1、生物技术实践讲授内容一、果酒和果醋的制作果醋果醋葡萄酒代谢类型：代谢类型：适宜发酵温度：适宜发酵温度：发酵条件：发酵条件：自然发酵菌种来源自然发酵菌种来源分类分类：生殖方式（主要）：生殖方式（主要）：环境不适宜时产生孢子进入休眠状态环境不适宜时产生孢子进入休眠状态酵母菌酵母菌醋酸菌醋酸菌C6H12O6 2C2H5OH+2 CO2C6H12O6+6O2 6CO2+6H2OC2H5OH+O2 CH3COOH+H2OC6H12O6 3CH3COOH实验流程图醋酸发酵果醋果酒酒精发酵挑选葡萄冲洗榨汁7-8d10-12d思考思考1、应先冲洗葡萄还是先除去枝梗？为什么？、应先冲洗葡萄还是先除去枝梗？为什么
2、？思考思考2 2、不能反复冲洗，为什么？、不能反复冲洗，为什么？先冲洗再除去枝梗，以免除去枝梗时葡萄破损，增加杂菌污染的机会。先冲洗再除去枝梗，以免除去枝梗时葡萄破损，增加杂菌污染的机会。葡萄皮上有酵母菌葡萄皮上有酵母菌实验装置实验装置A A（如图）（如图）（2 2）此后再将瓶盖拧紧，目的是）此后再将瓶盖拧紧，目的是（3 3）当发酵产生酒精后，再将瓶盖打开，盖上一层纱布，）当发酵产生酒精后，再将瓶盖打开，盖上一层纱布，原因是原因是（4 4）分析此发酵装置不足之处）分析此发酵装置不足之处（1 1）发酵过程中，每隔）发酵过程中，每隔12h12h左右将瓶盖拧左右将瓶盖拧 松一次（注意不是打开瓶盖）为
3、什么？松一次（注意不是打开瓶盖）为什么？酒精发酵过程中产生酒精发酵过程中产生COCO2 2，瓶盖拧松放出，瓶盖拧松放出COCO2 2 防止进入防止进入OO2 2，继续进行酒精发酵，继续进行酒精发酵制造有氧条件，进行醋酸发酵制造有氧条件，进行醋酸发酵易被杂菌污染易被杂菌污染方程式为方程式为:C C2 2H H5 5OH+OOH+O2 2 CH CH3 3COOH+HCOOH+H2 2OO实验装置实验装置B B思考思考3 3 为何发酵瓶要留为何发酵瓶要留1/31/3的空间？的空间？暂时储存暂时储存COCO2 2，起缓冲作用，起缓冲作用思考思考4 4 若在果汁中含有醋酸菌，在果酒发酵旺盛时，若在果汁
4、中含有醋酸菌，在果酒发酵旺盛时，醋酸菌能否将果汁中的糖发酵为醋酸醋酸菌能否将果汁中的糖发酵为醋酸?不能，因为果酒发酵时缺氧能抑制醋酸菌不能，因为果酒发酵时缺氧能抑制醋酸菌的生长，且醋酸菌发酵条件是氧气充足。的生长，且醋酸菌发酵条件是氧气充足。思考思考5 5 制葡萄醋时，为什么要适时通过充气口充气？制葡萄醋时，为什么要适时通过充气口充气？醋酸菌是好氧菌，在将酒精变为醋酸时需要氧的参与醋酸菌是好氧菌，在将酒精变为醋酸时需要氧的参与如何检验果酒、果醋的制作是否成功？如何检验果酒、果醋的制作是否成功？嗅味和品尝、嗅味和品尝、显微镜观察酵母菌、用重铬酸钾检验酒精的存在显微镜观察酵母菌、用重铬酸钾检验酒精
5、的存在嗅味和品尝、嗅味和品尝、比较发酵前后的比较发酵前后的pH、显微镜观察是否有醋酸菌显微镜观察是否有醋酸菌结果分析与评价学习活动：学习活动：阅读阅读“课题延伸课题延伸”，思考：，思考：原理：在原理：在酸性酸性条件下，重铬酸钾与酒精反应呈条件下，重铬酸钾与酒精反应呈 。酒精发酵后是否有酒精产生，可用酒精发酵后是否有酒精产生，可用 来检验。来检验。重铬酸钾重铬酸钾灰绿色灰绿色课题延伸橙橙红红色色灰灰绿绿色色重铬酸钾重铬酸钾重铬酸钾与酒精反应重铬酸钾与酒精反应学习活动：学习活动：阅读阅读“课题延伸课题延伸”，思考：，思考：方法：（填表，注意对照原则）方法：（填表，注意对照原则）操作操作试管甲试管甲
6、试管乙试管乙发酵液发酵液2mL蒸馏水蒸馏水3mol/LH2SO4饱和重铬酸钾溶液饱和重铬酸钾溶液现象现象2mL3滴滴3滴滴3滴滴3滴滴灰绿色灰绿色橙色橙色课题延伸果果酒酒和和果果醋醋的的制制作作基基础础知知识识实验设计实验设计结果分析与评价结果分析与评价果酒果酒制作制作酵母菌的来源：酵母菌的来源：表皮附着的野生型酵母菌表皮附着的野生型酵母菌果醋果醋制作制作温度：温度：3035时间：时间：7-8天天空气：充足的氧气空气：充足的氧气酵母菌的酵母菌的生活方式生活方式好氧条件产生好氧条件产生CO2、H2O厌氧条件产生厌氧条件产生C2H5OH、CO2酵母菌发酵的温度：酵母菌发酵的温度：18-25C2H5
