1、1结核病快速诊断进展结核病快速诊断进展2内容内容结核病实验室工作在结核病控制中的作用结核病实验室工作在结核病控制中的作用为什么要进行为什么要进行EQAEQA 培训的重要意义培训的重要意义4.结核病实验室相关的流行病学理论结核病实验室相关的流行病学理论5.痰涂片镜检的操作原理痰涂片镜检的操作原理6.全球结核病快速诊断进展全球结核病快速诊断进展3结核病实验室工作在结核病控制中的作用结核病实验室工作在结核病控制中的作用 诊断诊断（发现传染源）（发现传染源）治疗治疗（确定治疗方案）（确定治疗方案）疗效评价疗效评价 结核病控制策略和措施的评估结核病控制策略和措施的评估4Diagnosis of Pulm
2、onary TB Relatedto Numbers of Tubercle BacilliCase frequency10102103104105106Poor microscopy(25%)Good microscopy(55%)Culture/PCR(25%)X-ray/clinical only(20%)AFB per ml of sputumSlide Courtesy:Van Deun A,Nov 20035细菌细菌 让人们联想到什么让人们联想到什么?疾病疾病 传染性传染性 流行性流行性 食物腐败食物腐败 在目前已知的细菌中有在目前已知的细菌中有1%的细菌可以导致人患病的细菌可以导
3、致人患病 在目前已知的细菌中有在目前已知的细菌中有4%的细菌可以导致植物得病的细菌可以导致植物得病 95%已知细菌不具有致病性已知细菌不具有致病性6为什么要进行为什么要进行EQA 增加人员的责任心增加人员的责任心 推行标准化、规范化操作推行标准化、规范化操作 确保实验室服务质量的提高确保实验室服务质量的提高 生物安全的需要生物安全的需要 加强实验室网络、采集信息加强实验室网络、采集信息7痰涂片镜检EQA 培训的意义 强化EQA的理解，有利于积极推广 提高实验室服务质量 提高对结核病实验室工作的重视 逐步提高结核病防治人员特别是结核病实验室工作人员的地位8结核病实验室相关的流行病学理论 结核病的
4、发病学和流行 冰山理论 水库理论 病因分析和疗效评价9核分枝杆菌在人体中的生活周期核分枝杆菌在人体中的生活周期感染感染感染感染 95%后期表现后期表现-5%病变早期进展病变早期进展-5%例如：例如：HIV,婴幼儿婴幼儿例如：移民例如：移民10结核分枝杆菌的生活周期结核分枝杆菌的生活周期感染感染人体内生存人体内生存由肺中排入空气中由肺中排入空气中进入细胞内进入细胞内侵犯人体免疫防御系统侵犯人体免疫防御系统免疫激活和营养限制免疫激活和营养限制免疫病理免疫病理释放调控因子释放调控因子,例如例如 sigma factors释放抗原性蛋白释放抗原性蛋白改变营养需要改变营养需要改变细胞壁改变细胞壁11微生
5、物和人类Very few microbes arealways pathogenicMany microbes arepotentially pathogenicMost microbes arenever pathogenic12potential pathogen isolated from or detected in clinical samples Recognised syndromes patients clinical condition e.g.septicaemia,endocarditis,osteomyelitis meningitis,UTI,pneumoniapha
6、ryngitis我们如何知道特定的病原微生物致病?诊断和有效的治疗不仅依靠分离病原微生物，而且在于建立实验室和病人临床症状的联系13如何推测特定病原体可以致病?Kochs 推测 病原体必须在每一例病例中都出现 病原体可以从宿主中分离并且可以在纯培养基中生长 当特定的病原体接种到健康机体时特定的疾病会发生 病原微生物可以在实验动物中恢复14Spectrum of virulencepoliomyelitis in a child0.1-1%of infections are clinically apparentrubella50%of infections are clinically app
