1、DNA复制复制概况复制概况复制体系复制体系复制的起始、延伸与终止复制的起始、延伸与终止其他原核生物的复制体系其他原核生物的复制体系其他形式的复制其他形式的复制真核生物的复制过程真核生物的复制过程DNA复制本讲内容提纲1 DNA复制的基本机理半保留复制复制的基本机理半保留复制2 DNA复制的起点、方向和方式复制的起点、方向和方式3 DNA聚合酶和聚合酶和DNA聚合反应聚合反应4 复制的基本过程复制的基本过程5 DNA复制的半不连续性复制的半不连续性第一组：复制概况 1、DNA复制的基本机理半保留复制复制的基本机理半保留复制半保留复制：半保留复制：DNADNA在复制时，以亲代在复制时，以亲代DNA
2、DNA的每的每一条链作模板，合成完全相同的两个双链一条链作模板，合成完全相同的两个双链子代子代DNADNA，每个子代，每个子代DNADNA中都含有一条亲代中都含有一条亲代DNADNA链。链。全保留复制半保留复制混合复制 DNA半保留复制的实验依据：半保留复制的实验依据：1958年年 Meselson&Stahl E.coli 放射性同位素（放射性同位素（15N）标记）标记 CsCl密度梯度离心密度梯度离心StahlMeselson培养一代培养二代培养三代亲代子一代子二代轻带重带混合带 DNA半保留复制的半保留复制的意义：保证意义：保证DNA代谢的稳代谢的稳定性。定性。经过多代的复制，经过多代的
3、复制，亲代的遗传特征完整无误的亲代的遗传特征完整无误的传递给子代，传递给子代，子代子代DNA仍可以保持与最初亲本仍可以保持与最初亲本的一致性。的一致性。稳定性是相对的，变异是绝对的稳定性是相对的，变异是绝对的在各种理化因素的作用下，DNA会发生损伤；在复制、转录的过程中，DNA会发生错误；在生长发育的过程中，DNA可能进行修饰、删除、扩增和重排。2、DNA复制的起点、方向和方式复制的起点、方向和方式2.1 DNA复制的起点复制的起点 原核生物原核生物DNA的复制是在的复制是在DNA分子的特分子的特定位点开始的，这一位点称为复制起点定位点开始的，这一位点称为复制起点（ori）。）。原核生物的染色
4、体只有一个复制起点，原核生物的染色体只有一个复制起点，复制从起点开始，进行到终点结束，完复制从起点开始，进行到终点结束，完成整个染色体成整个染色体DNA分子的复制。分子的复制。复制子复制子(replicon)或复制单元：或复制单元：DNA分子上一个独立的复制单位，分子上一个独立的复制单位，DNA复复制从起点开始，进行到终点结束。制从起点开始，进行到终点结束。一个复制子包括一个复制起点和复制终点。一个复制子包括一个复制起点和复制终点。n 原核生物单复制起点，整个染色体只有一个复制子n 真核生物:多复制起点，一个genome中有多个复制子。复制起点具有特征性：复制起点具有特征性：细菌、酵母以及叶绿
5、体、线粒体等的细菌、酵母以及叶绿体、线粒体等的DNA复制复制起点已经被克隆，其核酸序列的共同特点是起点已经被克隆，其核酸序列的共同特点是富富含含A-T序列序列。2.2 DNA复制的方向：p 多数DNA双向复制p 单向进行：有些病毒（如腺病毒等）、质粒DNA及线粒体DNA。图：DNA复制的方向性复制起点复制起点复制叉 复制叉（Replication fork）：染色体中参与复制的活性区域，即复制正在发生的位点。复制眼（replication eye）：电子显微镜下观察正在复制的DNA，复制的区域形如一只眼睛。复 制 起 点 复 制 叉 亲 代 链 子 代 链 复 制 叉真核生物DNA分子复制具有
6、多个复制子，多个复制眼2.3 DNA复制的方式复制的方式 双向等速复制：大多数生物体内双向等速复制：大多数生物体内DNA。不等速复制：如枯草杆菌。不等速复制：如枯草杆菌。对称复制：大多数生物体内的对称复制：大多数生物体内的DNA的两条链同的两条链同时复制。时复制。不对称复制：在一定时期内不对称复制：在一定时期内DNA只复制一条链只复制一条链的情况。的情况。如线粒体的如线粒体的D-环复制和噬菌体的滚环复制方式。环复制和噬菌体的滚环复制方式。3 DNA聚合酶聚合酶和和DNA聚合反应聚合反应 DNA的复制是由DNA聚合酶负责完成的，按照模板催化合成新DNA链。Poly(核苷酸)n3-OH dNTP