7、OH+O2CH3COOH+H2O挑选葡萄挑选葡萄 冲洗冲洗 榨汁榨汁酒精发酵酒精发酵醋酸发酵醋酸发酵果醋果醋果酒果酒课堂小结课堂小结课题延伸课题延伸重铬酸钾重铬酸钾+酒精酒精 灰绿色（酸性条件）灰绿色（酸性条件）二、腐乳的制作1、腐乳制作的原理（1）、参与的菌种在豆腐的发酵过程中，有许多种微生物参与，如青霉、酵母在豆腐的发酵过程中，有许多种微生物参与，如青霉、酵母 、曲霉、毛霉等，其中起、曲霉、毛霉等，其中起主要作用的是主要作用的是毛霉毛霉 。在多种微生物的协同作用下，普通的豆腐转变为我们爱吃的腐乳。在多种微生物的协同作用下，普通的豆腐转变为我们爱吃的腐乳。（2）、制作原理 毛霉产生的蛋白酶蛋
8、白质 小分子的肽和氨基酸 脂肪酶脂肪 甘油和脂肪酸2 2腐乳制作的实验流程腐乳制作的实验流程豆腐上生长毛霉加盐腌制加卤汤装瓶密封腌制条件：严格无菌，1518，具有一定湿度；时间：48h后毛霉开始生长，3d后菌丝生长旺盛，5d后豆腐块表面布满菌丝；加盐作用：可以析出豆腐中的水分，使豆腐块变硬；抑制微生物的生长，避免豆腐块腐败变质；盐的用量：盐：毛坯质量=1:5；随层数的加高增加盐的用量；腌制时间：8d加酒的作用：抑制微生物生长；使腐乳具有独特的香味；香辛料的作用：调制腐乳风味；杀菌作用卤汤的配制根据个人风味装瓶时操作迅速，避免杂菌污染时间：6个月思考与练习1、酒精含量过高时，腐乳成熟的时间为何会
9、延长？精含量过高时，腐乳成熟的时间为何会延长？酒精可抑制蛋白酶的活性，酒精含量越高，对蛋白酶的酒精可抑制蛋白酶的活性，酒精含量越高，对蛋白酶的抑制作用越大，从而使腐乳成熟时间延长。抑制作用越大，从而使腐乳成熟时间延长。2、通过哪些方式可以防止腐乳被杂菌污染？酵母菌，酵母菌，真菌，兼真菌，兼性厌氧性厌氧醋酸菌，醋酸菌，细菌，好细菌，好氧菌氧菌毛霉，真毛霉，真菌，菌，异养异养需氧需氧乳酸菌，细乳酸菌，细菌，厌氧菌菌，厌氧菌酵母菌的酵母菌的无氧呼吸无氧呼吸产生酒精产生酒精20无氧无氧重铬酸钾重铬酸钾与其反应与其反应呈灰绿色呈灰绿色醋酸菌的醋酸菌的有氧呼吸有氧呼吸产生醋酸产生醋酸3035通通入氧气入氧
10、气品尝、品尝、pHpH试纸试纸检测检测毛霉产生毛霉产生蛋白酶和蛋白酶和脂肪酶脂肪酶1518接接种，酒精含种，酒精含量控制在量控制在12左右左右乳酸菌无乳酸菌无氧呼吸产氧呼吸产生乳酸生乳酸常温，无常温，无氧条件氧条件一、微生物的实验室培养1、基础知识（1）培养基培养基的种类包括固体培养基和液体培养基等。琼脂是从红藻中提取的多糖，在配制培养基中用作为凝固剂。培养基配制原则：目的明确、营养协调、pH值适宜1000mL牛肉膏蛋白胨培养基的营养成分培养基组分培养基组分提供的主要营养提供的主要营养牛肉膏 5g碳源、磷酸盐和维生素蛋白胨 10g氮源和维生素NaCl 5g无机盐水 定容至1000ml氢元素、氧
11、元素（2）无菌技术消毒：指使用较为温和的物理和化学方法仅杀死物体表面或内部的一部分对人体有害的微生物（不包括芽孢和孢子）。灭菌：指使用强烈的理化因素杀死物体内外的所有微生物包括芽孢和孢子。、消毒方法：煮沸消毒法、酒精擦拭双手，氯气消毒水源、灭菌的方法：灼烧灭菌（接种环、接种针、试管口等）干热灭菌（玻璃器皿、金属用具等）高压蒸汽灭菌（培养基、无菌水等）2、实验操作制备牛肉膏蛋白胨固体培养基计算称重溶化灭菌倒平板根据配方比例计算100ml所需的各物质的量称量后放入烧杯，加入少量水，加热溶化并加入琼脂，此过程用玻璃棒不断搅拌。转移锥形瓶用牛皮纸包好，送入高压灭菌锅。100kpa，121，1530mi
12、n 1.1.培养基灭菌后，需要冷却到培养基灭菌后，需要冷却到50 50 左左右时，才能用来倒平板。你用什么办法来估右时，才能用来倒平板。你用什么办法来估计培养基的温度？计培养基的温度？2.2.为什么需要使锥形瓶的瓶口通过火焰？为什么需要使锥形瓶的瓶口通过火焰？3.3.平板冷凝后，为什么要将平板倒置？平板冷凝后，为什么要将平板倒置？4.4.在倒平板的过程中，如果不小心将培养基在倒平板的过程中，如果不小心将培养基溅在皿盖与皿底之间的部位，这个平板还能溅在皿盖与皿底之间的部位，这个平板还能用来培养微生物吗？为什么？用来培养微生物吗？为什么？实验方法介绍一旦划破，会造成划线不均匀，难以一旦划破，会造成
