1、杜氏肌营养不良症DMD和遗传疾病概述2杜氏肌营养不良症DMD和遗传Dystrophie musculaire de Duchenne DMD，杜氏肌营养不良，假肥大型肌营养不良 Dystrophine（Dys）抗肌萎缩蛋白 缺失 Maladie monogenique Htdit:XR Duchenne,un neurologiste franais,a donn une description complte de 13 maladies attaints3杜氏肌营养不良症DMD和遗传Phnotype Clinique de la DMD Les muscles jumeaux des ja
2、mbs des garons atteints apparaissent quils soient dvelopps Mais asthniques 假性肌肥大 Tissu conjonctif et la graisse4杜氏肌营养不良症DMD和遗传Phnotype Clinique de la DMD12 ans normal3 5 ans dveloppe une faiblesse musculaire Ds lge de 12 ans confin en chaise roulant Au-del de lge de 20 ans ne survivraQI 智商 une chute
3、 modr denviron 20 points5杜氏肌营养不良症DMD和遗传LabCratine kinase(niveau srique)血清浓度 50 100 fois la limite suprieure de la normale dans les stades prcoces6杜氏肌营养不良症DMD和遗传Dystrophie musculaire de Becker le gne de la dystrophie Beaucoup plus attnu 缓和 Aprs lge de 16 ans parvient marcher 之后多年也可行走7杜氏肌营养不良症DMD和遗传DM
4、D与BMD的差异 DMD致死 BMD存活率非常高(70%),易产生 新的突变8杜氏肌营养不良症DMD和遗传遗传9杜氏肌营养不良症DMD和遗传遗传特征 Htdit:XR亲代生殖细胞子代XH Xh Y XH XH Xh Y XH XH XH XH Xh Y XH Y Xh 正常女性正常男性女性携带者男性患者10杜氏肌营养不良症DMD和遗传遗传特征（1）系谱中常常只有男性患者（2）父母都无病时，女儿则不会发病，儿子可能发病；（3）由于交叉遗传，患者的同胞、舅舅、姨表兄弟、外甥常常为本病患者；（4）由于男性患者的子女都正常，故可见隔代遗传；（5）女性患者的父亲一定是患者,母亲一定是携带者。11杜氏肌营
5、养不良症DMD和遗传DMD 男女差异 男性致死 1/3 nomutation,2/3 mre porteuse 女性携带者 Majorit 无任何临床表现，70%肌酸激酶(Cratine kinase)增高 8%轻微的肌肉症状,有些还有严重的近心端肌肉障碍。女性很少患有DMD12杜氏肌营养不良症DMD和遗传母系镶嵌 某男性是家族中DMD的先证者 他的母亲没有携带突变基因 遗传位点上发生了新近的突变 大约5%-15%的这些发生的例子是由于母系生殖镶嵌13杜氏肌营养不良症DMD和遗传DMD 发病率较高 Garons nouveau-ns：1/3300 Un taux de mutation：1/1
