1、第七章第七章 植物快速繁殖和脱毒植物快速繁殖和脱毒 英东生命科学学院英东生命科学学院白音白音愈伤组织愈伤组织根、芽根、芽诱导培养诱导培养离体的植物器官、组织或细胞离体的植物器官、组织或细胞完整植株完整植株外植体外植体脱分化脱分化再分化再分化分化培养分化培养选择优良母株选择优良母株外植体表面消毒、接种外植体表面消毒、接种移苗入土和入圃移苗入土和入圃植物组织植物组织培养过程培养过程炼苗、驯化炼苗、驯化 生长素、生长素、细胞分裂素细胞分裂素7.27.2茎尖茎尖培养脱毒培养脱毒7.17.1植物快速繁殖植物快速繁殖的途径和方法的途径和方法7.57.5脱毒后防脱毒后防病毒再感染病毒再感染7.37.3茎尖以
2、外茎尖以外其他途径脱毒其他途径脱毒(学生自学学生自学)7.47.4脱毒苗的鉴定脱毒苗的鉴定主要内容主要内容7.1 7.1 植物快速繁殖的途径和方法植物快速繁殖的途径和方法概念：概念：利用离体培养技术，将来自优良植利用离体培养技术，将来自优良植株的器官、组织和细胞进行离体培养，在短株的器官、组织和细胞进行离体培养，在短期内获得大量遗传性一致的个体的方法（技期内获得大量遗传性一致的个体的方法（技术）称术）称快速繁殖快速繁殖rapid clone propagation（无性繁殖（无性繁殖propagation in vitro或微繁微繁micropropagation），由于这，由于这种繁殖方式繁
3、殖数量大、速度快，因此也称种繁殖方式繁殖数量大、速度快，因此也称离体快速无性繁殖。离体快速无性繁殖。植物快速繁殖的类型植物快速繁殖的类型器官型器官型器官发生型器官发生型胚状体发生型胚状体发生型原球茎型原球茎型离体快速离体快速繁殖的程序繁殖的程序 无菌培养物的建立无菌培养物的建立培养物的增殖培养物的增殖 生根培养生根培养炼苗和移栽炼苗和移栽鉴定（细胞学或形态学）鉴定（细胞学或形态学）植物快速繁殖的应用植物快速繁殖的应用 扩大繁殖珍稀植物资源和育种原始材料。扩大繁殖珍稀植物资源和育种原始材料。扩大繁殖经济效益高、但难于繁殖的植物。扩大繁殖经济效益高、但难于繁殖的植物。用于有性繁殖变异范围大而自然条
4、件下又不用于有性繁殖变异范围大而自然条件下又不 易无性繁殖的植物。易无性繁殖的植物。用于自然繁殖极易感染病毒的植物。用于自然繁殖极易感染病毒的植物。繁殖销售量大、但一时用常规（分株、扦插、繁殖销售量大、但一时用常规（分株、扦插、播种）方法，难以满足数量上需要的植物。播种）方法，难以满足数量上需要的植物。7.2 7.2 茎尖培养脱毒茎尖培养脱毒植物脱毒（植物脱毒（virus eliminationvirus elimination）：）：利用利用植物组织培养技术，脱除植物细胞中浸染植物组织培养技术，脱除植物细胞中浸染的病毒，生产健康的繁殖材料。的病毒，生产健康的繁殖材料。7.2.1 认识病毒认识
5、病毒 特点特点 生活周期生活周期植物病毒侵染寄主的主要途径植物病毒侵染寄主的主要途径 农业操作时的机械微伤农业操作时的机械微伤 介体（昆虫、螨、线虫、真菌等）介体（昆虫、螨、线虫、真菌等）造成的微伤造成的微伤 通过嫁接、菟丝子通过嫁接、菟丝子“桥接桥接”传播传播香蕉束顶病香蕉束顶病马铃薯病马铃薯病毒毒病毒的危害：产量降低、品质退化病毒的危害：产量降低、品质退化柑橘黄龙病柑橘黄龙病植物患病毒病后主要表现三类症状植物患病毒病后主要表现三类症状 因叶绿体被破坏或不能合成新的叶因叶绿体被破坏或不能合成新的叶绿素而引起花叶、黄化或红化等症状。绿素而引起花叶、黄化或红化等症状。植株发生矮化、丛生或畸形等。
