1、 血涂片的制备与染色血涂片的制备与染色 血涂片血涂片血涂片的显微镜检查是血液细胞学检查的基本方法血涂片的显微镜检查是血液细胞学检查的基本方法血片制备和染色不良血片制备和染色不良,常使细胞鉴别发生困难常使细胞鉴别发生困难,甚至导致错误结论甚至导致错误结论血涂片的制备与染色血涂片的制备与染色实验目的：掌握普通手工制备血涂片的方法 掌握瑞氏染料的特性和染色方法及瑞氏-吉 姆萨复合染色方法 血涂片的制备血涂片的制备实验器材：EDTA-K2抗凝血、推片、载玻片（25mm*75mm,厚度为0.81.2mm)载玻片的清洁载玻片的清洁u要求：清洁、干燥、中性、无油腻 u新载玻片用1mol/L HCL浸泡24小
2、时用清水彻底冲洗 烘干备用。u用过的玻片放入肥皂水或洗衣粉水中煮沸20分钟，再用热水将肥皂和血膜洗净，用清水反复冲洗后烘干备用。制作血涂片的标本制作血涂片的标本u末梢血uEDTA-K2抗凝静脉血操作操作1.采血2.推片 左手持载玻片，右手持推片，在玻片近一端1/3处，加一滴（约0.05ml)充分混匀的血液，握住另一张边缘光滑的推片，以30 45角使血滴沿推片迅速散开，快速、平稳地推动推片至载玻片的另一端。3.干燥 将推好的血涂片在空中晃动，使其迅速干燥 血涂片的制备血涂片的制备 将推片向1的方向稍抽回，当血液充满推片的宽度后，以一定均匀的速度向2的方向滑动。一张良好的血涂片要求一张良好的血涂片
3、要求厚薄适宜头体尾明显边缘整齐，两侧留有空隙注意事项注意事项1.载玻片应清洁、干燥、中性、无尘、无油脂，表面平而光滑。新购置的载玻片常带有游离碱质，必须用约1mol/L HCL浸泡24小时后，再用清水冲洗，干燥后备用。2.推片与血液接触的边缘要光滑、整齐，推片使用后要及时把血擦干净。3.推好的血涂片应在空气中晃动，使其尽快干燥。天气寒冷或潮湿时，应与37恒温箱中保温促干，以免细胞变形缩小。4.血涂片应在1小时内染色或在1小时内用无水甲醇（含水量3%)固定后染色。注意事项注意事项 5.血涂片影响因素主要有：血滴大、血黏度高、推片角度大、速度快则血膜厚，反之则血膜薄。所以针对不同的患者应有的放矢，
4、对红细 胞比积高、血黏度高的患者应采用小血滴、小 角度、慢推；而贫血患者则采用大血滴、大角 度、快推。血涂片染色血涂片染色 常用的染色方法常用的染色方法瑞氏（瑞氏（WrightWright）染色法：）染色法：对胞浆染色效果好，特别是中性颗粒，对核 着色较差。瑞氏瑞氏-姬姆萨（姬姆萨（Wright-Giemsa)Wright-Giemsa)复合染色法：复合染色法：即以稀释吉姆萨液代替缓冲液。或先用瑞氏 染色法染色后，再用稀释吉姆萨复染。瑞氏染色法瑞氏染色法原理原理 瑞氏染色法使细胞着色既有化学亲和反应，又有物理吸附作用。各种细胞由于其所含化学成分不同，对染料的亲和力也不一样，因此，染色后各种细胞
5、呈现出各自的染色特点。瑞氏染色法瑞氏染色法试剂试剂1.瑞氏染液：（1）瑞氏染料 0.1g （2）甲醇 60ml （3）中性甘油 23ml2.PH6.8磷酸盐缓冲液瑞氏染液瑞氏染液（1）瑞氏染料：由酸性染料伊红和碱性染料美兰 的氧化物（天青）组成。（2）甲醇：作为一种有机溶剂可使瑞氏染料保持在 解离状态（M+E-）；同时甲醇具有强 大的脱水力，可将细胞固定为一定形态并使 细胞内蛋白质沉淀，形成颗粒状或网状结构，增加细胞与染料接触的表面积，提高对染料 的吸附作用，增加染色效果。（3）甘油：防止染色中染料过早挥发，并可使细胞 着色清晰。染色方法染色方法1.用蜡笔在血膜两头画线，然后将血片平放在染色架