6、0000 每天一个男性每11-12秒会产生1个新突变的精子（8 x 107 par jour）14杜氏肌营养不良症DMD和遗传Gne DMD 人类最大的基因之一，2300 kb 位于Xp 占X 染色体全长的1.5%99%的序列由内含子组成 编码区包括79个外显子及7 个组织特异性的启动子 其mRNA 序列长114 kb 主要表达于骨骼肌、心肌，少量表达于脑组织16杜氏肌营养不良症DMD和遗传7 个组织特异性的启动子,B(脑皮质)、M(肌组织)、P(蒲肯野纤维)、R(视网膜)、B3(脑组织)、S(施旺细胞)和G(肌组织之外的多种组织器官)B 型：大脑皮层、海马回神经元 P型：小脑蒲肯野细胞,在骨
7、骼肌也有极少量的表达 M 型：骨骼肌、心肌组织,同时在脑神经胶质细胞也有少量表达17杜氏肌营养不良症DMD和遗传Dystrophin 抗肌萎缩蛋白 全长型dystrophin 是一种427 kDa的棒状蛋白,长约150 nm,分为4 个区域，氨基端区域 中央棒状区 富含半胱氨酸区域 羧基端区域18杜氏肌营养不良症DMD和遗传 A.位于Xp21,黑色的竖线代表分布于整个基因上的79 个外显子,黑色箭头指示各组织特异性启动子不同的启动位点,分别以不同的字母缩写来代表,B(脑皮质)、M(肌组织)、P(蒲肯野纤维)、R(视网膜)、B3(脑组织)、S(施旺细胞)和G(肌组织之外的多种组织器官)。B.不同
8、形式的dystrophin 蛋白及其区域组成,氨基端、中央棒状区域、富含半胱氨酸区域及羧基端区域19杜氏肌营养不良症DMD和遗传 DMD患者：60%基因突变表现为缺失 一般在基因的5端和中央棒区两个区域 BMD患者：可能缺失了一个或者几个基因序列 dystrophine蛋白的特点 DMD患者体内很少或者没有 BMD患者体内有表达，但是仍然比正常人少20杜氏肌营养不良症DMD和遗传21杜氏肌营养不良症DMD和遗传临床治疗22杜氏肌营养不良症DMD和遗传DMD治疗 目前为止尚无治疗DMD的有效方法 药物治疗（对症治疗）：糖皮质激素治疗 短期口服激素治疗可增强骨骼肌力量和功能，并可能在更长时间内稳定
9、骨骼肌力量和功能 基因治疗：利用不直接引起人类疾病，免疫原性较小的腺相关病毒（AAV）为载体，导入人工剪裁的Dys基因 修正肌肉组织(占全身体重40)的基因缺陷遇到各种各样的困难 康复治疗、矫形治疗、社会心理治疗等23杜氏肌营养不良症DMD和遗传临床检测24杜氏肌营养不良症DMD和遗传产前诊断和杂合子诊断 90%携带者孕妇中产前诊断可能有至少95%的精确度 由于基因突变导致基因的缺失或者多倍体的家庭中，60%-70%可以直接通过southern印迹杂交技术或者PCR技术来测量胎儿的DNA得到 在其余的基因缺失不能明确诊断出来的家庭中，可以通过键的标记来完成产前诊断 与患病男性结婚的女性中 75
10、%的女性：DNA检查、CK血清浓度检查胎儿是否携带 25%女性难检测：第一，在病程的一些时期，基因缺陷是无法被检查出来的（可能情况就是等位基因是正常的或者突变的等位基因位于另外一条X染色体上）第二，一些家庭的一些成员的样本丢失了 第三，两个标记基因之间的基因重组在X染色体传入下一代之前发生了（母系镶嵌）25杜氏肌营养不良症DMD和遗传产前检测 生物化学检查CK血清浓度 基因诊断 多重PCR Southern blot 探针连接多重扩增(MLPA)变性高效液相色谱(DHPLC)抗肌萎缩蛋白的免疫组化26杜氏肌营养不良症DMD和遗传多重PCR方法DMD、BMD相关基因的缺失、重复 可直接检出DMD
11、BMD的缺失型突变 65的患者为基因缺失所致 多重PCR:使用多对引物的 针对DMD基因的缺失热区，利用多对PCR引物在一个PCR管中同时扩增多个外显子，通过和正常对照相比较而判断外显子的缺失情况27杜氏肌营养不良症DMD和遗传多重PCR方法 优点：1、具有敏感、特异性强和可重复性好的优点 2、需要的DNA量少、操作简单 局限性:1.女性携带者正常x染色体的屏蔽效应，无法检出 2.多重PCR体系内，由于引物之间的相互竞争，有时也会出现个别片段扩增的假阴性结果。（对初次扩增呈阴性结果的片段进行再次扩增，以验证结果的准确性）28杜氏肌营养不良症DMD和遗传Southern blot方法DMD、BM