6、植株发生矮化、丛生或畸形等。形成枯斑或坏死等症状。形成枯斑或坏死等症状。病毒在植物体内的运转方式病毒在植物体内的运转方式长距离运转，通过寄主植物韧长距离运转，通过寄主植物韧皮部的输导组织随着营养输送皮部的输导组织随着营养输送进行转移进行转移,速度很快。一旦病速度很快。一旦病毒进入韧皮部，运转速度突然毒进入韧皮部，运转速度突然增快。例如：水稻条纹叶枯病增快。例如：水稻条纹叶枯病毒运转速度为毒运转速度为25cm/h25cm/h。从细胞到细胞的短距离运转，经从细胞到细胞的短距离运转，经过细胞间的胞间连丝向邻近细胞过细胞间的胞间连丝向邻近细胞中扩散，速度很慢。烟草普通花中扩散，速度很慢。烟草普通花叶病
7、毒运转速度为叶病毒运转速度为6-13m/h6-13m/h。病毒在植物体内的分布病毒在植物体内的分布病毒在植物体内成不均病毒在植物体内成不均匀分布，越靠近生长点匀分布，越靠近生长点的部位，病毒含量越低，的部位，病毒含量越低，生长点（约生长点（约0.1-1.0mm0.1-1.0mm区域）则几乎不含或含区域）则几乎不含或含病毒很少。病毒很少。分生组织能逃避病毒分生组织能逃避病毒的侵染，可能的原因是：的侵染，可能的原因是：分生组织中不分生组织中不存在维管束系统存在维管束系统“病毒钝病毒钝化系统化系统”茎尖中存在茎尖中存在高水平内源高水平内源生长素生长素旺盛分裂的旺盛分裂的分生组织中，分生组织中，代谢活
8、性很高代谢活性很高分生组织分生组织分化速度大于分化速度大于病毒传播速度病毒传播速度茎尖生长活跃茎尖生长活跃 依据：依据：病毒在植物体病毒在植物体内分布是不均一的，越内分布是不均一的，越接近生长点，病毒浓度接近生长点，病毒浓度越稀，因此有可以采用越稀，因此有可以采用小的茎尖离体培养而脱小的茎尖离体培养而脱除植物病毒。除植物病毒。7.2.2 植物茎尖培养脱毒法植物茎尖培养脱毒法原理：原理：已知病毒是已知病毒是DNADNA大分子，病毒侵大分子，病毒侵染植物后可进入植物细胞。当植物细胞染植物后可进入植物细胞。当植物细胞分裂时，病毒分裂时，病毒DNADNA随着复制。植物细胞分随着复制。植物细胞分裂和病毒
9、繁殖之间存在相互竞争，在迅裂和病毒繁殖之间存在相互竞争，在迅速分裂的植物细胞中，是正常核蛋白合速分裂的植物细胞中，是正常核蛋白合成占优势，而在植物细胞伸长期间，是成占优势，而在植物细胞伸长期间，是病毒核蛋白合成占优势。病毒核蛋白合成占优势。无病毒无病毒苗的获得苗的获得 幼苗茎尖的幼苗茎尖的cmcm小段小段冲洗冲洗1h1h左右左右表面消毒表面消毒在双筒解剖镜下剥去幼叶，露出圆滑的生长点在双筒解剖镜下剥去幼叶，露出圆滑的生长点注射器针头或解剖针，切取带有注射器针头或解剖针，切取带有1 12 2个叶原基的生长点个叶原基的生长点培养基培养基(或或white)white)表面消毒剂、无菌水表面消毒剂、无
10、菌水接种接种培养培养茎尖剥离茎尖剥离组织培养组织培养选择优良母株选择优良母株 同一种病毒在不同植物体内分布部位不同同一种病毒在不同植物体内分布部位不同茎原基所带叶原基的数目与茎原基所带叶原基的数目与生长点（茎尖）大小的相关性生长点（茎尖）大小的相关性 例：苹果例：苹果 茎原基茎原基 0.050.050.08mm0.08mm 茎原基带茎原基带2 2片叶原基片叶原基 0.10.10.2mm0.2mm 茎原基带茎原基带4 4片叶原基片叶原基 0.30.30.4mm0.4mm 茎原基带茎原基带6 6片叶原基片叶原基 0.60.60.8mm0.8mm茎尖培养法脱除植物病毒的技术关键茎尖培养法脱除植物病毒