13、划线不均匀，难以达到分离单菌落的目的；达到分离单菌落的目的；二是存留在划破处的单个细胞无法形二是存留在划破处的单个细胞无法形成规矩的菌落，菌落会沿着划破处生成规矩的菌落，菌落会沿着划破处生长，会形成一个条状的菌落长，会形成一个条状的菌落。将菌液进行一系列的梯度稀释，将菌液进行一系列的梯度稀释，然后将不同稀释度的菌液分别涂布到固然后将不同稀释度的菌液分别涂布到固体培养基的表面，进行培养。体培养基的表面，进行培养。稀释涂布平板法稀释涂布平板法梯度稀释菌液梯度稀释菌液分别（依次）涂布平板分别（依次）涂布平板1.将分别盛有将分别盛有9mL水的水的6支试管灭菌，支试管灭菌，并按并按101106的顺序编号
14、。的顺序编号。梯度稀释菌液梯度稀释菌液 移液管需要经过移液管需要经过灭菌。操作时，试管口和灭菌。操作时，试管口和移液管离火焰移液管离火焰12cm处处.涂布平板涂布平板土壤中分解尿素的细菌的分离与计数土壤中分解尿素的细菌的分离与计数基础知识基础知识1.1.分离分离 -筛选菌株筛选菌株筛选原理筛选原理:人为提供有利于目的菌株生长的人为提供有利于目的菌株生长的条件条件，同时抑，同时抑制或阻止其他微生物生长。制或阻止其他微生物生长。筛选方法筛选方法:选择培养基培养选择培养基培养控制培养基的控制培养基的PHPH控制培养的温度控制培养的温度(氧浓度等氧浓度等)2.2.计数计数筛选方法筛选方法:用显微镜用显
15、微镜直接直接计数计数间接间接计数计数统计平板的菌落数统计平板的菌落数间接计数法（活菌计数法）间接计数法（活菌计数法）:原理原理:在在稀释度稀释度足够足够高高时，微生物在固体培养基上时，微生物在固体培养基上所形成的所形成的一个菌落一个菌落是由是由一个单细胞一个单细胞繁殖而成繁殖而成的，即一个菌落的，即一个菌落代表代表原先的一个细菌原先的一个细菌方法方法:稀释涂布平板法稀释涂布平板法计算公式计算公式:（C CV V）x Mx M实验设计与操作实验设计与操作1.1.土壤取样土壤取样2.2.制备培养基制备培养基3.3.接种、培养、观察接种、培养、观察4.4.细菌的计数细菌的计数1.1.土壤取样土壤取样
16、2.2.制备培养基制备培养基牛肉膏蛋白胨培养基牛肉膏蛋白胨培养基对照对照选择培养基选择培养基 -尿素为唯一氮源尿素为唯一氮源3.3.接种、培养、观察接种、培养、观察稀释涂布平板接种稀释涂布平板接种稀释液的倍数的范围稀释液的倍数的范围:真菌真菌:10:102 210104 4 细菌细菌:10:104 410106 6 放线菌放线菌:10:103 310105 5每一个浓度做每一个浓度做3 3个或个或3 3个以上个以上平板平板,求平均值求平均值重复实验重复实验-增强说服力和准确性增强说服力和准确性3.3.接种、培养、观察接种、培养、观察时间时间 温度温度细菌细菌1-2d 301-2d 303737
17、O OC C放线菌放线菌霉菌霉菌5-7d 255-7d 252828O OC C3-4d 253-4d 252828O OC C4.4.细菌的计数细菌的计数每隔每隔24h24h统计一次菌落数目。统计一次菌落数目。当菌落当菌落数目数目稳定稳定时，选取菌落数在时，选取菌落数在30-30030-300的平板进行的平板进行计数。计数。每同一浓度至少对每同一浓度至少对3 3个平板进行重复计数个平板进行重复计数,求平均值求平均值 再根据对应稀释的计算出样品中的细菌数再根据对应稀释的计算出样品中的细菌数 计数计数每克土壤中菌株数每克土壤中菌株数 (C/V C/V)X MX M平板的平均平板的平均菌落数菌落数
18、X X 稀释液的稀释液的稀释倍数稀释倍数涂布时所用稀释液涂布时所用稀释液体积体积课题延伸课题延伸原理原理细菌分解尿素时产生细菌分解尿素时产生氨氨，氨使培养，氨使培养基的碱性增强。基的碱性增强。因此，可通过检测培养基因此，可通过检测培养基PHPH变化来鉴定变化来鉴定该种细菌能否分解尿素该种细菌能否分解尿素方法方法在选择培养基中加酚红指示剂在选择培养基中加酚红指示剂,培养培养细菌，观察指示剂是否变红。细菌，观察指示剂是否变红。对分离的菌种作进一步的鉴定对分离的菌种作进一步的鉴定分解纤维素的微生物的分离分解纤维素的微生物的分离基础知识基础知识1.1.纤维素与纤维素酶纤维素与纤维素酶：一种由葡萄糖首尾