7、arentrabies100%of infections are clinically apparent传染性疾病的冰山理论传染性疾病的冰山理论asymptomatic infectionclassical clinical diseaseless severe disease15水库理论水库理论发病发病人数人数死亡死亡人数人数治愈治愈人数人数现有病人数现有病人数16痰涂片镜检的操作原理17分枝杆菌的发现历史分枝杆菌的发现历史 1590 年荷兰杨森父子发明了显微镜年荷兰杨森父子发明了显微镜 19世纪末世纪末,显微镜技术、染色技术已应用于微生物显微镜技术、染色技术已应用于微生物检测检测,分枝杆菌
8、的发现条件已成熟分枝杆菌的发现条件已成熟 在发现结核菌前在发现结核菌前,科霍已是一位在微生物学方面取科霍已是一位在微生物学方面取得丰硕成果的学者得丰硕成果的学者.18Robert Koch 第一个证明细菌可以致病第一个证明细菌可以致病 1876 传染病的微生物病因学传染病的微生物病因学 病因学病因学-疾病的病因疾病的病因 建立建立“科学规则科学规则”来确定微生物和疾病的病来确定微生物和疾病的病因和效应关系因和效应关系 Kochs 原理原理19Koch确定了确定了3个重要疾病的病因个重要疾病的病因 1.霍乱霍乱(fecal-oral disease)Vibrio cholerae 2.结核病结核
9、病(pulmonary infection)Mycobacterium tuberculosis 3.炭疽炭疽(sheep and cattle)Bacillus anthracis20结核病结核病Figure 24.9结核分枝杆菌：棒状抗酸菌结核分枝杆菌：棒状抗酸菌.可以在人与人之间传播可以在人与人之间传播牛型结核杆菌牛型结核杆菌:美国的病例美国的病例数数,不在人与人之间传不在人与人之间传播播鸟胞内分枝杆菌，可以感染鸟胞内分枝杆菌，可以感染 AIDS晚期患者晚期患者21光学显微镜的基本原理光学显微镜的基本原理 为区分物体不同的两点为区分物体不同的两点,这两点的光学成像必须落在视网这两点的光学
10、成像必须落在视网膜上不同的感光细胞上膜上不同的感光细胞上;显微镜下显微镜下,光线经过显微镜物镜折射成倒立放大的实像光线经过显微镜物镜折射成倒立放大的实像,然然后经目镜折射成正立放大的虚像后经目镜折射成正立放大的虚像;经显微镜放大后经显微镜放大后,人眼就可以区分物体不同的两点人眼就可以区分物体不同的两点,以达到以达到观察微小物体的目的观察微小物体的目的;由于光线衍射的原因由于光线衍射的原因,普通光学显微镜不能区别小于普通光学显微镜不能区别小于0.2微微米的物体；米的物体；22分辨率和对比度分辨率和对比度 人的肉眼不能看清小于人的肉眼不能看清小于0.1毫米的物体毫米的物体 普通光学显微镜不能区别小
11、于普通光学显微镜不能区别小于0.2微米的物体微米的物体 电子显微镜不能看清小于电子显微镜不能看清小于0.1纳米的物体纳米的物体23电子显微镜下的结核分枝杆菌电子显微镜下的结核分枝杆菌Gram-positiveS.aureusGram-negativeE.coliAcid fast M.tuberculosis 24生理条件下细菌的表面往往带有大量负电荷生理条件下细菌的表面往往带有大量负电荷 原因：细菌表面带有正负电荷的基团，等电点多在原因：细菌表面带有正负电荷的基团，等电点多在PH以下，因此在中性或碱性条件下细菌的表面往往以下，因此在中性或碱性条件下细菌的表面往往带有大量负电荷带有大量负电荷2