6、上 2.加瑞氏染液数滴，覆盖整个血膜，固定细胞约1分钟 3.滴加等量或加倍的缓冲液，用洗耳球吹，使之与染液充分混匀，并染色510分钟 4.清水在玻片无血膜处冲去染液，待干后镜检染色结果染色结果 血膜外观成紫红色,红细胞呈粉红色，细胞核呈紫红色，嗜酸性颗粒呈桔红色，嗜碱性颗粒呈紫黑色。注意事项注意事项1.pH值对细胞染色有影响 由于细胞中各种蛋白质均为两性电解质，所带电荷随溶液pH而定。对某一蛋白质而言，如环境pHpI(蛋白质的等电点），则该蛋白质带正电荷，即在酸性环境中正电荷增多，易于酸性伊红结合，染色偏红；相反，则易于美兰天青结合，染色偏蓝。为此，应使用清洁中性的载玻片，稀释染液必须用pH6
7、.8缓冲液。冲洗玻片必须用流水。偏酸 合适 偏碱注意事项注意事项2.未干透的血膜不能染色，否则染色时血膜会脱落。3.染色时间与染液浓度、染色时温度成反比；而与细胞数量成正比。4.冲洗时不能先倒掉染料，应用流水冲去，以防染料沉淀在血膜上。5.如血膜上有染料颗粒沉积，可加少许甲醇溶解，但需立即用水冲掉甲醇，以免脱色。注意事项注意事项6.染色过淡，可以复染。复染时应先加缓冲液，创造良好的染色环境，而后加染液，或加缓冲液与染液的混合液，不可先加染液。7.染色过深，可用水冲洗或浸泡水中一定时间，也可用甲醇脱色。8.染色偏碱或染色偏酸，均应更换缓冲液再重染。瑞氏瑞氏-姬姆萨复合染色法姬姆萨复合染色法 姬姆
8、萨染色原理与瑞氏染色相同，但提高了噻嗪染料的质量，加强了天青的作用，对细胞核着色效果较好，但对中性颗粒着色较瑞氏染色差。因此，瑞氏-姬姆萨复合染色法可取长补短，使血细胞的颗粒及胞核均能获得满意的染色效果。染色方法染色方法 珠海贝索生物技术有限公司试剂盒 方法：1.滴加瑞氏-姬姆萨A液（约0.5ml0.8ml）于涂片上，并让染液覆盖整个标本涂片染色1分钟。2.再将瑞氏-姬姆萨B液滴加于A液上面（滴加之量为A液的 23倍），以嘴或洗耳球吹出微风使液面产生涟漪状，使两液充分混匀，染色（310）分钟。3.水洗（冲洗时不能先倒掉染液，应以流水冲去，以防有 沉渣沉淀在标本上），干燥、镜检。白细胞分类计数白
9、细胞分类计数白细胞分类计数白细胞分类计数实验目的：掌握显微镜白细胞分类计数的方法及各种白细胞的正常形态白细胞分类计数白细胞分类计数原理原理 将血液制成血涂片，用瑞氏-姬姆萨染液染色，根据各类细胞的形态特点和颜色差异将白细胞区别并进行计数。通常分类100个白细胞，计算得出各种白细胞所占的百分率。白细胞分类计数白细胞分类计数实验用品：显微镜、香柏油、擦镜纸等 已制备好的血涂片分类计数方法分类计数方法1.低倍镜观察白细胞的数量、分布和染色情况观察全片，包括白细胞的分布和染色情况2.选择血涂片体尾交界处染色良好的部位，用油镜分类100200个细胞 3.记录五种白细胞的细胞数 血涂片的观察血涂片的观察
10、镜检部位：一般体积小的细胞分布在头部和体部比较多；而尾部和两侧以中性粒细胞和单核细胞较多，异常大的细胞在片尾末端出现，所以在体尾交界处观察细胞。血涂片的观察血涂片的观察油镜 油镜分类时应按一定走向，不要重复计数。李四李四123123血涂片的观察血涂片的观察记录方法记录方法（1）手工完全记录法：将所见的白细胞按其分类用 “正”或“+”的方法记录至所需总数（2）手工半记录法：用上法记录除中性粒细胞以外 的各种白细胞，同时默记总数至所需细胞数（3）分类记数器法参考值参考值白细胞白细胞百分率（百分率（%）绝对值（绝对值（x10 x109 9/L/L）中性杆状核粒细胞1-50.04-0.5中性分叶核粒细