19、相连而成的高分子化合物，一种由葡萄糖首尾相连而成的高分子化合物，广泛地存在于植物的根、茎、叶等器官中。广泛地存在于植物的根、茎、叶等器官中。：由微生物分泌的一种复合酶，包括由微生物分泌的一种复合酶，包括酶酶、酶和葡萄糖苷酶，由于它们的协同作用，最终将纤维素分酶和葡萄糖苷酶，由于它们的协同作用，最终将纤维素分解成葡萄糖。解成葡萄糖。纤维素纤维素酶酶酶酶纤维二糖纤维二糖葡萄糖葡萄糖苷苷 酶酶葡萄糖葡萄糖2.2.刚果红染色法刚果红染色法筛选纤维素分解菌的原理筛选纤维素分解菌的原理实验设计实验设计土壤取样土壤取样选择培养选择培养梯度稀释梯度稀释将样品涂布到鉴别纤维将样品涂布到鉴别纤维素分解菌的培养基上
20、素分解菌的培养基上挑选产生透明挑选产生透明圈的菌落圈的菌落1.1.实验流程实验流程选择培养选择培养 将土样加入装有将土样加入装有30ml30ml选择培养基的锥形选择培养基的锥形瓶中，将锥形瓶固定在摇床上，在一定温度瓶中，将锥形瓶固定在摇床上，在一定温度下震荡培养下震荡培养1 12 2天，直至培养液变浑浊。也天，直至培养液变浑浊。也可重复选择培养可重复选择培养刚果红染色法刚果红染色法思考：思考：这两种方法各有哪些优点与不足这两种方法各有哪些优点与不足 方法一方法一 缺点缺点是操作烦琐，加入刚果红溶是操作烦琐，加入刚果红溶液会使菌落之间发生混杂；液会使菌落之间发生混杂；优点优点是这样显示出是这样显
21、示出的颜色反应基本上是纤维素分解菌的作用的颜色反应基本上是纤维素分解菌的作用 方法二方法二 优点优点是操作简便，不存在菌落混是操作简便，不存在菌落混杂问题杂问题缺点一缺点一是由于培养基中还含有淀粉类物质，可是由于培养基中还含有淀粉类物质，可使产生淀粉酶的菌落也出现透明圈使产生淀粉酶的菌落也出现透明圈(模糊模糊)；缺点二缺点二有些微生物具有降解色素的能力，它们有些微生物具有降解色素的能力，它们在长时间培养过程中会形成明显的透明圈在长时间培养过程中会形成明显的透明圈三、植物的组织培养技术1、菊花的组织培养基础知识1、植物组织培养的基本过程植物组织形成愈伤组织长出从芽生根移栽成活 脱分化 再分化愈伤
22、组织：细胞排列疏松而无规则，是一种高度液泡化的呈无定形状态的薄壁细胞。脱分化：由高度分化的植物组织或细胞产生愈伤组织的过程。再分化：脱分化产生的愈伤组织继续进行培养，又可以重新分化成根或芽等器官的过程。2、影响植物组织培养的因素（1）、植物的材料对于同一植物材料，材料的年龄、保存时间的长短等也会影响实验结果。（2）、适宜的培养基常用的培养基为MS培养基。（3）、pH、温度、光照等条件。（4）、植物激素中生长素和细胞分裂素是启动细胞分裂，脱分化和再分化的关键性因素。两种激素的添加顺序和用量也会影响实验结果。使用顺序使用顺序实验结果实验结果先生长素，后细胞分裂素有利于细胞分裂，但细胞不分化先细胞分
23、裂素，后生长素细胞既分裂又分化同时使用分化频率提高生长素/细胞分裂素 高 利于根的分化，抑制芽的分化生长素/细胞分裂素 低 利于芽的分化，抑制根的分化 生长素/细胞分裂素 适中 促进愈伤组织生长实验设计制备MS培养基外植体消毒接种1、配制各种母液；、配制各种母液；2、配制培养基；、配制培养基；3、灭菌、灭菌1、材料选取：生长旺盛的嫩枝；、材料选取：生长旺盛的嫩枝；2、操作方法：菊花茎段用流水冲洗后加少许洗衣粉，用、操作方法：菊花茎段用流水冲洗后加少许洗衣粉，用软刷轻轻刷洗，刷洗后可在流水下冲洗软刷轻轻刷洗，刷洗后可在流水下冲洗20min，用无菌纸，用无菌纸吸干茎段表面水分，放入体积分数为吸干茎
24、段表面水分，放入体积分数为70%的酒精中摇动的酒精中摇动23次，持续次，持续67s，立即取出外植体，在无菌水中清洗。，立即取出外植体，在无菌水中清洗。取出后用无菌纸吸干水分，放入质量分数为取出后用无菌纸吸干水分，放入质量分数为0.1%的氯化的氯化汞溶液汞溶液12min。取出后，在无菌水中清洗。取出后，在无菌水中清洗3次以上，漂次以上，漂净消毒液。净消毒液。1、超净工作台进行操作、超净工作台进行操作2、操作方法（、操作方法（如下如下）（1）将初步洗涤及切割的材料放入烧杯，带入超净台上，用消毒剂灭菌，）将初步洗涤及切割的材料放入烧杯，带入超净台上，用消毒剂灭菌，再用无菌水冲洗，最后沥去水分，取出放