12、5染色反应染色反应 Stains-salts composed of a positive and negative ion,one of which is colored(chromophore)碱性染料碱性染料 着色基团带正电荷着色基团带正电荷 dye+Cl-酸性染料酸性染料 着色基团带正电荷着色基团带正电荷 Na+dye-26分枝杆菌涂片镜检基本原理分枝杆菌涂片镜检基本原理、待检标本中存在分枝杆菌，即受检者排菌、待检标本中存在分枝杆菌，即受检者排菌、分枝杆菌的特殊结构决定了染色方法：、分枝杆菌的特殊结构决定了染色方法：染色剂染色剂 细菌表面带负电荷细菌表面带负电荷,与碱性复红易于结合与碱
13、性复红易于结合,加热加热 加深分枝杆菌着色程度加深分枝杆菌着色程度脱色脱色 为了易于镜检，应该使抗酸菌以外的所有物质近乎完全脱色为了易于镜检，应该使抗酸菌以外的所有物质近乎完全脱色复染复染 提供一个良好的对比，隐去背景中残留的红色，但不掩盖抗酸菌。而且，复染既提供一个良好的对比，隐去背景中残留的红色，但不掩盖抗酸菌。而且，复染既要使涂片的背景易于镜检时调焦，同时又不能太深以至分散太多注意力要使涂片的背景易于镜检时调焦，同时又不能太深以至分散太多注意力27结核菌感染及排出示意图结核菌感染及排出示意图28结核病结核病29结核病结核病30细胞壁细胞壁革兰氏阳性菌革兰氏阳性菌革兰氏阴性菌革兰氏阴性菌分
14、枝杆菌分枝杆菌脂质双分子肽聚糖MYCOLATElipid+LPSporinsacyl lipidsarabinogalactaLAM31细胞膜细胞膜 两种主要结构成分两种主要结构成分 双层磷脂双层磷脂double layer of phospholipids 蛋白质蛋白质proteins321.痰涂片操作程序原理痰涂片操作程序原理2.二甲苯问题二甲苯问题33 假阴性假阴性 假阳性假阳性技术错误技术错误 涂片涂片:太薄太薄/太厚、暴露在紫外线下太厚、暴露在紫外线下 标本中的混杂物质标本中的混杂物质 /加热时间过长加热时间过长 /使用污染的木签使用污染的木签 染色染色:染色质量不佳、未热染、染色时
15、染色质量不佳、未热染、染色时 结晶结晶/环境抗酸菌、环境抗酸菌、间太短、脱落、涂片未固定间太短、脱落、涂片未固定 交叉污染交叉污染 脱色脱色:脱色不佳脱色不佳 脱色不佳脱色不佳 复染复染:过染过染 染色不佳染色不佳镜检员镜检员 视力缺陷、仅观察少数视野、视力缺陷、仅观察少数视野、经镜油交叉污染经镜油交叉污染读片错误：读片错误：未经培训未经培训 未经培训未经培训记录记录/报告：报告：记录错误记录错误 记录错误记录错误34细菌感染的诊断病人临床诊断临床诊断血液生化Non-microbiological investigations 影像学标本标本分泌物 标本 35实验室检查是临床诊断的必要环节Ga
16、rbage inGarbage outLaboratory36OUTLINE 细菌学诊断 显微镜检查术 培养 免疫学诊断 分子生物学诊断 Gen Probe 噬菌体检测方法 HPLC 其他37结核分枝杆菌的细菌学诊断培养培养on plates or in broth identification by biochemical or serological tests on pure growth from single colony显微镜检查脱色复染染色unstained or stained with e.g.Gram stain 药敏药敏血清学血清学DNA 方法方法by disc diff
17、usion methods,breakpoints or MICs 38显微镜检查 Gram-染色 抗酸染色 Ziehl-Neelsen 荧光染色 Direct,e.g.auramine Immunofluorescence39培养 Solid media Agar plates For Identification For Enumeration Slopes For safe long-term culture,e.g.Lowenstein-Jensen media for TB Liquid media(broth)For enrichment or maximum sensitivit
