠杆菌（Escherichia coli）用Eco表示；流
13、感嗜血菌（Haemophilus influenzae）用Hin表示。n2、用一个大写字母表示菌株或型。如Ecok,EcoRn3.如果一种特殊的寄主菌内有几种不同的限制与修复系统，用罗马字母表示分离到的第几个，正体书写。如EcoR I，EcoR V。命名原则？命名原则？n目前鉴定出三种不同类型的限制性内切酶nI 类限制性内切酶nII 类限制性内切酶 nIII类限制性内切酶 限制性内切酶系统的种类？限制性内切酶系统的种类？2、限制性内切核酸酶识别序列、限制性内切核酸酶识别序列n识别双链识别双链DNA分子中分子中4-8对对碱基的特定序；碱基的特定序；n大部分酶的切割位点在大部分酶的切割位点在识别序
14、列内部或两侧识别序列内部或两侧；n识别切割序列呈典型的旋转对称型识别切割序列呈典型的旋转对称型回文结构。回文结构。同裂酶：同裂酶：识别相同序列的限制酶识别相同序列的限制酶 同裂酶可以具有不同的酶切位点，也可以同裂酶可以具有不同的酶切位点，也可以具有相同的酶切位点。前者肯定是两种具有相同的酶切位点。前者肯定是两种不同的限制性内切核酸酶，而后者往往不同的限制性内切核酸酶，而后者往往是从不同生物中提取到的同一种限制性是从不同生物中提取到的同一种限制性内切核酸酶。内切核酸酶。同尾酶同尾酶 (isocaudamer)与同裂酶对应的一类限制性内切酶与同裂酶对应的一类限制性内切酶,它它们虽然来源不同，识别的
15、靶序列也各们虽然来源不同，识别的靶序列也各不相同不相同,但都但都能产生相同的粘性末端能产生相同的粘性末端,特特称为同尾酶。称为同尾酶。G A A T T CC T T A A GGC T T A A1 1、黏性末端：被限制酶切开的、黏性末端：被限制酶切开的DNADNA两条单链两条单链的切口，带有几个伸出的核苷酸，它们之间的切口，带有几个伸出的核苷酸，它们之间碱基正好互补配对。（碱基正好互补配对。（55粘性和粘性和33粘性）粘性）A A T T C G3 3、切割方式、切割方式EcoRI等酶切产生的5粘性末端5G-C-T-G-A-A-T-T-C-G-A-G33C-G-A-C-T-T-A-A-G-
16、C-T-C5EcoRI 375G-C-T-G-OH P-A-A-T-T-C-G-A-G33C-G-A-C-T-T-A-A-P HO-G-C-T-C5PstI等酶切产生的3粘性末端5G-C-T-C-T-G-C-A-G-G-A-G33C-G-A-G-A-C-G-T-C-C-T-C5PstI 375G-C-T-C-T-G-C-A-OH P-G-G-A-G33C-G-A-G-P HO-A-C-G-T-C-C-T-C5PvuII等酶切产生的平末端5G-C-T-C-A-G-C-T-G-G-A-G33C-G-A-G-T-C-G-A-C-C-T-C5P 375G-C-T-C-A-G-OH P-C-T-G-G-
17、A-G33C-G-A-G-T-C-P HO-G-A-C-C-T-C54、限制性内切核酸酶反应系统限制性内切核酸酶反应系统n反应底物反应底物n内切酶内切酶n反应缓冲液反应缓冲液n适当的温度适当的温度5、酶切方法单酶切方法单酶切方法q一个酶切反应体系一个酶切反应体系（20L20L）：）：无菌重蒸水：无菌重蒸水：13L13L，缓冲液（缓冲液（1010）：）：2L2L底物底物DNADNA：4L4L酶液：酶液：1L1L总体积为总体积为20L20L。离心离心2S2S保温保温1-3h1-3h（3030度或度或3737度）度）终止反应终止反应（6565水浴中保温水浴中保温10-10-15min15min，或乙