25、置在灭过菌的纱布上或滤纸上。再用无菌水冲洗，最后沥去水分，取出放置在灭过菌的纱布上或滤纸上。（2）材料吸干后，一手拿镊子、一手拿剪刀或解剖刀，对材料进行适当的）材料吸干后，一手拿镊子、一手拿剪刀或解剖刀，对材料进行适当的切割。如叶片切成切割。如叶片切成0.5cm平方的小块；茎切成含有一个节的小段。微茎尖平方的小块；茎切成含有一个节的小段。微茎尖要剥成只含要剥成只含1-2片幼叶的茎尖大小等。在接种过程中要经常灼烧接种器械，片幼叶的茎尖大小等。在接种过程中要经常灼烧接种器械，防止交叉污染。防止交叉污染。（3）用灼烧消毒过的器械将切割好的外植体插植或放置到培养基上。具体）用灼烧消毒过的器械将切割好的
26、外植体插植或放置到培养基上。具体操作过程（以试管为例）是：先解开包口纸，将试管几乎水平拿着，使试操作过程（以试管为例）是：先解开包口纸，将试管几乎水平拿着，使试管口靠近酒精灯火焰，并将管口在火焰上方转动，使管口里外灼烧数秒钟。管口靠近酒精灯火焰，并将管口在火焰上方转动，使管口里外灼烧数秒钟。若用棉塞盖口，可先在管口外面灼烧，去掉棉塞，再烧管口里面。然后用若用棉塞盖口，可先在管口外面灼烧，去掉棉塞，再烧管口里面。然后用镊子夹取一块切好的外植体送入试管内，轻轻插入培养基上。若是叶片直镊子夹取一块切好的外植体送入试管内，轻轻插入培养基上。若是叶片直接附在培养基上，以放接附在培养基上，以放1-3块为宜
27、。至于材料放置方法除茎尖、茎段要正放块为宜。至于材料放置方法除茎尖、茎段要正放（尖端向上）外，其他尚无统一要求。接种完后，将管口在火焰上再灼烧（尖端向上）外，其他尚无统一要求。接种完后，将管口在火焰上再灼烧数秒种。并用棉塞，塞好后，包上包口纸，包口纸里面也要过火。数秒种。并用棉塞，塞好后，包上包口纸，包口纸里面也要过火。栽培移栽培养将接种后的锥形瓶放入无菌培养箱，培养期间定期消毒。将接种后的锥形瓶放入无菌培养箱，培养期间定期消毒。温度：温度：1822每日灯光照射每日灯光照射12h2 2、花药培养、花药培养基础知识基础知识1、被子植物的花粉发育过程被子植物的双受精现象被子植物的双受精现象产生花药
28、植株的两种途径产生花药植株的两种途径影响花药培养的因素影响花药培养的因素（1）、材料的选择一般在单核期，细胞核由中央移向细胞一侧的时期，花药培养成功率较高。为了挑选单核期，通常选择完全未开放的花蕾。（2）、培养基的组成实验设计实验设计材料的选取接种和培养材料的消毒1、选择花药时一般通过镜检确定花粉是否处于合适的时期（1）、醋酸洋红法；（2）、焙花青铬矾法1、方法：将花蕾放入体积分数为70%的酒精中浸泡大约30s，立即取出，在无菌水中清洗。取出后用无菌纸吸干水分，放入质量分数为0.1%的氯化汞溶液24min。取出后，在无菌水中清洗35次，漂净消毒液。在剥离花药时，尽量不要损伤花药；同时还要彻底除
29、去花丝（因为与花丝相连的花药不利于愈伤组织或胚状体的形成）B B、DNADNA提取原理提取原理资料一：资料一：DNADNA在不同在不同浓度浓度NaClNaCl溶液中溶解溶液中溶解度不同度不同 蛋白质在蛋白质在0.14mol/L中中的溶解度大，在高盐浓的溶解度大，在高盐浓度下溶解度小度下溶解度小本实验中，本实验中，要往鸡血中加入要往鸡血中加入抗凝剂抗凝剂 1、DNA的溶解度最低时，的溶解度最低时，NaCl的物质的量浓度为的物质的量浓度为（）A 2mol/l B 0.1mol/l C 0.14mol/l D 0.015mol/l 2、在向溶解、在向溶解DNA的的NaCl溶液中，不断加入蒸馏水的溶液
30、中，不断加入蒸馏水的目的是（目的是（）A 加快加快DNA溶解的速度溶解的速度 B 加快溶解杂质的速度加快溶解杂质的速度 C 减小减小DNA的溶解度，加快的溶解度，加快DNA析出析出 D减小杂质的溶解度，加快杂质的析出减小杂质的溶解度，加快杂质的析出思考与练习3、向溶有、向溶有DNA的的2mol/L的的NaCl溶液中不溶液中不断加入蒸馏水断加入蒸馏水,在这个过程中在这个过程中DNA的溶解的溶解度变化情况分别是度变化情况分别是A 减小减小;减小减小 B 增大增大;增大增大C 先减小后增大先减小后增大 D增大增大;减小减小4、你能采用其他方法对、你能采用其他方法对DNA进行鉴定吗？进行鉴定吗？用甲基