18、y40菌种鉴定 形态学 生长条件 生化反应 酶 抗原 分子生物学方法41非培养的诊断方法 血清学检测 分子生物学方法 其他（HPLC）42什么是分子生物学诊断方法?为什么用分子生物学诊断方法?可得的分子生物学方法?2022-12-2442讨论的议题43分子生物学方法是传统方法的必要补充 显微镜检查有假阳性 -T.vaginalis,N.gonorrhoeae 胞内致病菌 viruses,M.genitalium 低敏感性 Chlamydia sp.,Neisseria sp.慢速生长 M.tuberculosis 44分子生物学方法 如何发挥作用?每个微生物拥有一些种属特异的DNA序列 分子生
19、物学方法使得种属特异性DNA可以衡量法医鉴定45分子生物学方法是一系列分子生物学方法是一系列DNA初级结构的方法初级结构的方法杂交的互补序列方法扩增合成种属特异的DNA序列-A-A-T-T-C-G-C-G-A-T-G-T-T-A-A-G-C-G-C-T-A-C-A-A-T-T-C-G-C-G-A-T-G-A-A-T-T-C-G-C-G-A-T-G-A-A-T-T-C-G-C-G-A-T-G-A-A-T-T-C-G-C-G-A-T-G-A-A-T-T-C-G-C-G-A-T-G-46PCR 实验室标本处理标本处理DNA 准备准备 洁净屋洁净屋储存溶液储存溶液混合点混合点热循环和扩增热循环和扩增
20、检测检测 QC&QA质量控制质量控制 和质量保证和质量保证 R&DAlternatives:-commercial kits-robots+kitsNo alternative47 Bactec放射呼吸测定放射呼吸测定 以含有放射标记的软脂酸为底物的液体培养基，自动测量分枝杆菌代谢14C软脂酸脱致过程中释放的14CO2的量。该法药敏报告可缩短为4一12天。分枝杆菌生长指示管法 Bactec放射呼吸测定法的替代方法。以培养基中加入荧光钌复合物代替放射性标记，其荧光衰减与细菌代谢过程中O2的消耗量有关。荧光衰减可通过一系列不同的紫外透照管检测。Bactec呼吸测定呼吸测定48流式细胞仪测定法流式细
21、胞仪测定法 原理:分枝杆菌细胞内的非特异性脂酶能水解培养基中加入的荧光素复合物(FDA)为游离的荧光素，因而分枝杆菌在生长过程中可造成荧光素的堆积，经FCM即可检测到。49比色法比色法 MTT法法 MTT法为线粒体琥珀酸脱氢酶的作用底物，可被活细胞还原形成不溶性的Formazan产物,其生成量与活细胞数量成正相关。Formazan经溶解后，可在酶标仪上测定其光吸收值。微孔板美兰比色法微孔板美兰比色法 美兰为耗氧指示剂，有氧时为蓝色，无氧时为粉红色。Franzblau等以美兰为指示剂在96孔微量板中培养细菌，培养基中加入抗结核药物，微量板用Parafilm封口膜封闭。若细菌为药物敏感株，可被加入
22、的抗结核药物抑制或杀死，首先表现为氧消耗停止。而耗氧指示剂在各独立微小隔氧环境中的颇色变化可客观反映氧被消耗的程度，从而反映细菌的生长状态。50 噬菌体生物扩增法噬菌体生物扩增法 将分枝杆菌噬菌体感染结核分枝杆菌，未进入菌体内的噬菌体用特异的杭噬菌体物质灭活，进入菌体内的噬菌体得到保护而复制增殖，溶菌后释放子代噬菌体，将此噬菌体与快速生长的耻垢分枝杆菌混合，接种在固体培养基上培养，观察蚀斑的产生。蚀斑的数量与噬菌体数量有关，也与在含抗结核药物培养基上存活的结核分枝杆菌数有关。噬菌体法（噬菌体法（Fast flaque)Fast flaque)51 噬菌体荧光素酶检测法噬菌体荧光素酶检测法 Ja