12、D相关基因的缺失、重复 是一种常用的DNA定量的分子生物学方法 原理 将待测的DNA样品固定在固相载体(硝酸纤维膜或尼龙膜)上 与同位素标记的核酸探针进行杂交 在与探针有同源序列的固相DNA的位置上显示出杂交信号 通过检测信号的有无、强弱可以对样品定性、定量，从而计算出转入的拷贝数29杜氏肌营养不良症DMD和遗传Southern blot方法 优点：Southern杂交准确性高、特异性强 缺点：1、不经过靶片段的扩增(PCR)，一般每个电泳通道需要1030g的DNA，在实际操作中就需较大量的DNA样品 2、Soutllem杂交不能确定缺失的准确外显子范围，对检测女性重复突变(duplicati
13、on)或三重重复(triplication)携带者存在困难 3、由于DMD基因很大，需要6到8个cDNA探针，杂交反应才能覆盖整个DMD基因，要12周时间用来分析，劳动量大 4、需要使用放射性同位素作为示踪物，会对工作环境带来污染30杜氏肌营养不良症DMD和遗传多重探针连接依赖性扩增技术 MLPA multiplex probe ligation dependent amplification 原理 针对所有需要检测突变的DNA序列，设计多对特异探针 固定在尼龙膜上 和待测样品DNA杂交然后洗膜（正常序列和探针杂交后不被洗脱）利用连接酶把探针连接起来 使用一套通用引物进行PCR扩增 PCR产物
14、用PCR仪进行分析，DNA片段的缺失重复以及拷贝数以测序仪得到信号的有无及信号的峰高或面积进行计算31杜氏肌营养不良症DMD和遗传 优点：可以在1个PCR管中完成多达40个外显子的缺失重复检测 专门用于DMD缺失重复检测的试剂盒，通过2个PCR反应就可以完成79个外显子及其非翻译序列的缺失重复突变筛查 灵敏度高、操作简单、可重复性好、经济快捷32杜氏肌营养不良症DMD和遗传DMD患者(A)及其母亲(B)的20-47号外显子的MLPA检测结果33杜氏肌营养不良症DMD和遗传变性高效液相色谱 DHPLC denaturing high performance liquid chromatograp
15、hy 原理 用离子对逆向层析法分离并检测异源双链 通过三乙基醋酸钠（TEAA)作为桥分子，带正电的氨基与核酸分子带负电电荷的磷酸基相互作用，烷基端与色谱柱基质表面的疏水基团相连 不同大小的DNA片段所含的磷酸根数目不同，与固定相的结合力不同 随着流动相中乙腈浓度(离子对洗脱液的比值)的增加，DNATEAA与柱基质的疏水作用力逐渐减弱，最终被洗脱下来 检测柱洗脱液在260 nm处的吸光度，样品中各成分在色谱图中显示为不同的吸收峰 优点:灵敏度高、分析快捷以及可以进行半自动化分析34杜氏肌营养不良症DMD和遗传35杜氏肌营养不良症DMD和遗传Merci de votre attention!36杜氏肌营养不良症DMD和遗传参考文献 DMDBMD基因诊断研究进展，徐晓雪 张朝东 李嘉姝 DMD 患者骨骼肌抗肌萎缩蛋白表达与临床病理改变，陈琳 郭玉璞 邹丽萍 赵燕环 任海涛 DMD 基因突变及突变检测技术研究进展，朱海燕,邬玲仟*,梁德生,夏家辉 免疫荧光检测抗肌萎缩蛋白诊断肌营养不良症的临床应用，王训 谢有梅 张成 刘焯霖 假肥大型肌营养不良症产前基因诊断的临床应用，杨元 林立 王军 孔祥东 张思仲 抗肌萎缩蛋白相关蛋白复合体与Duchenne 型肌营养不良症，张文娟 孙新刚 尹小玲37杜氏肌营养不良症DMD和遗传