18、醇沉淀处，或乙醇沉淀处理，或者先用酚处理后再理，或者先用酚处理后再用乙醇沉淀处理除去酶蛋用乙醇沉淀处理除去酶蛋白。）白。）双酶切法双酶切法n两种不同的酶切割同一种两种不同的酶切割同一种DNADNA分子的方法。分子的方法。q（）分别酶切（）分别酶切q（）同时酶切（）同时酶切q先后加入酶：先后加入酶：适于酶的稳定性不好的酶；需不同温度的适于酶的稳定性不好的酶；需不同温度的酶。酶。q同时加入酶：同时加入酶：适于酶的热稳定性强，则两种酶同时加入适于酶的热稳定性强，则两种酶同时加入反应系统，待最适反应温度低的那种限制性核酸内切酶反应系统，待最适反应温度低的那种限制性核酸内切酶完全切割后，升温到第二种酶的
19、最适反应温度完成第二完全切割后，升温到第二种酶的最适反应温度完成第二种酶的完全切割。种酶的完全切割。n完全消化（完全酶切）：完全消化（完全酶切）：内切酶在内切酶在DNADNA上的所有识别位点都被上的所有识别位点都被切开。切开。n部分酶切法（不完全酶切）：部分酶切法（不完全酶切）：只有有限数量的酶切位点被切开。只有有限数量的酶切位点被切开。n部分酶切的原因：部分酶切的原因：底物底物DNADNA的纯度低；的纯度低；识别序列的甲基化；识别序列的甲基化；酶用量的不足以及反应缓冲液和温度不适宜；酶用量的不足以及反应缓冲液和温度不适宜；反应时间不足等。反应时间不足等。（若要想部分酶切的话，则可通过缩短保温
20、时间、降低反应温度（若要想部分酶切的话，则可通过缩短保温时间、降低反应温度或减少酶的用量可达到局部消化的目的。）或减少酶的用量可达到局部消化的目的。）(二二)DNA)DNA连接酶（连接酶（DNA ligase）能催化双链能催化双链DNADNA片段紧靠在一起的片段紧靠在一起的 3OH3OH末端与末端与 5 5PP末末端之间形成磷酸二酯键，使两末端连接。端之间形成磷酸二酯键，使两末端连接。两种两种DNADNA连接酶连接酶n（1 1）大肠杆菌连接酶：只能连接粘性末端）大肠杆菌连接酶：只能连接粘性末端n（2 2）T4T4噬菌体的连接酶：连接粘性末端、齐噬菌体的连接酶：连接粘性末端、齐平末端平末端功用：
21、功用：DNADNA重组中促使载体与重组中促使载体与DNADNA连接连接具互补粘性末端片段之间的连接具平末端DNA片段之间的连接DNA片段末端修饰后进行连接DNA片段加连杆后或加衔接头连接 u基因克隆载体的含义基因克隆载体的含义能够承载外源基因，并将其带入受体细胞得以相对稳定维持能够承载外源基因，并将其带入受体细胞得以相对稳定维持的的DNADNA分子称为基因克隆载体（分子称为基因克隆载体（gene cloning vectorgene cloning vector）。）。u基因克隆载体应具备的基本条件基因克隆载体应具备的基本条件具有具有1 1个或多个克隆位点。个或多个克隆位点。进入受体细胞后，一
22、般是能够以不同的形式进行复制。进入受体细胞后，一般是能够以不同的形式进行复制。含有供选择克隆子的标记基因。含有供选择克隆子的标记基因。克隆载体必须是安全的。克隆载体必须是安全的。二、二、基因克隆载基因克隆载体体载体的功能载体的功能n运送外源基因运送外源基因高效高效转入受体细胞转入受体细胞n为外源基因提供复制能力或整合能力为外源基因提供复制能力或整合能力n为外源基因的为外源基因的扩增或表达扩增或表达提供必要的条件提供必要的条件u克隆载体种类克隆载体种类按构建克隆载体的材料来源分按构建克隆载体的材料来源分:质粒克隆载体、病毒（噬菌体）克隆载体、线粒体克隆质粒克隆载体、病毒（噬菌体）克隆载体、线粒体
23、克隆载、人工染色体克隆载体、叶绿体克隆载体载、人工染色体克隆载体、叶绿体克隆载体.按克隆载体的用途分按克隆载体的用途分:一般克隆载体、表达载体、建库载体、一般克隆载体、表达载体、建库载体、T或或U载体载体 .按克隆载体的受体生物分按克隆载体的受体生物分:l原核生物克隆载体原核生物克隆载体 大肠杆菌克隆载体、放线菌克隆载体大肠杆菌克隆载体、放线菌克隆载体.l真核生物克隆载体真核生物克隆载体 酵母克隆载体、植物克隆载体、动物克隆酵母克隆载体、植物克隆载体、动物克隆 载体载体、人克隆载体、人克隆载体.u克隆载体种类克隆载体种类含义：含义：以质粒以质粒DNA分子为基础构建的克分子为基础构建的克隆载体，
