1、VASH-VEGF-CD31通路对肺腺癌血管生成作用的研究开题报告国内外研究现状及意义17研究内容及实验方案243 拟解决的问题可行性分析 创新性56 计划进度、预期结果 经费落实情况及使用计划1.肺癌是临床常见的恶性肿瘤，其发病率及死亡率居各肺癌是临床常见的恶性肿瘤，其发病率及死亡率居各种癌症之首，发病机制尚不完全清楚。种癌症之首，发病机制尚不完全清楚。2.肺癌丰富且形态多样的新生血管在其快速生长和侵袭肺癌丰富且形态多样的新生血管在其快速生长和侵袭转移中发挥重要作用。转移中发挥重要作用。3.针对抗血管生成，寻找新的靶点成为研究的热点。正常微血管结构高度有序，由内皮细胞构成管腔，周细胞趋附并覆
2、盖内皮细胞管道外面，血管结构完整稳定。在肿瘤血管中，周细胞形态异常，功能不足，连接松散甚至缺如，周细胞对内皮细胞作用减弱，导致血管扩张和渗。VASH(Vasohibin,血管新生抑制蛋白)2004年WatanabeDNA微阵分析实验 发现血管内皮生长因子诱导人的脐静脉内皮细胞基因表达谱VASH-1与VASH-2，两者52.5%的同源氨基酸序列 方法 诱导剂 分类VASH-1，位于人染色体14q24.3，由365个氨基酸组成，在C末 端有一簇碱性氨基酸，但此序列中缺乏经典的内质网分泌信号序列，也不与内质网标记蛋白共定位，为非传统的蛋白主要由血管内皮细胞分泌。VASH-2，位于染色体1q32.3上
3、，由355个氨基酸组成。在内皮细胞上表达很低，目前研究显示主要由坏死边缘区的单核细胞分泌。VASHVASH作用VASH-1的作用：通过血管内皮生长因子和纤维细胞生长因子的负反馈作用，抑制血管生成。VASH-2的作用，实验表明：具有促血管生成的作用，是否与血管内皮生长因子有关，说法不一，具体机制不详。王启志（2012.4）肝癌中研究表明：VASH-1与血管内皮因子A（Vascular endothelial growth factor A,VEGF-A）、CD34具有相关性，与肝癌侵袭、转移密切相关。王志娜等（2013.7）对肝癌组织采用免疫组化的方法，结果表明：VASH-1与缺氧因子 1（hy
4、poxia inducible factor 1 alpha，HIF-1）在病变组织中两者的表达成正相关，HIF-能够诱导VEGF的分泌。Yazdani S等（2013.8）研究表明：肺癌中vasohibin-1/CD31-阳性率代表新生血管在肺癌中的地位，但没有组织病理性的差异性，但血管成熟程度鳞癌低于腺癌，考虑可能是在抗血管生成治疗中，鳞癌副作用较多的原因。Koyanagi T等（2013.12）研究表明：肝癌中的VASH-2过表达时，核因子（Nuclear factor kb，NF-kB）上调。Koyanagi T等在对卵巢癌研究中限制VASH-2表达，有助于血管的正常化。川芎嗪（tet
5、ramehtylpyrazine，TMP）是从中药川芎中分离出来的一种生物碱，即四甲基吡嗪。随着研究的不断深入，在抗肿瘤方面有新的突破。研究显示：1.在不同的肿瘤部位，抗肿瘤血管生成的机制不同，比如：肺癌-环氧化酶2（Cyclooxygenase-2，COX-2）、大肠癌-缺氧因子 1（hypoxia inducible factor 1 alpha，HIF-1 ）；2.具有直接杀伤癌细胞的作用。川芎嗪与VASH家族关系有待进一步研究。顺铂属细胞周期非特异性药物，具有细胞毒性，可抑制癌细胞的DNA复制过程，并损伤其细胞膜上结构，有较强的广谱抗癌作用。临床用于卵巢癌、前列腺癌、睾丸癌、肺癌、鼻咽
6、癌、食道癌等多种实体肿瘤均能显示疗效。两者联合是否通过作用于VASH具有协同抗肿瘤作用。研究意义通过对肺癌组织中VASH在血管生成中的 作用，有助于深入了解此肿瘤的发生发展机制。可作为早期预测血管转移的参考指标，同时也为预防肿瘤提供理论依据。川芎嗪与顺铂的联合作用于VASH-VEGF-CD31通路，有助于指导临床用药。NO 1NO 2NO 3 研究内容：本实验通过使用LLC(Lewis Lung Cell)注射C57BL/6小鼠，建立肺腺移植瘤癌模型，空白对照组与腹腔注射用药组，脱颈处死，取出瘤组织，采用透射电镜、免疫组化、蛋白印迹技术，观察药物作用前后肿瘤细胞形态学的改变，检测VASH-1、
7、HIF-、VEGF、CD31及其VASH-2、NF-kB、VEGF、CD31在肺癌模型中的表达情况。细胞培养，建立肺腺癌移植瘤模型待肿瘤直径8mm左右，分成空白对照组与腹腔用药组，2周空白对照组腹腔注射用药4组生理盐水组川芎嗪组顺铂组川芎嗪+顺铂组脱颈处死，取出瘤组织，标本制备整理数据，统计分析，撰写论文免疫组化蛋白印迹透射电镜技术路线检测VASH-VEGF-CD31通路在肺腺癌血管生成中的作用川芎嗪对以上通路的作用川芎嗪联合顺铂协同对以上通路的作用拟解决的问题3免疫组化染色过程中怎样选用最佳的抗原修复方法和抗原修复液最大程度地暴露抗原决定簇、恢复抗原性。2 蛋白印迹技术 浓缩标本使目的蛋白信
8、号最大化，转膜、洗膜、封闭的时间。1各种样品标本的制备 VASH在肺癌及其它肿瘤中有报道实验中心有条件、有技术支持查阅文献，了解国内外现状可行性分析前期发表肿瘤血管生成论文数篇成功建立肺腺癌移植瘤模型创新性VASH家族在肺腺癌各家族在肺腺癌各自调节血管生成的初步研究自调节血管生成的初步研究川芎嗪对川芎嗪对VASH家族家族影响影响川芎嗪联合顺铂对VASH家族的影响国内关于国内关于VASH家族家族在肿瘤血管在肿瘤血管中作用报道中作用报道相对较少相对较少 计划进度 2013年3月-2013年10月 查找文献。2013年11月-2014年2月 完成预实验。2014年3月-2014年7月 完成实验。20
9、14年8月-2014年10月 整理数据，撰写论文。预期进展 2013年3月-2013年10月 查阅国内外相关文献，了解国内外最新研究现状。2013年11月-2014年2月 完成预实验，掌握相关技术方法。2014年3月-2014年7月 完成实验。2014年8月-2014年10月 整理数据，撰写论文。实验图片实验图像四组小鼠腹腔注射用药后体重变化情况四组小鼠腹腔注射用药后肿瘤体积变化情况 预期发表论文1-2篇 预期理论结果：1.阐述VASH-1与VASH-2在肺腺癌中血管生成的可能机制。2.川芎嗪对VASH血管生成通路的影响，间接对VASH起作用，证明通路的正确性。3.川芎嗪联合顺铂协同对VASH作用。经费来源：导师经费 落实情况：已落实 使用计划：Lewis细胞株600元 C57BL/6小鼠2400元 四季青胎牛血清 2200元 抗体 10000元 其它 2000元