31、绿染液。结果丝状呈现绿色。用甲基绿染液。结果丝状呈现绿色。课题课题2 2 多聚酶链式反应扩增多聚酶链式反应扩增DNADNA片段片段（PCRPCR）基础知识基础知识一一)PCR)PCR原理原理 PCR PCR是一种在是一种在体外体外快速扩增快速扩增特定基因或特定基因或DNADNA片段片段的技术，它能以极少量的的技术，它能以极少量的DNADNA为模板，在几小时内为模板，在几小时内复制出上百万份的复制出上百万份的DNADNA拷贝。拷贝。1.PCR1.PCR的反应条件的反应条件一定的缓冲溶液一定的缓冲溶液-维持维持pHpH；DNADNA模板；模板；分别与两条模板链相结合的分别与两条模板链相结合的两种两
32、种引物；引物；四种脱氧核苷酸；四种脱氧核苷酸；耐热的耐热的DNADNA聚合酶；聚合酶；控制温度控制温度因此，因此，DNADNA复制方向：只能从子链的复制方向：只能从子链的55端到端到33端端延延伸伸2.DNA2.DNA复制的方向复制的方向 DNA DNA聚合酶聚合酶不能从头开始不能从头开始合成合成DNADNA，只能只能将将核苷酸连接到核苷酸连接到DNADNA片段的片段的33端端。引物引物 能与母链的一段碱基序列互补配对的一小段能与母链的一段碱基序列互补配对的一小段单链单链DNADNA片段或片段或RNARNA且需要且需要引物引物(20(203030个核苷酸个核苷酸)PCRPCR技术通过技术通过控
33、制温度控制温度来控制双链的解旋与结合来控制双链的解旋与结合 DNA DNA在在8080100100时双螺旋结构将解体时双螺旋结构将解体,双链分开双链分开;当当温度降低温度降低后双链又能重新结合成双螺旋结构后双链又能重新结合成双螺旋结构因此因此,PCR,PCR过程过程无需无需解旋酶解旋酶,但需但需耐高温耐高温的的DNADNA聚合酶聚合酶3.DNA3.DNA的热变性原理的热变性原理二二)PCR)PCR的反应过程的反应过程1.1.变性：变性：2.2.复性：复性：3.3.延伸：延伸：循环循环升高温度到升高温度到90900 0C C以上以上DNADNA解聚为单链解聚为单链温度降到温度降到50500 0C
34、 C左右左右两种引物与两条单链两种引物与两条单链DNADNA结合结合升温度升到升温度升到70700 0C C左右左右在在DNADNA聚合酶的作用下用溶液中的脱氧核苷酸聚合酶的作用下用溶液中的脱氧核苷酸根据碱基互补配对原则合成新根据碱基互补配对原则合成新DNADNA链链一一)实验操作步骤实验操作步骤准备好准备好PCRPCR反应体系的配方反应体系的配方用微量移液器按配方在往微量用微量移液器按配方在往微量离心管中加入各组分离心管中加入各组分盖严盖子，用手指轻轻弹击管壁混合反应液盖严盖子，用手指轻轻弹击管壁混合反应液离心离心10S10S将离心管放入将离心管放入PCRPCR仪上仪上,设置设置好循环程序进
35、行反应好循环程序进行反应实验操作实验操作二二)操作提示操作提示PCRPCR技术技术高度灵敏，高度灵敏，为了避免外源为了避免外源DNADNA等因素的污等因素的污染而造成干扰实验，染而造成干扰实验，PCRPCR操作时要注意做到：操作时要注意做到：隔离操作区，所用微量离心管、枪头、缓冲液隔离操作区，所用微量离心管、枪头、缓冲液以及蒸馏水等在使用必须进行以及蒸馏水等在使用必须进行高压蒸汽灭菌高压蒸汽灭菌；所用试剂在所用试剂在-20-20保存保存，使用时，放在，使用时，放在冰块冰块上上慢慢融化。慢慢融化。分装试剂，简化操作程序，使用分装试剂，简化操作程序，使用一次性枪头。一次性枪头。1 1、测定的原理、
36、测定的原理 可以通过计算可以通过计算DNADNA含量来评价扩增的效果，含量来评价扩增的效果，DNADNA在在260nm260nm的紫外线波段有一强烈的吸收峰，的紫外线波段有一强烈的吸收峰，峰值的大小与峰值的大小与DNADNA的含量有关。的含量有关。2 2、过程、过程稀释：稀释：2uLPCR2uLPCR反应液，加入反应液，加入98uL98uL蒸馏水，即将样蒸馏水，即将样品进行品进行5050倍稀释。倍稀释。对照调零对照调零以蒸馏水作为空白对照，在波长以蒸馏水作为空白对照，在波长260nm260nm处，处，将紫外分光光度计的读数调节至零。将紫外分光光度计的读数调节至零。取取DNADNA稀释液稀释液1