24、必须含有质粒的复制起始位点。隆载体，必须含有质粒的复制起始位点。种类：种类：大肠杆菌质粒载体大肠杆菌质粒载体 蓝藻穿梭质粒载体蓝藻穿梭质粒载体 农杆菌农杆菌Ti质粒载体质粒载体 酵母酵母2m质粒载体质粒载体 .1 1、质粒克隆载体（重点掌握）质粒克隆载体（重点掌握）质粒DNA质粒载体的一般特征染色体DNA质粒DNA1plasmid4036bpORi抗 生 素 抗 性 基 因控 制 质 粒 转 移 的 基 因大肠杆菌细胞质粒的改造构建质粒的改造构建n删除非必需区删除非必需区：减小质粒的分子量，提高外源减小质粒的分子量，提高外源DNADNA的装载量的装载量(一般来说，大于一般来说，大于20kb20
25、kb的质粒很难导入受的质粒很难导入受体细胞体细胞)n加入新的遗传标记基因加入新的遗传标记基因。n引入具有多种限制酶识别及切割位点的引入具有多种限制酶识别及切割位点的DNADNA序列：序列：即多克隆位点即多克隆位点(multiple cloning sites(multiple cloning sites，MCS)MCS)。n插入特殊的基因表达调控序列。插入特殊的基因表达调控序列。PBR322 PBR322 由大肠杆菌源由大肠杆菌源质粒质粒Col ElCol El衔生的质衔生的质粒粒pMBlpMBl作为出发质粒作为出发质粒构建而成含有构建而成含有Col ElCol El复制起始位点复制起始位点(
26、Col-(Col-ori)ori)，能在大肠杆菌，能在大肠杆菌细胞中高拷贝复制。细胞中高拷贝复制。蓝藻穿梭质粒载体蓝藻穿梭质粒载体穿梭载体（穿梭载体（shuttle shuttle vectorvector）:是指在两种不是指在两种不同的生物中复制的载体。同的生物中复制的载体。蓝藻穿梭质粒载体：蓝藻穿梭质粒载体：既既有大肠杆菌质粒载体必有大肠杆菌质粒载体必备元件，还含有蓝藻的备元件，还含有蓝藻的复制起始位点。复制起始位点。农杆菌农杆菌Ti质粒质粒致癌农杆菌致癌农杆菌(Agrobacterium tumefaciens)含有一种内源质含有一种内源质粒，当农杆菌同植物接触时，粒，当农杆菌同植物接触
27、时，这种质粒会引发植物产生肿这种质粒会引发植物产生肿瘤瘤(冠瘿瘤冠瘿瘤)，所以称此质粒为，所以称此质粒为 Ti 质粒质粒(tumor in-ducing plasmid)几乎所有的酿酒酵母菌中几乎所有的酿酒酵母菌中都存在一种质粒，即都存在一种质粒，即 2m2m质粒；质粒；构建了一系列用于酵母转构建了一系列用于酵母转基因的质粒载体，一般也基因的质粒载体，一般也构建成穿梭质粒载体，含构建成穿梭质粒载体，含有有 2m 2m 质粒的复制起始位质粒的复制起始位点和大肠杆菌源质粒的复点和大肠杆菌源质粒的复制起始位点。制起始位点。含义含义 以病毒（噬菌体）以病毒（噬菌体）DNA或或cDNA为主构建为主构建的
28、克隆载体，或者通过转染直接进入宿主细胞，或的克隆载体，或者通过转染直接进入宿主细胞，或者包装成病毒颗粒后通过转导进入宿主细胞。者包装成病毒颗粒后通过转导进入宿主细胞。种类种类 噬菌体克隆载体：噬菌体克隆载体：噬菌体克隆载体噬菌体克隆载体 Cosmid载体载体 植物病毒克隆载体：植物病毒克隆载体：CaMV克隆载体克隆载体 动物病毒克隆载体：动物病毒克隆载体：痘苗病毒载体痘苗病毒载体 腺病毒载体腺病毒载体 反转录病毒克隆载体反转录病毒克隆载体2、病毒（噬菌体）克隆载体病毒（噬菌体）克隆载体噬菌体克隆载体噬菌体克隆载体 nDNA在噬菌体中以线状双链在噬菌体中以线状双链 DNA分子存在，分子存在，全长