11、的技术关键 不同病毒种类在同一种植物中分布部位不同不同病毒种类在同一种植物中分布部位不同 马铃薯：马铃薯：马铃薯卷叶病毒、马铃薯卷叶病毒、Y Y病毒：病毒：1.01.03.0mm3.0mm以内的茎尖中以内的茎尖中 X X病毒：病毒：0.20.20.5mm0.5mm以内的茎尖中以内的茎尖中 G G病毒：病毒：0.20.20.3mm0.3mm以内的茎尖中以内的茎尖中 S S病毒：病毒：0.2mm0.2mm以下以下 说明取茎尖培养时，培养不同大小茎尖，所脱除说明取茎尖培养时，培养不同大小茎尖，所脱除 的病毒种类不同。的病毒种类不同。茎尖越小对培养基的要求越高，成功率越低茎尖越小对培养基的要求越高，成
12、功率越低 茎尖越小，茎尖内营养、水分越难长时间茎尖越小，茎尖内营养、水分越难长时间维持。因此对培养基营养组成，渗透压、酸碱维持。因此对培养基营养组成，渗透压、酸碱度、激素种类及浓度要求也就越高。茎尖越小，度、激素种类及浓度要求也就越高。茎尖越小，剥离技术要求越高。剥离技术要求越高。总之，采用茎尖培养脱毒法，必须将总之，采用茎尖培养脱毒法，必须将植物植物种类、病毒种类、剥离茎尖的大小种类、病毒种类、剥离茎尖的大小以及以及培养基营培养基营养组成养组成四个方面统一起来考虑，才能收到理想的四个方面统一起来考虑，才能收到理想的脱毒效果。脱毒效果。影响微茎尖培养的因素影响微茎尖培养的因素 外植体大小外植体
13、大小 培养条件培养条件 外植体的生理状态外植体的生理状态7.2.3 提高脱毒效果提高脱毒效果热处理脱毒法和茎尖脱毒法相结合。热处理脱毒法和茎尖脱毒法相结合。化学处理脱毒法和茎尖脱毒法相结合。化学处理脱毒法和茎尖脱毒法相结合。(1)热处理（高温处理、温热疗法）脱毒法热处理（高温处理、温热疗法）脱毒法 原理：原理：病毒是病毒是DNADNA大分子，病毒进入植物细胞后，大分子，病毒进入植物细胞后，随植物细胞的随植物细胞的DNADNA一起复制。热处理井不能杀死病一起复制。热处理井不能杀死病毒，只能钝化病毒的活性，使病毒在植物体内增殖毒，只能钝化病毒的活性，使病毒在植物体内增殖减缓或增殖停止，而失去侵染的
14、能力。热处理它可减缓或增殖停止，而失去侵染的能力。热处理它可以加速植物细胞的分裂，使植物细胞在与病毒繁殖以加速植物细胞的分裂，使植物细胞在与病毒繁殖的竞争中取胜。的竞争中取胜。方法：方法：将试验母株在高温生长室中生长一将试验母株在高温生长室中生长一个阶段，使其顶端分生组织和次生分生组个阶段，使其顶端分生组织和次生分生组织迅速生长，然后切取其茎尖分生组织进织迅速生长，然后切取其茎尖分生组织进行离体培养。行离体培养。35354040；3000300010000Lux10000Lux；时间因植；时间因植物而异，短则几十分钟，长可达数月。物而异，短则几十分钟，长可达数月。应注意应注意病毒种类、处理温度