23、cobs等将荧火虫荧光素酶基因导入分枝杆菌噬菌体，这种噬菌体感染分枝杆菌后，荧光素酶基因被代谢活跃的分枝杆菌活化，在菌细胞内ATP存在的条件下，可产生光子，通过荧光检测器测定发光信号。只有耐药的分枝杆菌才能在含药的培养墓上生长，产生光子，敏感菌和死亡菌不产生或产生后不能维持。52 噬菌体生物扩增法原理示意图噬菌体生物扩增法原理示意图53Gen Probe 方法检测结核分枝杆菌1.原理2.菌种鉴定54 RNA/RNARNA/RNA错配法错配法 Nash等(1997)首先将该法用于RFP耐药菌株培养物的检测。该法是基于双链RNA能抵杭RNA酶的消化的原理而建立的。将待检菌株以及药物敏感的参考菌株(
24、H37Rv)的PCR产物混合，加入T7RNA多聚酶和SP6RNA多聚酶，通过转录形成两条RNA，在进行杂交，若待检测株为敏感株，则形成两条互补的RNA，能抵抗RNA酶的消化，若待检测菌株有突变发生，则不能与参考株RNA链完全配对，加入RNA酶后，杂交产物将在突变位点被切开，通过电泳即可检测到。55 56RussiaBrazilTokyoSwedenBirkhaugDanishPragueGlaxoTiceFrappierConnaughtPhippsPasteur分枝菌酸分枝菌酸(HPLC)AlphaMethoxyKeto300 bp200 bp100 bpBehr et al.J Bacte
25、riol,200057DNA 测序法 Hirano等应用DNADNA测序法测序法 DNA测序法被认为是检测变异的“金标准”，可检测出待检基因上的所有突变位置和突变情况。利用PCR法扩增待检基因，PCR产物可直接测序，24一48h即可提供精确序列，并准确判定碱基突变的位点，已用于RFP、INH、PZA、EMB等耐药基因的检测。58基因芯片 基因芯片基因芯片 将耐药基因的DNA或寡核苷酸序列标记到芯片上，从而快速的检测出突变位点，可以在3个小时内完成。59基因组学的问题基因组学的问题 多样性多样性 单核苷酸多态性单核苷酸多态性,复制子复制子,缺失缺失,重排重排 株水平差异和种属特异性株水平差异和种
26、属特异性 基因的作用是什么基因的作用是什么?基因的功能通常是未知的基因的功能通常是未知的 主要是根据同类中的功能来推论主要是根据同类中的功能来推论 翻译成效应分子翻译成效应分子 信息如何引导诊断、预防、治疗疾病信息如何引导诊断、预防、治疗疾病60M.tuberculosis H37Rv 440万碱基对万碱基对 3924 预测基因预测基因 65.6%GC 含量含量Cole ST et al.Nature 1998;393:537.61斑点杂交和反相斑点杂交斑点杂交和反相斑点杂交斑点杂交斑点杂交DNA/RNA 标本标本标记探针标记探针反相斑点杂交反相斑点杂交探针探针标记标记DNA/RNA 标本标本
27、62制作制作DNA芯片芯片96-孔板孔板printer玻片玻片18mm63DNA在玻片上的点样在玻片上的点样64DNA 微阵列微阵列-M.tuberculosis H37Rv的基因组芯片的基因组芯片3924 开放阅读框开放阅读框一个基因一个探针一个基因一个探针65 DNA微阵列微阵列Cy3Cy5DNA/RNADNA/RNADNA 微阵列微阵列扫描扫描66cDNA 微阵列微阵列Cy3 和和 Cy5 荧光荧光强度相等强度相等 Cy3 荧光荧光信号强信号强Cy5 荧光荧光信号强信号强67Rv562Rv2875Rv780Rv1974Rv1976 Rv1978M.tuberculosis vs.BCG-
28、Danish 1331H37RvBCGBoth strainsBehr MA et al.Science 1999;284:1520.68Affymetrix 基因芯片基因芯片69p 经常不断地学习,你就什么都知道。你知道得越多,你就越有力量p Study Constantly,And You Will Know Everything.The More You Know,The More Powerful You Will Be写在最后70感谢聆听不足之处请大家批评指导Please Criticize And Guide The Shortcomings结束语讲师：XXXXXX XX年XX月XX日