37、00uL100uL至比色杯中，测定至比色杯中，测定260nm260nm处处的光吸收值的光吸收值比色比色计算计算DNADNA含量含量(g/mLg/mL)50 x(260nm50 x(260nm的读数的读数)x)x 稀释倍数稀释倍数5050：1 1 g g/mL/mL的的DNADNA在厚度为在厚度为1cm1cm比色杯中的吸光值为比色杯中的吸光值为0.020.021、DNA复制需要引物的主要原因是复制需要引物的主要原因是A 加快复制速度加快复制速度 B 引物可与引物可与DNA母链互补配对母链互补配对C 引物的引物的5端有助于端有助于DNA聚合酶的延伸聚合酶的延伸DNA链链D DNA聚合酶只能从聚合酶
38、只能从3端延伸端延伸DNA链链练习与反馈2、PCR过程中的变性、复性、延伸三步的温度过程中的变性、复性、延伸三步的温度分别是分别是A 95、55 、72 B 72 、50 、92 C 50 、92 、72 D 80 、50 、72 课题课题3 3 血红蛋白的提取和分离血红蛋白的提取和分离基础知识基础知识一一)凝胶色谱法凝胶色谱法 根据被分离物质的蛋白质根据被分离物质的蛋白质相对分子质量相对分子质量的大小，的大小，来进行分离。来进行分离。1.1.概念：概念：思路思路利用不同蛋白质分子的特性利用不同蛋白质分子的特性(形状、大小、形状、大小、带电情况等带电情况等)差异，分离不同种类的蛋白质差异，分离
39、不同种类的蛋白质一一)凝胶色谱法凝胶色谱法2.2.原理：原理：2 2）当相对分子量不同的蛋白质通过凝胶时，相对分当相对分子量不同的蛋白质通过凝胶时，相对分子量子量较小较小的蛋白质容易的蛋白质容易进入进入凝胶凝胶内部内部的通道，路程较的通道，路程较长长，移动速度较移动速度较慢慢;而相对分子量较大的蛋白质无法进入而相对分子量较大的蛋白质无法进入凝胶内部的通道，只能在凝胶外部移动，路程较短，移凝胶内部的通道，只能在凝胶外部移动，路程较短，移动速度较快。动速度较快。1)1)凝胶凝胶是由多糖类化合物是由多糖类化合物(如葡聚糖如葡聚糖)构成的构成的多孔小球体多孔小球体，内部有许多贯穿的，内部有许多贯穿的通
40、道通道。二二)缓冲液缓冲液 在在一定一定的范围内，凡是能够的范围内，凡是能够抵制抵制外加少量强外加少量强酸或强碱的影响使原来溶液酸或强碱的影响使原来溶液PHPH值值基本保持不变基本保持不变的混的混合溶液。合溶液。能够抵制外界的酸和碱对溶液能够抵制外界的酸和碱对溶液PHPH值的影响，值的影响，维持维持PHPH基本不变。基本不变。实验操作实验操作 蛋白质的提取和分离步骤：蛋白质的提取和分离步骤：1.1.样品处理样品处理 2.2.粗分离粗分离 3.3.纯化纯化 4.4.纯度鉴定纯度鉴定 1.1.样品处理样品处理:1)1)红细胞的红细胞的洗涤洗涤:目的目的:去除杂蛋白去除杂蛋白b b低速短时间离心低速
41、短时间离心操作操作:a a采集血样采集血样d d盐水洗涤盐水洗涤c c吸取血浆吸取血浆上层透明的黄色血浆上层透明的黄色血浆重复重复b c db c d步骤三次步骤三次用五倍体积的质量分数为用五倍体积的质量分数为0.90.9的的NaClNaCl溶液洗涤溶液洗涤加抗凝剂柠檬酸钠加抗凝剂柠檬酸钠2)2)血红蛋白的释放：血红蛋白的释放：加蒸馏水到原血液体积加蒸馏水到原血液体积,再加再加4040体积的甲苯体积的甲苯,置于磁力搅拌器上充分搅拌置于磁力搅拌器上充分搅拌1010分钟分钟(加速细胞破裂加速细胞破裂)细胞破裂释放出血红蛋白。细胞破裂释放出血红蛋白。离心离心(以以2000r/min,10 min)2
42、000r/min,10 min)过滤过滤(用滤纸用滤纸,除去脂溶性沉淀层除去脂溶性沉淀层)分离分离(用分液漏斗用分液漏斗,分出下层的分出下层的红色透明液体红色透明液体)2.2.粗分离透析粗分离透析除去样品中分子量除去样品中分子量较小较小的杂质的杂质利用透析袋的利用透析袋的半透性半透性某些杂质分子比血红蛋白分子某些杂质分子比血红蛋白分子小小，可透过可透过透析袋透析袋3.3.纯化纯化 2)2)凝胶色谱柱的凝胶色谱柱的装填装填注意注意:a:a凝胶装填时尽量紧密凝胶装填时尽量紧密,以降低凝胶颗粒之间的空隙以降低凝胶颗粒之间的空隙 b b装填凝胶柱时不得有气泡存在装填凝胶柱时不得有气泡存在4.样品的加入