11、胞50-702-7嗜酸性粒细胞0.5-50.02-0.5嗜碱性粒细胞0-10-0.1淋巴细胞20-400.8-4单核细胞3-80.12-0.8外周血中白细胞形态外周血中白细胞形态白细胞白细胞中性粒细胞中性粒细胞嗜酸性粒细胞嗜酸性粒细胞嗜碱性粒细胞嗜碱性粒细胞淋巴细胞淋巴细胞单核细胞单核细胞 中性分叶核粒细胞中性分叶核粒细胞中性杆状核粒细胞中性杆状核粒细胞嗜碱性粒细胞嗜碱性粒细胞嗜酸性粒细胞嗜酸性粒细胞淋巴细胞淋巴细胞单核细胞单核细胞中性杆状核粒细胞中性杆状核粒细胞 中性分叶核粒细胞中性分叶核粒细胞嗜酸性粒细胞嗜酸性粒细胞嗜碱性粒细胞嗜碱性粒细胞 胞浆少，常呈淡红或淡紫红色，含少量粗大、不均匀、
12、排列不规则的紫黑色嗜碱性颗粒，常盖于核上，及细胞边缘淋巴细胞淋巴细胞小淋巴细胞：细胞圆形，直径6-10um，胞浆很少，有的仅在核的一侧出现一线蓝色胞浆，甚至完全没有。细胞核圆形，偶见凹陷，染色质粗糙致密，可有块状。大淋巴细胞：体积较大，直径10-15um，胞浆丰富 ，呈透明蓝色，常有少量粗大、大小不均的紫红色嗜天青颗粒。细胞核染色质疏松单核细胞单核细胞 细胞圆形或不规则形，为外周血中最大的细胞，直径15-25um 胞浆丰富，染淡蓝或灰蓝色，呈毛玻璃样半透明，含有大量细小、灰尘样嗜天青颗粒，可见空泡 细胞核大，呈不规则圆形、肾形、马蹄形或不规则分叶，有时折叠扭曲 染色质细致、疏松如网状 白细胞分
13、类计数白细胞分类计数 外周血中五种类型白细胞的外周血中五种类型白细胞的 相对百分比相对百分比和和绝对计数绝对计数u一般情况计数一般情况计数100100个白细胞，并计算出各种白细胞所占个白细胞，并计算出各种白细胞所占的比例。的比例。u同时观察各种细胞的形态（大小、外形、胞质、胞核）同时观察各种细胞的形态（大小、外形、胞质、胞核）有无变化有无变化。1.1.样品采集样品采集 静脉采血静脉采血 毛细血管采血毛细血管采血2.2.自动化血细胞分析仪自动化血细胞分析仪3.3.WBCWBC手工分类计数手工分类计数紫色真空采血管紫色真空采血管抗凝剂：抗凝剂：EDTA-K2 1.5-2.0mg/mlEDTA-K2
14、 1.5-2.0mg/ml Wright-Giemsa:Wright-Giemsa:甲醇甲醇 :将细胞固定在玻片上将细胞固定在玻片上 美兰染液与美兰染液与RNA,DNARNA,DNA结合结合=蓝色蓝色/紫色紫色 伊红与血红蛋白，嗜酸性颗粒结合伊红与血红蛋白，嗜酸性颗粒结合=粉色粉色/红色红色磷酸盐缓冲液的磷酸盐缓冲液的pHpH值非常重要值非常重要血涂片制作：推片载玻片血液将推片匀速向前，勿停顿。涂片的厚薄取决于速度和角度：快、大(厚)。慢、小（薄）一张满意的血涂片应厚薄均匀 头 体 尾鲜明涂片干燥后用铅笔在血涂片的头部写上姓名和编号李四B 1 2 3试验步骤试验步骤血涂片的制备：血涂片的制备：
15、u推片角度推片角度30-4030-40度度u血涂片的厚薄的影响因素：血涂片的厚薄的影响因素：推片角度推片角度 推片速度推片速度 血样的粘滞度血样的粘滞度low HCTsmall angle 尾体头血涂片染色血涂片染色uWrights Giemsa Wrights Giemsa 染色染色:1-2min:1-2minu磷酸盐缓冲液磷酸盐缓冲液 :15min:15minu蒸馏水冲洗干净蒸馏水冲洗干净u染色时间受染液浓度和室内温度影响染色时间受染液浓度和室内温度影响血涂片染色血涂片染色勿冲洗再加勿冲洗再加瑞氏染色瑞氏染色液液5-8滴后将滴后将液和液和液充分混允静置液充分混允静置10分钟分钟直接流水冲洗
16、3-5分钟（切勿先到掉染液）涂片经水洗干燥后用油镜分类计数100个白细胞李四李四123123涂片干燥后加瑞氏染色涂片干燥后加瑞氏染色液液5-8滴滴覆盖整个血膜覆盖整个血膜1分钟分钟显微镜镜检显微镜镜检u1010倍镜倍镜:观察血涂片的质量、血细胞是否凝集、观察血涂片的质量、血细胞是否凝集、是否有寄生虫。是否有寄生虫。u100100倍油镜：观察红细胞形态进行白细胞分类倍油镜：观察红细胞形态进行白细胞分类计数。计数。血涂片的观察：血涂片的观察：经染色后的血涂片先用低倍镜观察：经染色后的血涂片先用低倍镜观察：1.1.染色情况染色情况(满意、偏酸、偏碱）满意、偏酸、偏碱）2.2.观察细胞分布情况，选择细