29、全长 48 502bp。其左右两端各有。其左右两端各有 12 个核苷个核苷酸组成的酸组成的 5凸出黏性末端凸出黏性末端(cohesive end)，而，而且两者的核苷酸序列互补，进入宿主细胞后，且两者的核苷酸序列互补，进入宿主细胞后，黏性末端连接成为环状黏性末端连接成为环状 DNA 分子。把此末端分子。把此末端称为称为 COS位点位点(cohesive end site)。构建构建噬菌体克隆载体的策略噬菌体克隆载体的策略n用合适的限制性内切核酸酶切去 DNA 上的部分或全部非必需区，相应保留这种酶的 1个或 2 个识别位点作为克隆位点，并用点突变或甲基化酶处理等方法使必需区内的这种酶的识别序列
30、失效，避免外源 DNA片段插入必需区；n若有必要可在非必需区组人选择标记基因；n构建的 DNA 载体不应小于 364kb入噬菌体载体入噬菌体载体 gtwes-B 粘粒（粘粒（Cosmid）载体载体组成：组成：质粒复制原点、抗药基质粒复制原点、抗药基因、多克隆位点、已连接入的因、多克隆位点、已连接入的DNAcos位点；位点；包装范围：包装范围：29.9-45kb大片段；大片段；用途：用途：构建基因组文库。构建基因组文库。痘苗病毒载体示意图痘苗病毒载体示意图3 3 人工染色体载体人工染色体载体大大DNADNA片段克隆载体片段克隆载体（1）含义含义：指能在宿主细胞中稳定地复制并准确指能在宿主细胞中稳
31、定地复制并准确 传递给子细胞的人工构建的染色体。传递给子细胞的人工构建的染色体。（2）特点：特点：能容纳长达能容纳长达 1000kb1000kb以上的外源以上的外源DNADNA片段。片段。（3）用途：）用途：构建基因组文库构建基因组文库,克隆和转移完整的高分克隆和转移完整的高分 子量基因子量基因,基因功能鉴定基因功能鉴定,基因治疗基因治疗 （4 4）类型：）类型：u线形的人工染色体：线形的人工染色体：必须含有端粒、着丝粒和必须含有端粒、着丝粒和 复制起始区。复制起始区。包含：酵母人工染色体（包含：酵母人工染色体（YAC)YAC)人类人工染色体（人类人工染色体（HAC)HAC)哺乳动物人工染色体
32、（哺乳动物人工染色体（MAC)MAC)u环形的人工染色体：环形的人工染色体：不需要端粒和着丝粒，但必须不需要端粒和着丝粒，但必须 含有合适的复制起始区。含有合适的复制起始区。包含：细菌人工染色体包含：细菌人工染色体(BAC)(BAC)源于噬菌体源于噬菌体1 1的人工染色体的人工染色体(PAC)(PAC)双元细菌人工染色体双元细菌人工染色体(BIBAC)(BIBAC)可转化人工染色体可转化人工染色体(TAC)(TAC)三、目的基因三、目的基因n（一）定义：（一）定义：n目的基因含义：指已被或欲被分离、改造、扩目的基因含义：指已被或欲被分离、改造、扩增和表达的特定基因或增和表达的特定基因或DNAD
33、NA片段，能编码某一片段，能编码某一产物或某一性状。产物或某一性状。n（二）来源（二）来源 ：来源于各种生物，其中主要是来源于各种生物，其中主要是真核生物如人和动物。真核生物如人和动物。基本步骤：基本步骤：na.a.从供体基因组从供体基因组DNADNA产生适当大小的产生适当大小的DNADNA片段片段 nb.b.在体外将这些在体外将这些DNADNA片段同适当的片段同适当的噬菌体连接噬菌体连接成重组分子成重组分子 nc.c.转化到大肠杆菌的受体细胞中去转化到大肠杆菌的受体细胞中去 nd.d.从转化子克隆群体中挑选出含有目的基因的片从转化子克隆群体中挑选出含有目的基因的片段。（方法同从段。（方法同从
34、cDNAcDNA基因文库中获得目的基因）基因文库中获得目的基因）四、受体细胞四、受体细胞n1 1、含义：、含义：n所谓基因克隆的受体细胞，从实验技术上讲是能摄取所谓基因克隆的受体细胞，从实验技术上讲是能摄取外源外源DNADNA（基因）并使其稳定维持的细胞；从实验目的（基因）并使其稳定维持的细胞；从实验目的上讲是有应用价值和理论研究价值的细胞。上讲是有应用价值和理论研究价值的细胞。n2 2、种类：、种类：n原核生物细胞、植物细胞和动物细胞可以作为受体细原核生物细胞、植物细胞和动物细胞可以作为受体细胞，但不是所有细胞都可以作为受体细胞。最好的是胞，但不是所有细胞都可以作为受体细胞。最好的是原核生物