7、Poly(核苷酸)n+13-OH 2Pi 4 DNA复制的半不连续性复制的半不连续性DNA在复制时如何同时作为模板合成其互补链?冈崎片段的大小：原核生物为1000-2000bp，真核生物100bp。前导链（leading strand）后随链（lagging strand）冈崎片段（Okazaki fragment）复制叉移动的方向半不连续复制半不连续复制:1.DNA聚合酶聚合酶2.DNA连接酶连接酶3.螺旋酶螺旋酶4.单链结合蛋白单链结合蛋白5.DNA拓扑异构酶拓扑异构酶第二组：复制体系 1 DNA聚合酶聚合酶 DNA的复制是由DNA聚合酶负责完成的，按照模板催化合成新DNA链。共同性质:1
8、 以脱氧核苷酸三磷酸(dNTP)为原料;2 需要模板;3 不能起始合成新的DNA链,需要引物;4 合成方向53。DNA聚合酶（DNA polymerase）1 DNA聚合酶聚合酶 1.1 大肠杆菌的大肠杆菌的DNA聚合酶聚合酶 1.2 DNA聚合酶和复制的忠实性聚合酶和复制的忠实性 1.3 其它生物的聚合酶其它生物的聚合酶 1.4 DNA聚合酶的引物聚合酶的引物1.1 大肠杆菌的大肠杆菌的DNA聚合酶聚合酶 DNA聚合酶聚合酶:主要参与损伤主要参与损伤DNA的修复，同的修复，同时在半保留复制中有辅助作用，时在半保留复制中有辅助作用，DNA聚合酶聚合酶II：主要参与：主要参与DNA修复，修复，D
9、NA聚合酶聚合酶III：DNA合成的主要复制酶。合成的主要复制酶。1.1.1 大肠杆菌大肠杆菌DNA聚合酶聚合酶 DNA polymerase，DNApol1956年，年，Arthur Kornberg(1)理化性质：一条多肽链，103KD。含一个Zn2+400个分子/细胞，37催化约1000bp/min,（2）功能特点功能特点 1）5 3聚合功能聚合功能 2）3 5外切活性外切活性 3）5 3外切活性外切活性 4）5 3内切酶活性内切酶活性 5 3 G T A A G T C G C T C A G C 5 3 35外切 核 酸酶水解部位图 11-20 DNA 聚合酶的 35外切酶活性 (仿
10、 D.Freifelder:MOLECULAR BIOLOGY 1983,Fig.8-16)5 3 G T A 3 5 G G A C A A G A G A C G T T C T 5 3 内切酸酶水解部位 图 11-22 DNA 聚合酶的内切酸活性 (仿 D.Freifelder:MOLECULAR BIOLOGY 1983,Fig.8-20)切口移位反应缺口平移标记DNA探针 枯草杆菌蛋白酶处理后，成两个片段，枯草杆菌蛋白酶处理后，成两个片段，大片段大片段68KD，称为，称为Klenow片段。片段。1.1.2 大肠杆菌大肠杆菌DNA聚合酶聚合酶(DNApol)：(1)理化性质：理化性质：
11、120KD，100个酶分子个酶分子/细胞，细胞，活性只有活性只有DNA pol的的5%。（2）功能特点：）功能特点：53聚合活性聚合活性 35外切活性，外切活性，没有没有53外切活性外切活性 不是复制的主要聚合酶不是复制的主要聚合酶,与与DNA损伤损伤修复有关。修复有关。1.1.3 大肠杆菌大肠杆菌DNA聚合酶聚合酶(DNApol)(1)理化性质：理化性质：10-20个酶分子个酶分子/细胞。细胞。活性是活性是DNA pol I的的15倍倍,pol II300倍。倍。聚合反应需要聚合反应需要ATPATP的存在。的存在。反应有很高的速度和高度的进行性。反应有很高的速度和高度的进行性。进行性：聚合酶