15、、处理时间病毒种类、处理温度、处理时间三者之间的协调关系。三者之间的协调关系。并非能脱除所有病毒。主要是利用某些病并非能脱除所有病毒。主要是利用某些病毒受热以后的不稳定性，而使病毒失去活毒受热以后的不稳定性，而使病毒失去活性。性。延长处理时间，病毒钝化效果好，同时也延长处理时间，病毒钝化效果好，同时也会钝化植物组织的抗性因子而降低了处理会钝化植物组织的抗性因子而降低了处理效果。效果。热处理后只有小部分植株能存活。热处理后只有小部分植株能存活。热处理方法主要缺陷热处理方法主要缺陷(2)(2)化学方法化学方法 一些化学药品如嘌呤和嘧啶类似物、一些化学药品如嘌呤和嘧啶类似物、氨基酸、抗生素处理，可在
16、某种程度上抑氨基酸、抗生素处理，可在某种程度上抑制植物体内或离体叶片内病毒的合成，但制植物体内或离体叶片内病毒的合成，但仍不能使病毒失治。但近年发现三氮唑核仍不能使病毒失治。但近年发现三氮唑核苷就可以使病毒失活苷就可以使病毒失活。7.3 7.3 茎尖以外其他途径脱毒茎尖以外其他途径脱毒(学生自学学生自学)愈伤组织脱毒愈伤组织脱毒 珠心胚培养脱毒珠心胚培养脱毒 茎尖微体嫁接脱毒茎尖微体嫁接脱毒 培育抗病毒栽培种培育抗病毒栽培种7.4 7.4 脱毒苗的鉴定脱毒苗的鉴定直接观察植株茎叶有无某直接观察植株茎叶有无某种病毒引起的可见症状种病毒引起的可见症状7.4.1 7.4.1 直接鉴定法直接鉴定法感染
17、感染CyMV(蕙兰嵌纹病毒蕙兰嵌纹病毒)病毒的病毒的蝴蝶兰叶片出现坏疽及凹陷的斑块蝴蝶兰叶片出现坏疽及凹陷的斑块烟草马铃薯烟草马铃薯Y病毒病病毒病7.4.2 生物鉴定法（敏感植物鉴定法）生物鉴定法（敏感植物鉴定法）indicator test plants概念：概念：有些植物对病毒极为敏感，有些植物对病毒极为敏感，一旦感染病毒就会在其叶片乃至全株一旦感染病毒就会在其叶片乃至全株上表现特有的病斑，把这种植物称为上表现特有的病斑，把这种植物称为病毒病毒敏感植物或指示植物。敏感植物或指示植物。每种病毒都有自已的敏感植物每种病毒都有自已的敏感植物如：马铃薯病毒的敏感植物有千日红、如：马铃薯病毒的敏感植
18、物有千日红、黄花烟、毛叶曼陀罗；大蒜病毒的敏黄花烟、毛叶曼陀罗；大蒜病毒的敏感植物有黎、千日红；感植物有黎、千日红；大丽花病毒的大丽花病毒的敏感植物为：矮牵牛、黄瓜；菊花病敏感植物为：矮牵牛、黄瓜；菊花病毒：矮牵牛、豇豆毒：矮牵牛、豇豆。从待测植物中取从待测植物中取1 13g3g幼叶置于研钵中幼叶置于研钵中磨成匀浆磨成匀浆吸取少量浆液擦抹指示植物叶片，吸取少量浆液擦抹指示植物叶片，使浆液能浸入叶片表皮细胞使浆液能浸入叶片表皮细胞指示植物置于防蚜虫网罩的温室内指示植物置于防蚜虫网罩的温室内数周后观察数周后观察清水冲洗叶面清水冲洗叶面加入适量的加入适量的0.1mol/L 0.1mol/L 磷酸缓冲
19、溶液磷酸缓冲溶液敏感植物鉴定病毒的方法敏感植物鉴定病毒的方法摩擦摩擦接种法接种法 嫁接法嫁接法 有些病毒不是通过汁液传播，而是通过有些病毒不是通过汁液传播，而是通过专门的介体传播。如草莓黄化病毒、草毒专门的介体传播。如草莓黄化病毒、草毒丛枝病毒是通过一种特殊的蚜虫为介体进丛枝病毒是通过一种特殊的蚜虫为介体进行传播。这种病毒的鉴定需将培养植株的行传播。这种病毒的鉴定需将培养植株的芽嫁接在敏感植物上，根据敏感植物的病芽嫁接在敏感植物上，根据敏感植物的病症表现来判断是否脱除了病毒。症表现来判断是否脱除了病毒。原理：原理：7.4.3 7.4.3 抗抗血清鉴定法血清鉴定法serologic testse