35、细胞。原核生物细胞。n原因：原因：n大部分原核生物没有纤维素组成的坚硬细胞壁，便于大部分原核生物没有纤维素组成的坚硬细胞壁，便于外源外源DNADNA的进入的进入 n没有核膜，染色体没有核膜，染色体DNADNA没有固定结合的蛋白质，这为外没有固定结合的蛋白质，这为外源源DNADNA与裸露的染色体与裸露的染色体DNADNA重组减少麻烦重组减少麻烦 n基因组小，遗传背景简单，并且不含线粒体和叶绿体基因组小，遗传背景简单，并且不含线粒体和叶绿体基因组，便于对引入的外源基因进行遗传分析基因组，便于对引入的外源基因进行遗传分析 n原核生物多为单细胞生物，容易获得一致性的实验材原核生物多为单细胞生物，容易获
36、得一致性的实验材料并且培养简单，繁殖迅速，实验周期短，重复实验料并且培养简单，繁殖迅速，实验周期短，重复实验快快第三节第三节 基因工程技术路线基因工程技术路线目的基因的获得（分离目的基因）目的基因的获得（分离目的基因）目的基因和载体的连接目的基因和载体的连接DNADNA重组重组 重组重组DNADNA导入受体细胞导入受体细胞筛选与鉴定克隆子（目的基因）筛选与鉴定克隆子（目的基因）目的基因表达目的基因表达一、一、分离目的基因的途径分离目的基因的途径1、利用限制性内切核酸酶酶切法直接分离目的基因利用限制性内切核酸酶酶切法直接分离目的基因 PCR扩增含目的基因DNA示意2 2、利用利用PCRPCR直接
37、扩增目的基因直接扩增目的基因nPCRPCR技术是基因扩增技术的一次重大革新技术是基因扩增技术的一次重大革新-19851985年美国年美国Cetus Cetus 公司的公司的MillisMillis等研制，于等研制，于19931993年获诺贝尔化学奖。年获诺贝尔化学奖。什么是什么是PCRPCR（聚合酶链式反应）（聚合酶链式反应）n即在体外选择性地将即在体外选择性地将DNADNA某个特殊区域扩增出来的某个特殊区域扩增出来的技术。技术。n所用的仪器是所用的仪器是PCRPCR仪。仪。n（1 1）PCRPCR的原理的原理 ：n PCRPCR技术的原理并不复杂，实质为体内技术的原理并不复杂，实质为体内DN
38、ADNA复制的体外模拟。复制的体外模拟。当双链当双链DNADNA变性为单链后，变性为单链后，DNADNA聚合酶以单链聚合酶以单链DNADNA为模板，并为模板，并利用反应混合物的四种利用反应混合物的四种dNTPsdNTPs，以与模板互补的核苷酸为引，以与模板互补的核苷酸为引物，合成新生的物，合成新生的DNADNA互补链。互补链。nPCRPCR技术能快速特异地扩增所希望的目的基因或技术能快速特异地扩增所希望的目的基因或DNADNA片段，并片段，并能很容易地使微微克（能很容易地使微微克（pgpg）水平的起始物达到微克（）水平的起始物达到微克（gg）水平的量。水平的量。n现已发展成为生命科学实验室获取
39、某一目的现已发展成为生命科学实验室获取某一目的DNADNA片段的常规片段的常规技术，并逐渐被应用于各个领域。技术，并逐渐被应用于各个领域。20-35 cycles72 5-7 min4 12 h-更长时间72 1-3 min94 -96 0.5-1 min92 -96 4-6 min60 -37 0.5-1 min变性使双链变为单链退火使复性-引物与模板DNA结合Tac聚合酶使延伸nPCR扩增的步骤扩增的步骤（2 2）PCRPCR反应体系反应体系水水 18(18(l)l)dNTPdNTP（原料）（原料）2 2 Primer1Primer1（引物）（引物）0.50.5Primer2Primer2