12、结合于单链模板不解离的能力进行性：聚合酶结合于单链模板不解离的能力。DNApol 全酶有十种共18个亚基（2）结构组成和功能特点 DNA聚合酶聚合酶含有以下含有以下4个不同的功能组分：个不同的功能组分：1）核心聚合酶）核心聚合酶:由由、三种亚基组成。三种亚基组成。功能：功能：亚基具有亚基具有5-3方向合成方向合成DNA的催化活性。的催化活性。亚基具有亚基具有3-5外切核酸酶的校对功能，外切核酸酶的校对功能，亚基促进亚基促进亚基的作用。亚基的作用。2）二聚体二聚体 亚基以二聚体、环状的形式环绕着亚基以二聚体、环状的形式环绕着DNA并在并在DNA自由滑动，构成一个滑动钳。自由滑动，构成一个滑动钳。
13、功能：滑动钳把全酶束缚在模板功能：滑动钳把全酶束缚在模板DNA上，上，保证高度的进行性。保证高度的进行性。3）复合物复合物 含有含有5种亚基：种亚基：21111。功能功能:复合物是复合物是滑动钳的载体，帮助滑动钳的载体，帮助滑动钳结滑动钳结合到合到DNA上。上。复合物有依赖复合物有依赖DNA的的ATP酶活性。酶活性。二聚体自己并不能组装到二聚体自己并不能组装到DNA上，通过上，通过复合物复合物与与ATP协同作用催化协同作用催化ATP的水解而组装到的水解而组装到DNA上上的。的。4）二聚体二聚体 功能：功能：2 将两个核心酶分子和一个将两个核心酶分子和一个复合复合物连接起来。物连接起来。亚基是一
14、个依赖于亚基是一个依赖于DNA的的ATP酶。酶。表表 E.coli 中的三种中的三种DNA多聚酶多聚酶 DNApolDNApol DNA pol 结构分子量 103 KD120KD850 KD构成 单体单体异多聚体分子数/细胞 40010010-20功能53聚合酶+（新生链合成）35外切酶+53外切酶+1生物学活性核苷酸数min100050约50,0000.0515 1.2 DNA聚合酶和复制的忠实性聚合酶和复制的忠实性 复制过程的忠实性是保证生物体遗传信息复制过程的忠实性是保证生物体遗传信息准确传递的一个必要条件，它取决于碱基准确传递的一个必要条件，它取决于碱基配对的专一性。配对的专一性。D
15、NA聚合酶可以通过以下方式提高互补碱聚合酶可以通过以下方式提高互补碱基选择的专一性。基选择的专一性。1）碱基配对原则维持）碱基配对原则维持DNA复制的准确性：复制的准确性：2）DNA聚合酶本身的校对作用聚合酶本身的校对作用 DNApol的的35外切酶活性外切酶活性可切除错配碱基，可切除错配碱基，使得使得DNA复制错误的机会只有复制错误的机会只有10-8-10-10。3)需要需要RNA引物起始引物起始DNA复制，复制，DNApol只能从只能从引物的引物的3 端延伸端延伸DNA 碱基配对协同性使得最初几个碱基错配率高，碱基配对协同性使得最初几个碱基错配率高，而而RNA引物最终被降解而避免错误。引物
16、最终被降解而避免错误。4）后随链的不连续合成）后随链的不连续合成 因其有利于错配碱基的校正因其有利于错配碱基的校正 1.3 其他生物的聚合酶其他生物的聚合酶 噬菌体也编码噬菌体也编码DNA聚合酶，它们是聚合酶，它们是T4、T5、T7、SPIO1。这些酶都有。这些酶都有5-3合成酶活性和合成酶活性和3-5外切校正活性。外切校正活性。真核生物中发现了真核生物中发现了5种不同的种不同的DNA聚合酶，聚合酶，分别为分别为、。前四个位于细胞核中，而前四个位于细胞核中，而是线粒体酶。是线粒体酶。1.4 DNA聚合酶的引物聚合酶的引物(primer)DNA复制为什么需要引物？复制为什么需要引物？DNA聚合酶
17、只能催化聚合酶只能催化dNTP到已有核酸链到已有核酸链的游离的游离3-OH上，而不能从游离核苷酸起上，而不能从游离核苷酸起始始DNA链的合成。链的合成。DNA聚合酶需要引物来提供聚合酶需要引物来提供3-OH末端，末端，然后在其上加入核苷酸来延伸然后在其上加入核苷酸来延伸DNA链。链。DNA复制需要合成引物复制需要合成引物 通常细胞先在模板上合成一段通常细胞先在模板上合成一段RNA序列，序列，然后通过然后通过DNA聚合酶延伸聚合酶延伸RNA链的链的3-OH。为什么需要一段为什么需要一段RNA序列作为引物来进序列作为引物来进行行DNA复制呢复制呢?这可能尽量减少这可能尽量减少DNA复制起始处的突变