43、和洗脱样品的加入和洗脱 1.调液面调液面 2.加样加样 3.再调液面再调液面 4.洗脱洗脱 5.收集收集缓冲液缓冲液凝胶凝胶5.5.纯度鉴定纯度鉴定 SDSSDS聚丙烯酰胺凝胶聚丙烯酰胺凝胶电泳电泳鉴定血红蛋白鉴定血红蛋白纯度纯度。略略三三)电泳电泳带电带电粒子粒子在电场作用下发生在电场作用下发生迁移迁移的过程的过程琼脂糖凝胶电泳、琼脂糖凝胶电泳、聚丙稀酰胺聚丙稀酰胺凝胶电泳凝胶电泳SDS-SDS-聚丙稀酰胺凝胶电泳法聚丙稀酰胺凝胶电泳法SDSSDS 十二烷基硫酸钠十二烷基硫酸钠作用作用:能使蛋白质变性能使蛋白质变性(解聚解聚););消除消除净电荷净电荷对迁移率的影响对迁移率的影响,使电泳迁移
44、率使电泳迁移率 完全取决完全取决于分子的于分子的大小大小。蛋白质在聚丙烯酰胺凝胶中的蛋白质在聚丙烯酰胺凝胶中的迁移率迁移率取决取决于它所带于它所带净电荷净电荷的多少以及分子的的多少以及分子的大小大小等因素等因素五、植物有效成分的提取基础知识1 1、植物芳香油的特性：、植物芳香油的特性：具有很强的挥发性，易溶于有机溶剂主要组成包括萜类化合物及其衍生物。2 2、植物芳香油的提取方法、植物芳香油的提取方法蒸馏、压榨、萃取注意：具体采用哪种方法要根据原料的特点来决定（1）原理：混合物又会重新分离出油层和水层。（植物芳香油提取的常用方法植物芳香油提取的常用方法）3、水蒸气蒸馏法、水蒸气蒸馏法利用水蒸气将
45、挥发性较强的植物芳香油携带出来形成油水混合物冷却后 水中蒸馏 水上蒸馏 水气蒸馏（2）分类原理：植物芳香油易溶于有机溶剂（不适用于蒸馏法的原料，可以考（不适用于蒸馏法的原料，可以考虑使用此方法）虑使用此方法）4 4、萃取法、萃取法概念：是将粉粹、干燥的植物原料用有机溶剂浸泡，使芳香油溶解在有机溶剂当中的方法芳香油溶解于有机溶剂后，只需蒸发出有机溶剂，就可获得纯净的植物芳香油注意：用于萃取的有机溶剂必须事先精制，除去杂质，否则会影响芳香油的质量实验设计实验设计 提取玫瑰精油的实验流程示意图 鲜玫瑰花+清水水蒸气蒸馏油水混合物油水分离除水玫瑰油加无水Na2SO4加NaCl0.1g/mL氯化钠溶液：
46、促使油水混合物（乳浊液）中油和水的分离。无水硫酸钠：吸收油层中的水分。静置漂洗压榨过滤石灰水浸泡 再次过滤橘皮油石灰水：防止压榨时滑脱，提高出油率，降低压榨液黏稠度，过滤不堵塞筛眼。小苏打、硫酸钠：促进油和水的分离（用量分别为橘皮质量的0.25和5）。离心练习练习1、下面不能用于提取芳香化合物的是：A.杏仁 B.真菌 C.玫瑰花 D.细菌2、植物芳香油的主要化学成分：A.酚类化合物及衍生物 B.萜类化合物及衍生物 C.醚类化合物 D.烃类化合物3、玫瑰精油提取最适方法是 A萃取法 B水蒸气蒸馏法 C水上蒸馏 D压榨法DBB4、柑橘、柠檬芳香油的制备通常使用压榨法而不是水蒸馏法，是因为A.水中蒸
47、馏会导致原料焦糊 B.柑橘、柠檬芳香油易溶于水c.会使芳香油的有效成分水解 D.A和CD5、玫瑰精油提取的过程是：()A.鲜玫瑰花水水蒸气蒸馏油水混合物分离油层除水 B.鲜玫瑰花水油水混合物水蒸气蒸馏分离油层除水C.鲜玫瑰花水油水混合物除水分离油层 D.鲜玫瑰花水油水混合物水蒸气蒸馏分离油层除水6、在橘皮精油提取过程中石灰水的作用（）.使溶液呈碱性 .为彻底清洗脏物.防止橘皮压榨时滑脱，提高出油率 .漂去橘皮颜色AC7、用于提取植物芳香油的植物器官包括（）A花、茎、叶 B树干、树皮C根、果实、种子 D以上三项全是D8、用于提取植物芳香油的植物器官包括A 花、茎、叶 B 树干、树皮C 根、果实、
48、种子 D 以上三项都是9、提取玫瑰精油的方法有A 只用水蒸气蒸馏法 B 可用蒸馏法和压榨法C 可用蒸馏法和萃取法 D 可用压榨法和萃取法10、在用水蒸气蒸馏法制取玫瑰乳液提纯过程中，先后使用NaCl和无水Na2SO4的作用分别是A 分层、吸水 B 溶解、吸水C 吸水、分层 D 分层、萃取下列是与芳香油提取相关的问题，请回答：（1）玫瑰精油适合用水蒸气蒸馏法提取，其理由是玫瑰精油具有 的性质。蒸馏时收集的蒸馏液 (是、不是)纯的玫瑰精油，原因是 。（2）当蒸馏瓶中的水和原料量一定时，蒸馏过程中，影响精油提取量的主要因素有蒸馏时间和 。当原料量等其他条件一定时，提取量随蒸馏时间的变化趋势是（3）如果蒸馏过程中不进行冷却，则精油提取量会 ，原因是 。（4）密封不严的瓶装玫瑰精油保存时最好存放在温度 的地方，目的是 。易挥发、难溶于水、化学性质稳定 不是 玫瑰精油随水蒸气一起蒸馏出来，所得到的是油水混合物蒸馏温度 一定的时间内提取量随蒸馏时间的延长而增加，一定时间后提取量不再增加下降 部分精油会随水蒸气挥发而流失 较低 减少挥发