40、（引物）（引物）0.50.5DNADNA分子（模板）分子（模板）1 1Mg2+Mg2+（酶的辅助因子，（酶的辅助因子，1010bufferbuffer）2.52.5TaqTaq酶（酶（DNADNA聚合酶）聚合酶）0.50.5总体积总体积 2525 l l（3 3）PCRPCR的特点的特点n灵敏度高PCR产物每轮循环增加一倍，30轮循环扩增量达230个拷贝n特异性强特异性强引物的序列及其与模板结合的特异性是决定引物的序列及其与模板结合的特异性是决定PCRPCR反应结果的关键。反应结果的关键。引物设计的基本原则是最大限度地提高扩增引物设计的基本原则是最大限度地提高扩增效率和特异性效率和特异性,同时
41、尽可能减少非特异性扩增。同时尽可能减少非特异性扩增。n简便、快速、重复性好简便、快速、重复性好一次性加好反应液，2-4小时完成扩增n对标本的纯度要求低对标本的纯度要求低血液、体腔液、洗嗽液、毛发、细胞、活组织等组织的粗提DNA3 3、目的基因的合成、目的基因的合成 实际上是实际上是DNADNA片断的化学合成，不同的是组成基因的片断的化学合成，不同的是组成基因的DNADNA片段一般比较长，是将化学合成的片段一般比较长，是将化学合成的200bpDNA200bpDNA片段采片段采用全片段酶促连接法等组装成为含完整目的基因的用全片段酶促连接法等组装成为含完整目的基因的DNADNA片段。片段。步骤：步骤
42、：n合成引物合成引物 n合成合成DNADNA寡核苷酸连杆寡核苷酸连杆 n合成基因片断合成基因片断 nDNADNA片断的连接重组，采用片断的连接重组，采用DNADNA片段的连接酶有片段的连接酶有E.coli DNA E.coli DNA、T4DNAT4DNA连接酶连接酶3 3、目的基因的化学合成目的基因的化学合成4 4、通过构建基因组文库或、通过构建基因组文库或cDNAcDNA文文库分离的基因库分离的基因首先构建基因组文库或首先构建基因组文库或cDNA文库；文库；再从再从cDNA基因文库中获得目的基因。基因文库中获得目的基因。含义含义 n cDNA（complementary DNA)指由指由m
43、RNA通通过反转录酶进行反转录而成。过反转录酶进行反转录而成。ncDNA（complementary DNA)文库文库：某种生物：某种生物基因组转录的全部基因组转录的全部mRNA经反转录产生的各种经反转录产生的各种cDNA片段分别与克隆载体重组，储存在一种片段分别与克隆载体重组，储存在一种受体菌克隆子群体中，这样的群体称为受体菌克隆子群体中，这样的群体称为cDNA文库。文库。n基因组文库（基因组文库（gene library(bank),genomic library):是指将真核生物的染色体组或原核生是指将真核生物的染色体组或原核生物的基因组切成许多片段，分别连接到载体物的基因组切成许多片段
44、，分别连接到载体（噬菌体或粘粒）上，经体外包装，侵染大肠（噬菌体或粘粒）上，经体外包装，侵染大肠杆菌后形成的克隆群体。它包含某一生物的全杆菌后形成的克隆群体。它包含某一生物的全部或大部分染色体组，其中的每一克隆仅含有部或大部分染色体组，其中的每一克隆仅含有某一生物基因组的一个片段。某一生物基因组的一个片段。构建构建cDNA文库文库构建基因组文库构建基因组文库n从基因组或从基因组或cDNA文库中获得目的基因文库中获得目的基因根据目的基因已知核苷酸序列进行筛选：根据目的基因已知核苷酸序列进行筛选：用已知的核苷用已知的核苷酸序列制成核酸探针，对酸序列制成核酸探针，对cDNA基因文库的一系列克隆子基因
45、文库的一系列克隆子进行杂交，能杂交的克隆子就含有目的基因进行杂交，能杂交的克隆子就含有目的基因(后面介绍后面介绍)根据目的基因特异性表达进行分离：根据目的基因特异性表达进行分离：有的基因只有在某有的基因只有在某生物的特定生长发育阶段或特定的器官中才能表达生物的特定生长发育阶段或特定的器官中才能表达 二、二、DNADNA片段和载体的连接片段和载体的连接重组体重组体DNADNA1 1、载体的选择和构建、载体的选择和构建 n如质粒、温和噬菌体等，如质粒、温和噬菌体等，n选择：根据实验的目的来选择。如果要获得大量的高选择：根据实验的目的来选择。如果要获得大量的高纯度的纯度的DNADNA片段，则选具有高