20、rologic test当动物被病毒感染或人工注射异体蛋白质时当动物被病毒感染或人工注射异体蛋白质时一种特异性丙种球蛋白称为免疫球蛋白一种特异性丙种球蛋白称为免疫球蛋白抗体在特殊细胞内形成，进入血液存在于血清和体液内。抗体在特殊细胞内形成，进入血液存在于血清和体液内。这种含有特异性这种含有特异性“抗体抗体”的血清称为的血清称为“抗血清抗血清”。抗体抗体抗原抗原 如玻璃片凝集法如玻璃片凝集法：在清洁玻璃片的一端，用毛细管在清洁玻璃片的一端，用毛细管滴加滴加5 5滴稀滴稀“抗血清抗血清”，另一端滴加等量对照血清。，另一端滴加等量对照血清。然后各加滴被检植物压榨出的原汁液两滴。用玻璃然后各加滴被检植
21、物压榨出的原汁液两滴。用玻璃棒搅匀，在常温下静置棒搅匀，在常温下静置202050min50min，然后在，然后在40406060倍倍显微镜下观察。带病毒的叶绿体发生典型的凝集现显微镜下观察。带病毒的叶绿体发生典型的凝集现象。象。方法方法:具有高度的专化性。具有高度的专化性。可诊断受感染而没有症状的带毒植物。可诊断受感染而没有症状的带毒植物。由于病毒与由于病毒与“抗血清抗血清”的的“反应量反应量”与与病毒浓度成正比。病毒浓度成正比。抗血清鉴定法优点抗血清鉴定法优点不是所有病毒都能制成抗血清，不是所有病毒都能制成抗血清，一般一般“黄化型黄化型”病毒，或严格由专化性昆虫传播的病毒。如马病毒，或严格由
22、专化性昆虫传播的病毒。如马铃薯卷叶病毒极难或不能获得铃薯卷叶病毒极难或不能获得“抗血清抗血清”。病毒在寄主体内病毒在寄主体内含量太少含量太少，而提纯过程中丧失，而提纯过程中丧失又太多。或者提纯过程中，病毒质粒又太多。或者提纯过程中，病毒质粒丧失了必丧失了必备的抗原结构。备的抗原结构。植物体内具有植物体内具有单宁物质单宁物质，单宁与病毒结合，使，单宁与病毒结合，使病毒丧失了抗原性质。病毒丧失了抗原性质。抗血清鉴定法缺点抗血清鉴定法缺点7.4.4 电子显微镜鉴定法电子显微镜鉴定法 用电镜直接观察经脱毒培养的用电镜直接观察经脱毒培养的叶片，检查是否有病毒质粒的叶片，检查是否有病毒质粒的存在，还可以测
23、量病毒颗粒的存在，还可以测量病毒颗粒的大小、形状和结构。大小、形状和结构。透射电子显微镜扫描电子显微镜扫描电子显微镜常采用的方法为常采用的方法为吐水法和浸蘸法吐水法和浸蘸法。吐水法吐水法是在清晨用网架上的薄膜沾一些病株是在清晨用网架上的薄膜沾一些病株 吐水孔的积水，染色后就可直接放到吐水孔的积水，染色后就可直接放到 电镜下镜检。电镜下镜检。浸蘸法浸蘸法是在网架薄膜上加是在网架薄膜上加1 1滴重蒸馏水，将滴重蒸馏水，将 病株叶片或幼芽的新鲜切口在水滴中病株叶片或幼芽的新鲜切口在水滴中 浸几秒钟，吸去多余水分，再进行染浸几秒钟，吸去多余水分，再进行染 色，然后放到电镜下观察。色，然后放到电镜下观察
24、。7.4.5 分子检测法分子检测法如如RT-PCRRT-PCR（反转录（反转录PCRPCR）法：）法：将待测样品将待测样品的总的总RNARNA与与cDNAcDNA合成的试剂盒进行反应，合成的试剂盒进行反应，合成合成cDNAcDNA，然后利用病毒，然后利用病毒DNADNA特有的序列特有的序列设计引物进行设计引物进行PCRPCR反应，即可知道在寄主反应，即可知道在寄主中是否有病毒基因的存在及表达。中是否有病毒基因的存在及表达。PCRPCR琼脂糖凝胶电泳琼脂糖凝胶电泳最终产物最终产物紫外光观察紫外光观察3-4 3-4 小时小时7.5 7.5 脱毒后防病毒再感染脱毒后防病毒再感染7.5.1 无病毒苗的