17、胞分布均匀之处转浸观察细胞分布情况，选择细胞分布均匀之处转浸油镜油镜进进行白细胞分类计数。行白细胞分类计数。油镜分类时应按一定走向，不要重复计数。油镜分类时应按一定走向，不要重复计数。李四李四123123白细胞白细胞中性粒细胞中性粒细胞嗜酸性粒细胞嗜酸性粒细胞嗜碱性粒细胞嗜碱性粒细胞淋巴细胞淋巴细胞单核细胞单核细胞中性杆状核粒细胞胞体圆形，直径胞体圆形，直径10-15um10-15um，为红细胞，为红细胞的两倍的两倍胞质丰富，粉红色，含较多细小均胞质丰富，粉红色，含较多细小均匀的紫红色中性颗粒匀的紫红色中性颗粒细胞核染色质粗糙不匀，排列紧密，细胞核染色质粗糙不匀，排列紧密，为深紫红色为深紫红色
18、标准：核径最窄处小于最宽处标准：核径最窄处小于最宽处1/31/3为分叶核为分叶核 核径最窄处大于最宽处核径最窄处大于最宽处1/31/3为杆状核为杆状核u 细胞圆形，直径细胞圆形，直径14-16um14-16umu 胞浆内充满粗大、整齐、均匀、排列紧密、胞浆内充满粗大、整齐、均匀、排列紧密、有立体感的桔红色嗜酸性颗粒，偶见少许淡有立体感的桔红色嗜酸性颗粒，偶见少许淡蓝或无色胞浆蓝或无色胞浆u 嗜酸性粒细胞容易破碎，颗粒可分散于细胞嗜酸性粒细胞容易破碎，颗粒可分散于细胞周围周围u 细胞圆形，直径细胞圆形，直径14-16um14-16umu 胞浆少，常呈淡红或淡紫红色，含少量粗大、胞浆少，常呈淡红或
19、淡紫红色，含少量粗大、不均匀、排列不规则的紫黑色嗜碱性颗粒，不均匀、排列不规则的紫黑色嗜碱性颗粒，常盖于核上，及细胞边缘常盖于核上，及细胞边缘u 小淋巴细胞：细胞圆形，直径小淋巴细胞：细胞圆形，直径6-10um6-10um，胞，胞浆很少，有的仅在核的一侧出现一线蓝色浆很少，有的仅在核的一侧出现一线蓝色胞浆，甚至完全没有。细胞核圆形，偶见胞浆，甚至完全没有。细胞核圆形，偶见凹陷，染色质粗糙致密，可有块状。凹陷，染色质粗糙致密，可有块状。u 大淋巴细胞：体积较大，直径大淋巴细胞：体积较大，直径10-15um10-15um，胞浆丰富胞浆丰富 ，呈透明蓝色，常有少量粗大、，呈透明蓝色，常有少量粗大、大
20、小不均的紫红色嗜天青颗粒。细胞核染大小不均的紫红色嗜天青颗粒。细胞核染色质疏松色质疏松细胞圆形或不规则形，为外周血中最大的细胞，直径15-25um胞浆丰富，染淡蓝或灰蓝色，呈毛玻璃样半透明，含有大量细小、灰尘样嗜天青颗粒，可见空泡细胞核大，呈不规则圆形、肾形、马蹄形或不规则分叶，有时折叠扭曲染色质细致、疏松如网状中性分叶核中性分叶核嗜酸性粒细嗜酸性粒细胞胞嗜碱性粒细嗜碱性粒细胞胞中性杆状核中性杆状核淋巴细胞淋巴细胞单核细胞单核细胞正常参考值正常参考值 中性粒细胞中性粒细胞 50-70%50-70%嗜酸性粒细胞嗜酸性粒细胞 0.5-5%0.5-5%嗜碱性粒细胞嗜碱性粒细胞 0-1%0-1%单核细胞单核细胞 3-8%3-8%淋巴细胞淋巴细胞 20-40%20-40%中性粒细胞中性粒细胞 淋巴细胞淋巴细胞感染或化脓性炎症感染或化脓性炎症 相对增多相对增多 中毒中毒 某些传染病某些传染病 升高升高 急性出血急性出血 升高升高 （传淋、传单、结核等）（传淋、传单、结核等）恶性肿瘤恶性肿瘤 传染病恢复期传染病恢复期 急、慢性淋巴细胞白血急、慢性淋巴细胞白血病病 某些感染某些感染 相对减少相对减少 化学药物中毒化学药物中毒 传染病急性期传染病急性期 减低减低 某些血液病某些血液病 降低降低 放射病放射病 脾亢和免疫性疾病脾亢和免疫性疾病 细胞免疫缺陷病细胞免疫缺陷病 放射病放射病