18、复制起始处的突变有关。有关。引物合成引物合成1）大部分生物利用模板上合成一段）大部分生物利用模板上合成一段RNA序列序列作为作为引物；引物；2）环状）环状DNA在内部在内部形成一个缺口形成一个缺口产生引物末端，产生引物末端，如滚环复制如滚环复制3）直接引发合成，）直接引发合成，特殊蛋白质特殊蛋白质把核苷酸直接引入到把核苷酸直接引入到聚合酶的催化位点。如腺病毒。聚合酶的催化位点。如腺病毒。2 DNA连接酶（连接酶（DNA Ligase）1967年，世界上数个实验室几乎同时发现该酶。年，世界上数个实验室几乎同时发现该酶。2.1 基本性质：能将两段基本性质：能将两段DNA拼接起来的酶，催化拼接起来的
19、酶，催化DNA相邻的相邻的5磷酸基团和磷酸基团和3羟基末断之间形成磷酸羟基末断之间形成磷酸二酯键，封闭二酯键，封闭DNA单链缺口。单链缺口。1）EATPEAMPppi（动物细胞和噬菌体）（动物细胞和噬菌体）ENADEAMPNMN（E.coli 等细菌）等细菌）2）E-AMP上的上的AMP转移到转移到DNA的的5-PO4上使其活化上使其活化3）活化的）活化的5-PO4与相邻的与相邻的3-OH作用形成作用形成35 磷酸二酯键，并释放出磷酸二酯键，并释放出AMP。2.2 功能特点：功能特点：3 解旋酶解旋酶(helicase)功能特点：功能特点：解旋酶可以促使解旋酶可以促使DNA在复制叉处打开双链，
20、解在复制叉处打开双链，解开氢键，形成单链。开氢键，形成单链。利用利用ATP水解获得的能量来打断氢键水解获得的能量来打断氢键 二聚体或六聚体形式存在二聚体或六聚体形式存在表11-3 E.coli及噬菌体的解旋酶 解 旋 酶 结 构 功 能DnaB330 K 六聚体结合与 OriC,Ori参与前引发分离双链，水解ATP,提供能量。rep 蛋白66 K 单体ATP 依赖性解旋酶，在X174 滚环复制中推进复制叉PriA(w 蛋白)82 K 单体X174Rf 形成中参与前引发体 35移动取代SSB，识别特异位点。TraY/I多聚体F 因子滚环复制中解链。基因4 蛋白58 KT7 噬菌体复制中延 5 3
21、解链。4 单链结合蛋白（单链结合蛋白（SSBP）功能特点：功能特点：在在E.coli 中以四聚体存在中以四聚体存在 177个个aa组成组成 74KDa SSBP与螺旋酶不一样，不具备酶的活性，不和与螺旋酶不一样，不具备酶的活性，不和ATP结合。结合。SSBP可以重复使用，当新生的可以重复使用，当新生的DNA链合成到某一位置时，链合成到某一位置时，该处的该处的SSBP便会脱落，并被重复利用。便会脱落，并被重复利用。解旋酶 在原核中在原核中SSBP与与DNA结合表现出协同效应结合表现出协同效应:一个一个SSBP四聚体结合于单链四聚体结合于单链DNA上可以促进其他上可以促进其他SSBP结合到相邻的结
22、合到相邻的DNA上。上。5 DNA拓扑异构酶拓扑异构酶(DNA Topoisomerase)DNA复制在复制叉向前移动时造成其前方DNA分子所产生的正超螺旋，必须由拓扑正超螺旋，必须由拓扑异构酶来解决异构酶来解决。5.1功能：功能：在在DNA复制时，复制叉前方复制时，复制叉前方DNA分子部分分子部分产生正超螺旋，拓扑酶可产生正超螺旋，拓扑酶可松驰超螺旋松驰超螺旋，有，有利于复制叉的前进及利于复制叉的前进及DNA的合成。的合成。DNA复制完成后，拓扑酶又可将复制完成后，拓扑酶又可将DNA分子分子引入超螺旋引入超螺旋，使，使DNA缠绕、折叠，压缩以缠绕、折叠，压缩以形成染色质。形成染色质。5.2 类型类型1）拓扑异构酶）拓扑异构酶I(Topo)：作用特点：作用特点：作用于作用于单链单链DNA 不需要不需要ATP和任何等辅助因子和任何等辅助因子。对环状单链、双链对环状单链、双链DNA有打结或解结作用，有打结或解结作用，以及使环状单链以及使环状单链DNA形成环状双链形成环状双链DNA。2）拓扑异构酶拓扑异构酶（Topo）：）：也叫也叫DNA旋转酶旋转酶(DNA gyrase)作用特点：作用特点：作用作用双链双链DNA，需要需要ATP水解为水解为ADP以供能量以供能量。能够环连或解环连，以及打结或解结。能够环连或解环连，以及打结或解结。