25、隔离保存无病毒苗的隔离保存 通常无病毒苗原种要在隔离区，如海岛、山通常无病毒苗原种要在隔离区，如海岛、山地、新区等利用自然环境进行隔离种植保存，地、新区等利用自然环境进行隔离种植保存，或采用隔虫网室种植保存。种植圃的土壤也或采用隔虫网室种植保存。种植圃的土壤也应该进行消毒，保证原种是在与病毒严密隔应该进行消毒，保证原种是在与病毒严密隔离的条件栽培，并采用最优良的栽培技术措离的条件栽培，并采用最优良的栽培技术措施。同时要及时和定时对原种进行病毒的检施。同时要及时和定时对原种进行病毒的检测和测定。测和测定。可以保存利用可以保存利用5 51010年年 。针对病毒感染途径提出对应措施：针对病毒感染途径
26、提出对应措施：昆虫传染病毒，昆虫传染病毒，特别是蚜虫：特别是蚜虫：300300目，孔径目，孔径0.4-0.5mm0.4-0.5mm。土壤传染病毒（真菌和线虫为媒介）：土壤传染病毒（真菌和线虫为媒介）：土壤要消毒，环境要整洁，及时打药。土壤要消毒，环境要整洁，及时打药。接触传染病毒：贮存、运输和播种；工接触传染病毒：贮存、运输和播种；工 具、衣服接触等。具、衣服接触等。7.5.2 7.5.2 无病毒苗的长期保存无病毒苗的长期保存 种苗经鉴定后，选择无病原种株系，回接于种苗经鉴定后，选择无病原种株系，回接于试管内，长期保存无病毒原种。试管内，长期保存无病毒原种。方法：方法：培养基中加生长延缓剂：培
27、养基中加生长延缓剂：B9B9或矮壮剂，弱或矮壮剂，弱 光、低温、继代光、低温、继代1 1次次/2-3/2-3月。月。低温保存：试管苗低温保存：试管苗2cm2cm，44，暗培养，可，暗培养，可 保存保存1 1年左右。年左右。超低温保存：超低温保存：-196-196，可长期保存。，可长期保存。本章要点本章要点 本节课我们学习了植物快速繁殖的概念、方法本节课我们学习了植物快速繁殖的概念、方法和步骤；植物病毒的特点、传染途径、运输方式和和步骤；植物病毒的特点、传染途径、运输方式和对植物的危害性；茎尖培养脱除病毒的原理、获得对植物的危害性；茎尖培养脱除病毒的原理、获得无特定病毒苗的程序和注意事项及其鉴定
28、方法。无特定病毒苗的程序和注意事项及其鉴定方法。本章内容主要掌握以下几点问题：本章内容主要掌握以下几点问题：1.1.掌握植物快速繁殖的途径和方法。掌握植物快速繁殖的途径和方法。2.2.掌握植物快速繁殖中茎尖培养脱毒原理和步骤。掌握植物快速繁殖中茎尖培养脱毒原理和步骤。3.3.知道茎尖以外其他途径脱毒的优缺点。知道茎尖以外其他途径脱毒的优缺点。4.4.理解脱毒苗的常用鉴定方法原理及优缺点，并理解脱毒苗的常用鉴定方法原理及优缺点，并 学会操作技能。学会操作技能。5.5.熟悉脱毒后防病毒再感染措施。熟悉脱毒后防病毒再感染措施。作业题作业题1 1、植物快速无性繁殖的概念、特点和程序？、植物快速无性繁殖的概念、特点和程序？2 2、茎尖分生组织培养的目的是什么？、茎尖分生组织培养的目的是什么？3 3、简述茎尖分生组织培养的方法。、简述茎尖分生组织培养的方法。4 4、脱毒苗的鉴定方法有哪些？各有何优缺点？、脱毒苗的鉴定方法有哪些？各有何优缺点？应如何选择应用？应如何选择应用？