46、拷贝的质粒载体：片段，则选具有高拷贝的质粒载体：ColE1ColE1、PMB1PMB1、PMB9PMB9等松弛型复制子质粒。等松弛型复制子质粒。2 2、载体与目的基因的链接（、载体与目的基因的链接（DNADNA连接酶）连接酶）3 3、DNADNA重组类型重组类型n插入重组：插入重组：即外源即外源DNADNA插入到另一插入到另一DNADNA分子中。外源分子中。外源DNADNA的的两末端与接受载体的两末端与接受载体的DNADNA（只有一个识别位点）两末端都（只有一个识别位点）两末端都相同，且会产两种重组相同，且会产两种重组DNADNA分子。分子。n置换重组：置换重组：每种重组每种重组DNADNA分
47、子中，对于接受外源分子中，对于接受外源DNADNA片段片段来说，部分序列已被外源来说，部分序列已被外源DNADNA片段置换，因此称为置换重片段置换，因此称为置换重组。外源组。外源DNADNA的两末端与接受载体的的两末端与接受载体的DNADNA（有两个识别位（有两个识别位点）两末端都相同，会产点）两末端都相同，会产4 4种重组种重组DNADNA分子。分子。三、重组体三、重组体DNADNA导入受体细胞导入受体细胞n受体受体:原核生物细胞、真核生物细胞原核生物细胞、真核生物细胞 原核生物细胞：大肠杆菌原核生物细胞：大肠杆菌 真核生物细胞：酵母真核生物细胞：酵母 n导入方法：目前有很多种方法，但采用哪
48、一种导入方法：目前有很多种方法，但采用哪一种应根据选用的载体系统和受体细胞类型而定应根据选用的载体系统和受体细胞类型而定 1 1、外源、外源DNADNA转化方法转化方法 通过生物学、物理学和化学等方法使外源裸露通过生物学、物理学和化学等方法使外源裸露 DNA进入受体细胞，并在受体细胞内稳定维持进入受体细胞，并在受体细胞内稳定维持和表达的过程称为转化。和表达的过程称为转化。三、三、重组重组DNADNA分子导入受体细胞分子导入受体细胞主要包括以下几种方法：主要包括以下几种方法：直接转化法直接转化法化合物诱导转化法化合物诱导转化法结合转化法结合转化法电穿孔转化法电穿孔转化法微弹轰击转化法微弹轰击转化
49、法激光微束穿孔转化法激光微束穿孔转化法 2 2、病毒病毒(噬菌体噬菌体)颗粒转导法颗粒转导法用病毒用病毒(噬菌体噬菌体)的的 DNADNA（或（或cDNAcDNA）构建成）构建成重组重组DNADNA，在体外包装成重组病毒，在体外包装成重组病毒(噬菌体噬菌体)颗粒，通过感染使重组颗粒，通过感染使重组DNADNA进入受体细胞。进入受体细胞。方式：方式：重组病毒直接感染受体细胞重组病毒直接感染受体细胞重组病毒同另一辅助病毒一起感染受体细胞重组病毒同另一辅助病毒一起感染受体细胞重组病毒感染互补型受体细胞系重组病毒感染互补型受体细胞系适用：适用：主要用于基因组文库或主要用于基因组文库或cDNA文库的构建
50、和动文库的构建和动植物的转基因。植物的转基因。四、筛选与鉴定克隆子（目的基因）四、筛选与鉴定克隆子（目的基因）基本概念：基本概念：q克隆子：通常将摄取外源克隆子：通常将摄取外源DNADNA分子并能使该分子分子并能使该分子在其中稳定维持的受体细胞统称克隆子。也叫在其中稳定维持的受体细胞统称克隆子。也叫转化子。转化子。q重组子：含重组重组子：含重组DNADNA分子（含目的基因）的克隆分子（含目的基因）的克隆子称重组子。子称重组子。（一）克隆子的筛选方法：（一）克隆子的筛选方法：n1 1、根据载体选择的、根据载体选择的标记基因标记基因筛选转化子筛选转化子 方法：将转化处理后的受体细胞接种在含适量方法
